Визначення бактеріального обсіменіння молока за редуктазною пробою.
Суть методу полягає в тому, що в процесі життєдіяльності бактерії виділяють у навколишнє середовище речовини, які мають відновлювальні властивості, у тому числі анаеробні дегідрогенази (редуктази). Фермент редуктаза має здатність знебарвлювати органічні барвники. Чим більше мікроорганізмів – тим більше ферментів редуктази вони продукують і швидше знебарвлюють барвники метиленовий синій або резузарін. Редуктазну пробу використають як непрямий показник бактеріальногообсіменіннясирого молока та вершків. Для редуктазной проби відбирають середню пробу молока після його органолептичної оцінки і сортування.Із середньої проби відбирають пробу для аналізу близько 50 мл.
Рис. 3. Редуктазник
1 – кришка; 2 – камера для розміщення пробірок; 3 – штатив.
Проба на редуктазу з метиленовим синім (блакитним).
У чисту суху пробірку наливають 10 см3 досліджуваного молока, підігрівають до 38-40 ºС, додають 1 см3 свіжовиготовленого робочого розчину метиленового синього, закривають пробірку пробкою, три рази перевертають для перемішування, потім поміщають пробірку у редуктазник (рис. 3) або водяну баню (температура води 38 °С). Для контролю ставлять таку ж пробірку з 10 см3 молока без металевого синього. Вода після занурення пробірок з молоком повинна доходити до рівня молока в них.
Зміну забарвлення молока (знебарвлення метиленового синього) фіксують через 20 хв., 1 год, 2 год, 5 год 30 хв. Закінченням аналізу вважають момент знебарвлення барвника.
|
|
|
В залежності від тривалості і глибини знебарвлення метиленового синього молоко відносять до одного із чотирьох класів (див. додаток А і табл. 7).
Таблиця 7.
| Клас молока | Тривалість знебарвлення метиленового синього | Орієнтовна кількість бактерій в 1 мл молока |
| Вищий | Більше 3 год. 30 хв. | Менше 300 тис. |
| І | 3 год. 30 хв. | Від 300 тис. до 500 тис. |
| ІІ | 2 год.30 хв. | Від 500 тис. до 4 млн. |
| IІІ | 40 хв. | Від 4 млн. до 20 млн. |
Пробу проводять не рідше 1 разу в декаду. Насичений спиртовий розчин метиленового синього готують таким чином: 2,5 г метиленового синього змішують з 25 мл 96 %- ного етилового спирту. Суміш ставлять у термостат при температурі 37 °С на 24 год, а потім фільтрують. Термін зберігання – 3 місяці. Для приготування робочого розчину метиленового синього змішують 1 мл насиченого спиртового розчину метиленового синього з 39 мл дистильованої води. Термін зберігання – 7 днів.
2.2.2. Проба на редуктазу з резазуриномдозволяє з більшою точністю розмежувати молоко на класи. Резазурин має деякі переваги в порівнянні з метиленовим синім. Відновлюється він у дві стадії, процес повного відновлення закінчується при більше високому окислювально-відновному потенціалі, чим у метиленового синього.
|
|
|
Основний розчин резазурину одержують у такий спосіб:0,1 г натрієвої соліпереносять в мірну колбу об’ємом 200 мл і доводять до мітки прокип'яченою і охолодженою до 20 ºС дистильованою водою. Термін зберігання основного розчину при температурі 8—10 °С не більше 30 діб. Робочий розчин резазурину готують із основного розведенням його прокип'яченою і охолодженою дистильованою водою в співвідношенні 1:2,5 (наприклад, до 10 мл основного розчину додають 25 мл води). Термін зберігання робочого розчину 3доби при температурі 0-5 °С.
Для проведення проби в стерильні пробірки наливають по 1 мл робочого розчину резазурина й по 10 мл досліджуваного молока, закривають їх стерильними пробками; рідини змішують повільним трикратним перевертанням пробірок. Пробірки поміщають у редуктазник або водяну баню при температурі 37 °С. Результати враховують через 1 і 1,5 год.
В залежності від тривалості і глибини знебарвлення резазурину молоко відносять до одного із чотирьох класів (див. додаток Б і табл. 8).
Таблиця 8
| Клас молока | Тривалість знебарвлення або зміни кольору | Забарвлення молока | Орієнтовна кількість бактерій в 1 см3 молока |
| вищий | 1,5 год. | Сіро-бузкове до бузкового з слабким сірим відтінком | до300 тис. |
| І | 1 год. | Теж саме | від 300тис. до 500 тис. |
| ІІ | 1 год. | Бузкове з рожевимвідтінком або яскраво-рожеве | від 500 тис. до 4 млн. |
| ІІІ | 1 год. | Блідо-рожеве або бліде | Від 4 млн. до 20 млн. |
2.3. Визначення титру кишкової палички (коли–титр) молока. Коли-титр — це найменша кількість продукту, виражена в грамах або мілілітрах, у якій виявлені цитратнегативні різновиди бактерій групи кишкових паличок (після ідентифікації). У сирому молоці та вершках визначають лише бродильний титр. Бродильний титр - це найменша кількість продукту, виражена в мілілітрах або грамах, у якій виявлені бактерії групи кишкових паличок, тобто грамнегативні палички, що розщеплюють глюкозу на кислоту і газ при температурі 43 °С протягом 24 год. Посів в середовище Кесслера (перша бродильна проба) проводиться у 6 пробірок відповідно до даних, наведениху табл. 9.
|
|
|
Таблиця 9
| Варіант | Наявність кишкової палички в продукті, мл | Вирахований колі-титр | |||||
| 1 | 1 | 1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | ||
| а | - | - | - | - | - | - | > 3,0 |
| б | + | - | - | - | - | - | 3,0 |
| в | + + + | + + + | - + + | - - + | - - - | - - - | 0,3 |
| г | + + + | + + + | + - + | + + + | + + + | - + + | < 0,3 |
Облік результатів першої бродильної проби ведуть наступним чином. Після термостатування при температурі 43 °С протягом 18—24 год пробірки з посівами в середовище Кесслера переглядають і встановлюють бродильний титр молока (вершків), приймаючи (умовно) утворення газу і його скупчення в бродильних пробірках (поплавках) як показник присутності в даних пробірках бактерій групи кишкових паличок (див.додаток В). При відсутності газу у всіх пробірках продукт вважають не забрудненим кишковими паличками. Бродильний титр розраховують за даними табл. 9.
|
|
|
Таким чином, якщо кишкова паличка виявлена в декількох засіяних об’ємах, то за колі-титр приймають найменшу кількість продукту, у посіві якого виявлена кишкова паличка; якщо в жодному із засіяних об’ємів не виявлена кишкова паличка, колі-титр вважається більше суми засіяних об’ємів, а якщо кишкова паличка виявлена у всіх засіяних об’ємах продукту, колі-титр вважається менше найменшого засіяного об’єму продукту. Таким же правилом керуються при визначенні бродильного титру продукту.
При дослідженні пастеризованого молока, вершків та інших продуктів, нормованих по вмісту кишкової палички, потрібно виділяти та ідентифікувати чисті культури кишкових паличок із пробірок з середовищем Кесслера, у яких виявлене газоутворення, якщо продукт має бродильний титр нижче 0,3 або 0,1 (для сухого молока).
Для ідентифікації ентеробактерій роблять посів на середовище Ендо із пробірок, що забродили, із середовищем Кесслера. Чашки з підсушеним середовищем Ендо ділять по дну стіклографом на 4 сектори. З кожної пробірки беруть стерильною бактеріологічною петлею мінімальну кількість посівного матеріалу і висівають його на окремі сектори частими штрихами з таким розрахунком, щоб виросли ізольовані одна від одної колонії. Чашки з посівами поміщають (кришками вниз) у термостат і витримують при температурі 37 °С протягом 18—24 год. Середовище Ендо повинно бути свіжоприготовленим.
На середовищі Ендо бактерії групи кишкових паличок утворять колонії від темно-червоного до рожевого кольору, а патогенні бактерії (збудники кишкових інфекцій) утворять безбарвні колонії. Щоб уникнути почервоніння самого середовища його захищають від світла. Утворення червоних колоній обумовлюється зброджуванням лактози: чим енергичніше зброджується лактоза, тим інтенсивніше забарвлюються колонії в червоний колір.
Обробка результатів
Результати посівів оцінюють візуально за характером утворилися колоній :
- утворення червоних або темно-червоних колоній з металевим блиском на середовищі Ендо свідчить про належність мікроорганізмів, що дали ріст на середовищі Козера, до лактозопозитивних ентеробактерій (БГКП) ;
- утворення напівпрозорих безбарвних або блідо-рожевих колоній свідчить про належність мікроорганізмів, що дали ріст на середовищі Козера, до лактозонегативних ентеробактерій.
При появі на середовищі напівпрозорих безбарвних або блідо-рожевих колоній необхідно проводити контроль на предмет наявності патогенних ентеробактерій (сальмонели, шигели). Контроль проводиться в лабораторіях , ліцензованих на право роботи з патогенними мікроорганізмами.
Чашки з посівами упаковують в стерильний папір і/або контейнери і передають в лабораторії, ліцензовані на право роботи з патогенними мікроорганізмами, для подальшого контролю .
Картина росту тест-культури E.coli на середовищі Ендо представлена в додатку Г.
Після ідентифікації E.coli обчислюють колі-титр досліджуваного пастеризованого молока (вершків) (див. табл. 9).
2.4. Визначення інгібуючих речовин у молоці
До інгібіторів відносять лікарські препарати (антибіотики, сульфаніламіди), формалін, перекис водню, соду, миючі та дезінфікуючі речовини та інші хімічні речовини стороннього походження.
Методи визначення основані на відновленні індикаторів резазуріну або метиленового голубого при розвитку у молоці чутливого до інгібуючих речовин Streptococcus thermophilus.
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 1220; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!