Количественное определение пировиноградной кислоты
ПРИНЦИП РАБОТЫ:
Пировиноградная кислота при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразоном в щелочной среде образуется 2,4-динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты желто-оранжевого цвета, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации пировиноградной кислоты.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) кровь; 2) трихлоруксусная кислота (ТХУ), 100 г/л; 3) 2,4-динитрофенилгидразин, 1 г/л (в 2 н растворе соляной кислоты); 4) NaOH, 120 г/л; 5) стандартные растворы пировиноградной кислоты или пирувата натрия, 40, 80, 120 и 160 мкмоль/л; 6) центрифужные пробирки; 7) пробирки; 8) центрифуга; 9) КФК или ФЭК.
ХОД РАБОТЫ:
0,3 мл крови смешивают в центрифужной пробирке с 0,7 мл дистиллированной воды. К гемолизату приливают 1 мл раствора ТХУ, перемешивают палочкой и через 2-3 мин центрифугируют в течение 15 мин при 1500 об/мин. надосадочную жидкость полностью сливают в пробирку, к ней приливают 0,4 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Содержимое пробирки смешивают и на 20 мин помещают в темное место при комнатной температуре.
По истечении этого срока в пробирку приливают 1 мл раствора NaOH и через 5 мин определяют на КФК оптическую плотность окрашенного продукта. Измерение ведут против дистиллированной воды. Определение оптической плотности производится при синем светофильтре в кювете шириной 5 мм.
Количество пировиноградной кислоты в исследуемой пробе рассчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам пирувата. Из каждой концентрации стандартного раствора берут три пробы по 0,3 мл и обрабатывают так же, как опытные. Средние значения оптических плотностей для каждой концентрации стандартного раствора пирувата используют для построения калибровочного графика.
|
|
|
Содержание пировиноградной кислоты в крови здоровых людей — 45,6-114 мкмоль/л.
Содержание пирувата в крови увеличивается при недостатке в пище тиамина, заболеваниях печени, сахарном диабете, гиперфункции гипофизарно-адреналовой системы, а также при больших физических нагрузках (в 10 раз и более).
РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
Охарактеризуйте процесс гликолиза. Реакции. Энергетика. Ферменты.
Напишите реакции процесса образования пировиноградной кислоты из глюкозы.
Во что превращается пировиноградная кислота в результате окислительного декарбоксилирования?
В каких органах протекает анаэробный процесс распада углеводов?
В чем сходство и различие процессов гликолиза и дрожжевого брожения.
Дата добавления: 2016-01-04; просмотров: 28; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!