Микробиологические методы исследования
Микробиологические исследования объектов окружающей среды проводятся стандартными методами, позволяющими получить достоверные результаты.
Определение количества мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ, ГОСТ 10444.15)
Метод основан на высеве продукта или разведения навески продукта в питательную среду, инкубировании посевов, подсчёте всех выросших видимых колоний.
Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669.
1 см3 материала из исходного разведения (10-1) переносят в пробирку с 9 см3 стерильного раствора для разведения, не прикасаясь к поверхности жидкости в этой пробирке, перемешивают новой стерильной пипеткой и содержимое в количестве 1 см3 переносят в следующую пробирку и т.д. В результате исследуемый продукт оказывается разведенным в 10, 100 и более раз. Степень разведения навески для высева на плотные среды выбирают так, чтобы общее количество колоний, выросших на чашке, колебалось в пределах от 15 до 300. В две чашки Петри параллельно вносят 1 см3 разведенного продукта или смыва, заливают расплавленным и остуженным до 45°С агаром (15-20 см3), размешивают. После застывания агара чашки переворачивают и помещают в термостат при температуре 30°С на 72 ч. При необходимости допускается предварительный учет колоний через 48 ч с последующим подсчетом через 72 ч.
Обработку результатов культивирования проводят согласно ГОСТ Р51446-99. Количество микроорганизмов в 1 г пробы вычисляют как средневзвешенное значение из подсчетов на двух последовательных разведениях по формуле:
|
|
|
(1)
где ΣC - сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 колоний;
V - объем посевного материала, внесенного в каждую чашку, см3;
n1 - количество отобранных для подсчета чашек в первом разведении;
n2 - количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении;
d - коэффициент разбавления, соответствующий первому разведению.
Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. За результат принимают количество микроорганизмов в 1 см3 или в 1 г, выраженное в виде числа от 1.1 до 9.9, умноженного на 10 в соответствующей степени.
Если при посевах оказалось, что во всех разведениях на засеянных чашках менее 30 колоний, в результатах анализа рекомендуется писать: «Рост единичных колоний при посеве (указать количество засеянного продукта)». При отсутствии роста колоний результаты выражают таким образом: «Количество микроорганизмов менее 1». Если на чашках более чем на половине их площади имеется рост спорообразующих микроорганизмов или за счет споровых микроорганизмов подсчет изолированных колоний невозможен, в результате анализа следует написать: «Рост спорообразующих микроорганизмов». Результаты выражают в колониеобразующих единицах - КОЕ (г, см3, см2).
|
|
|
Выделение и определение количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) (ГОСТ 30518-97)
Метод основан на высеве определенного количества продукта и (или) разведения навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок, пересеве, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.
Основой этого метода является способность БГКП сбраживать в среде Кесслер лактозу с образованием кислоты и газа. В этой группе определяется 5 родов энтеробактерий: E.coli, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia.
Для определения БГКП из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведении по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить в 1 г (см3) продукта предполагаемое количество колиформных бактерий или их количество, указанное в нормативно-технической документации на конкретный продукт.
|
|
|
При определении БГКП в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред (например в Кесслер). Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:9. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч. При положительной реакции (изменение цвета среды, помутнение, газ) делают пересев на плотную дифференциальную среду Эндо. Чашки с посевами инкубируют дном вверх при температуре (36±1)°С в течение 24 ч.
На среде Эндо колиформные бактерии образуют колонии бледно-розового или красного цвета, часто с металлическим блеском.
При необходимости подтверждения принадлежности выросших микроорганизмов к колиформным бактериям из чашек Петри с посевами отбирают не менее, чем по пять колоний. Из каждой отобранной колонии готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.
У грамотрицательных культур определяют возможность ферментации углеводов с образованием кислоты. Для этого суточные культуры пересевают в среды: Гисса, трехсахарный агар, посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч.
|
|
|
К колиформным бактериям относят аэробные и факультативно-анаэробные, не образующие спор грамотрицательные палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа.
Методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus (ГОСТ 10444.2-94)
Метод выявления и определения S. aureus посевом с предварительным обогащением основан на высеве навески продукта и (или) разведения навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных характерных колоний к S. aureus.
Для выявления S. aureus навеску продукта или его разведение вносят в солевой бульон. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 48ч.
Для подтверждения роста микроорганизмов в жидких средах из них после инкубирования делают пересев петлей на поверхность селективно-диагностических сред. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч.
После инкубирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.
На молочно-солевом агаре колонии S. aureus круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными краями, диаметром 2-2,5 мм, окрашены в желтый золотистый, лимонно-желтый, кремовый, палевый или белый цвет.
На желточно-солевом агаре колонии окружены зоной лецитиназной активности.
Для подтверждения принадлежности характерных колоний к S.aureus отбирают не менее 5 колоний и пересевают на поверхность скошенного рыбопептонного агара, посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24 ч.
У выросших микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму, способность коагулировать плазму крови кролика, образовывать каталазу и ферментировать мальтозу в анаэробных условиях.
Если при испытании характерных колоний в них обнаружены грамположительные кокки диаметром 0,6-1 мкм располагающиеся чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда, способные коагулировать плазму крови, образующие каталазу и ферментирующие мальтозу в анаэробных условиях, то считают, что выявленные микроорганизмы относятся к S.aureus.
Определение бактерий рода Salmonella (ГОСТ 30519-97)
Метод основан на способности бактерий рода Salmonella на дифференциально-диагностических средах образовывать специфические колонии и давать реакцию агглютинации с сальмонеллезными сыворотками.
К бактериям р. Salmonella относятся грамотрицательные палочки с закругленными концами, длина варьирует от 1 до 3 мк, ширина - 0,5-0,6 мк; факультативно-анаэробные, подвижные, оптимальная температура роста 37°С, реакция слабощелочная (рН 7,2-7,4).
Навеску продукта, в массе (объеме) которой нормативно-технической документацией на анализируемый продукт предусматривается отсутствие бактерий рода сальмонелл (25 грамм), высевают в забуференную пептонную воду. Соотношение массы (объема) продукта и забуференной пептонной воды 1:9 (неселективное предварительное обогащение).
Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 18-24 ч. Культуры, полученные после инкубирования, пересевают в две среды для селективного обогащения. Для этого по 10 см3 культуры переносят в 100 см3 магниевой и в 100 см3 тетратионатной среды или по 10 см3 в 100 см3 селенитовой среды и в 100 см3 тетратионатной среды. Посевы инкубируют в течение 24-48 ч на магниевой и селенитовой средах при температуре (36±1)°С, а на тетратионатной среде при (43±1)°С.
Культуры после инкубирования пересевают (по ГОСТ 26670) на три агаризированные среды: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева и среду Эндо (или среду Левина).
Допускается использование одной чашки каждой из сред для одновременного высева с двух селективных сред.
Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч. После 24 ч инкубирования посевов проводят предварительный учет результатов, а после 48 ч - окончательный. Отмечают на дифференциально-диагностических средах рост колоний, характерных для бактерий рода сальмонелла:
- на висмут-сульфит агаре колонии черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колониями;
- на среде Плоскирева колонии бесцветные, прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо;
- на среде Эндо колонии круглые, бесцветные или слегка розоватые, прозрачные;
- на среде Левина колонии прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые.
При отсутствии в посевах на дифференциально-диагностических средах характерных для бактерий рода Salmonella колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске продукта.
При наличии хотя бы на одной дифференциально-диагностической среде характерных для бактерий рода Salmonella колонии проводят их дальнейшее изучение.
Не менее трех колоний с каждой дифференциально-диагностической среды пересевают на скошенную поверхность рыбо-пептонного агара, и часть колоний пересевают штрихом на поверхность и уколом в столбик трехсахарного агара.
Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24 ч.
Из отобранных для биохимического подтверждения колоний готовят мазки и окрашивают по Граму (по ГОСТ 10444-3).
Бактерии рода Salmonella являются грамотрицательными палочками с закругленными концами.
После инкубирования посевов проводят учет результатов ферментации лактозы, глюкозы и сахарозы на трехсахарном агаре (биохимическое подтверждение):
- пожелтение скошенной части среды указывает на ферментацию лактозы или сахарозы или обоих сахаров;
- пожелтение столбика среды с разрывом агара или пузырьками газа указывает на ферментацию глюкозы с образованием газа;
- пожелтение столбика среды без разрывов или пузырьков газа указывает на ферментацию глюкозы без образования газа;
- почернение среды в столбике указывает на образование сероводорода.
Типичными для бактерии рода Salmonella являются культуры, ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, образующие сероводород.
Дальнейшему изучению подвергаются также лактозоположительные бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа.
У культур, отобранных и пересеянных на поверхность рыбо-пептонного агара изучают возможность расщепления мочевины, образования ацетоина и индола, ферментации сахарозы и маннита, и подвижность.
Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину, не образуют ацетоин, индол, не сбраживают сахарозу и манит, большинство штаммов бактерий рода Salmonella подвижны. После биохимического подтверждения проводят серологическое подтверждение принадлежности культур к бактериям рода Salmonella.
Дата добавления: 2018-05-02; просмотров: 670; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!