И креатинфосфата в мышце
ПРИНЦИП РАБОТЫ:
В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения – АТФ и креатинфосфат, которые обеспечивают по мере надобности мышцу энергией. Метод основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, богатые энергией, как и фосфорный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде – так называемый лабильно связанный фосфор. Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на макроэргические соединения мышечной ткани. Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) мышечная ткань животного; 2) ТХУ, 2,5 %; 3) HCl, 1 М; 4) NaOH, 1 М; 5) молибдат аммония, 1 %; 6) аскорбиновая кислота, 1 %; 7) пробирки, пипетки; 8) ФЭК.
ХОД РАБОТЫ:
Мышцу (0,5 г) гомогенизируют во льду в 5 мл охлажденной 2,5 % ТХУ. Фильтруют в мерную пробирку. Осадок на фильтре промывают 5 мл холодной дистиллированной воды. Объем доводят до 10 мл.
Таблица 32
Схема определения
| Реагенты | Количество реагента, мл | |
| Опыт | Контроль | |
| Безбелковый фильтрат | 0,5 | 0,5 |
| HCl | 1,0 | 1,0 |
| Кипятить 10 мин (гидролиз фосфорных связей), охладить | Не кипятить | |
| NaOH | 1,0 | 1,0 |
| H2O | 7,5 | 7,5 |
| Перенести по 5 мл жидкости в другие пробирки | ||
| Молибдат аммония | 0,5 | 0,5 |
| Аскорбиновая кислота | 0,5 | 0,5 |
| Н2О | 2,0 | 2,0 |
| Смесь в пробирках перемешать, экспозиция 10 мин при комнатной температуре | ||
| Колориметрировать на ФЭКе против воды при 670 нм |
|
|
|
В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфор представляет собой сумму лабильно связанного фосфора и фосфатных солей, присутствующих в тканях, в контрольной пробе – только фосфатные соли.
Вычитают из оптической плотности, найденной для опытной пробы, оптическую плотность, полученную для контрольной пробы. Концентрацию лабильно связанного неорганического фосфора в пробе находят по калибровочному графику.
Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора, учитывая разведение:
Х=А х 3,3 х 400 х 1000,
где Х - содержание макроэргических соединений в пересчете на 1 мг АТФ в 1 кг сырой ткани; А – содержание АТФ в пробе, мг; 3,3 х 400 – коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов.
РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОДЫ:
Дата добавления: 2016-01-04; просмотров: 53; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!