ПРОИЗВОДСТВО НЕЗАМЕНИМЫХ АМИНОКИСЛОТ

 

Получение кормовых белковых концентратов с повышенным содержанием незаменимых аминокислот позволяет балансиро­вать корма сельскохозяйственных животных главным образом

283

по уровню белка, тогда как оптимальный аминокислотный со­став кормового белка при таком способе балансирования пол­ностью не достигается. Для доведения концентрации аминокис­лот в кормовом рационе до оптимума требуется добавление препаратов чистых аминокислот, полученных промышленным способом. В мире ежегодно производится не менее 300 тыс. т кормовых препаратов незаменимых аминокислот. Расширяется их производство и в нашей стране.

Возможны три способа промышленного получения незаме­нимых аминокислот: гидролиз белков растительного и микроб­ного происхождения, микробиологический и химический синтез. Более 60% всех производимых промышленностью чистых пре­паратов аминокислот получают путем микробиологического синтеза. На втором месте по объему производства находится химический синтез. Основным недостатком химического синтеза является получение смеси аминокислот, состоящей из изомеров, относящихся как к D-, так и к L-ряду, тогда как биологической активностью в организме человека и животных обладают лишь L-изомеры. D-изомеры аминокислот не перерабатываются их ферментными системами, а некоторые из них токсичны для че­ловека и животных. Исключением в этом отношении является аминокислота метионин, у которой биологически активными яв­ляются как D-, так и L-изомеры, в связи с чем данная амино­кислота производится преимущественно путем химического синтеза. Технологии получения аминокислот за счет гидролиза белков экономически менее выгодны, поэтому, не получили ши­рокого распространения.

При микробиологическом синтезе образуются L-аминокис-лоты, являющиеся продуктами жизнедеятельности специально подобранных и отселектированных штаммов микроорганизмов, которые способны накапливать в культуральной жидкости не менее 60 г/л синтезируемой аминокислоты. Чаще всего для микробиологического синтеза аминокислот используют ауксо-трофные мутантные штаммы, которые получают методами обычной селекции и генной инженерии. С помощью мутагенных факторов у таких ауксотрофных штаммов индуцируется мута­ция, в результате которой прекращается или ингибируется син­тез одного из продуктов, оказывающих регуляторное воздейст­вие на ферментные системы, катализирующие образование данной аминокислоты, в результате чего концентрация этой аминокислоты в клетках мутанта и в культуральной жидкости повышается.

284

На основе культивирования микроорганизмов с целью по­лучения чистых препаратов аминокислот применяют промыш­ленные технологии, включающие одно- и двухступенчатый син­тез аминокислот. При одноступенчатом синтезе в промышлен­ных культиваторах выращивают ауксотрофные регуляторные мутанты, являющиеся сверхпродуцентами тех или иных ами­нокислот. После завершения рабочего цикла их выращивания культуральную жидкость отделяют от клеток микроорганиз­мов, сгущают и получают из нее товарный продукт с высокой концентрацией синтезированной микробами аминокислоты. В процессе двухступенчатого синтеза аминокислоты вначале по­лучают ее предшественник (часто наиболее дешевым химиче­ским синтезом), а затем с помощью ферментов, вырабатывае­мых микроорганизмами, превращают предшественника в ами­нокислоту, при этом образуются только L-изомеры. В качестве источника фермента могут быть использованы либо суспензия клеток микроорганизмов, либо полученный после разрушения этих клеток ферментный раствор.

Микробиологический синтез лизина. Белки зерна пшени­цы, ячменя, кукурузы и других злаковых культур не сбаланси­рованы по содержанию незаменимых аминокислот и прежде всего лизина. Поэтому для удовлетворения потребностей жи­вотноводства в лизине в нашей стране, Японии, США, Фран­ции, Испании, Югославии и ряде других стран организовано его крупнотоннажное производство. В основу производства по­ложены технологии с использованием одноступенчатого микро­биологического синтеза, которые включают промышленное культивирование ауксотрофных мутантов бактерий из рода Corynebacterium , способных к сверхсинтезу этой аминокисло­ты. Обычно у диких штаммов, из которых получены ауксо­трофные мутанты, сверхсинтеза лизина не наблюдается, так как у них действуют механизмы саморегуляции. В клетках бактерий аминокислота лизин синтезируется из аспарагино-вой кислоты через ряд промежуточных этапов, связанных с об­разованием полуальдегида аспарагиновой кислоты, дигидро-пиколиновой кислоты и α,ε-диаминопимелиновой кислоты, яв­ляющейся непосредственным предшественником лизина. Полуальдегид аспарагиновой кислоты является также одним из предшественников в синтезе аминокислот — треонина, метионина и изолейцина (схема 1).

Процесс синтеза аминокислот(лизина, треонина, метионина и изолейцина) начинается фосфорилированием аспарагиновой кислоты с участием аллостерического фермента аспартаткина-

 

285

 

зы, активность которого ингибируется совместным действием двух аминокислот — лизина и треонина, если они накапливают­ся в клетках бактерий в избыточной концентрации. Если пони­зить концентрацию одной из этих аминокислот, то синтез дру­гой будет осуществляться даже при условии, когда она накап­ливается в довольно высокой концентрации.

Для снятия регуляции синтеза лизина необходимо прекра­тить образование треонина на стадии превращения полуальде­гида аспарагиновой кислоты в гомосерин, катализируемое фер­ментом гомосериндегидрогеназой. Последнее достигается по­средством мутагенеза. Опыты показывают, что мутантные клетки, не образующие гомосериндегидрогеназы, при их куль­тивировании на искусственной питательной среде обеспечивают высокий выход лизина. Дефицитные аминокислоты, которые не синтезируются мутантными клетками (гомосерин, треонин, ме-тионин), вводятся в состав питательной среды в таком количе­стве, чтобы они не были регуляторами синтеза лизина.

В процессе приготовления питательной среды для культи­вирования производственных штаммов ауксотрофных мутан­тов, обладающих способностью к сверхсинтезу аминокислоты лизина, в качестве источника углерода обычно используют смеси, включающие уксусную кислоту и свекловичную мелас-

286

су, в качестве источника азота — соли аммония, мочевину, ку­курузный экстракт, гидролизаты дрожжей. Кроме дефицитных аминокислот, которые не синтезируются клетками мутантов, в питательную среду также добавляют необходимые для жизне­деятельности микроорганизмов макро- и микроэлементы (Р, Mg, Fe, Са, Мn и др.) и витамины (В, биотин и др.). В процес­се культивирования микроорганизмов обеспечивается подача стерильного воздуха с помощью специальных турбинных ме­шалок, для предотвращения вспенивания субстрата и клеточ­ной суспензии в среду культивирования добавляют пеногаситель. Схема технологической линии по производству лизина показана на рис. 5.4.

Посевной материал, предназначенный для производственной ферментации, вначале выращивают в посевных аппаратах при 28—32° С, рН 7—7,2 в течение 18—24 ч, а затем полученная та­ким путем суспензия клеток подается в производственные фер­ментеры емкостью 50—100 м\ в которых поддерживается посто­янный режим аэрации, необходимое давление, контроль за все­ми компонентами и параметрами среды. Время ферментации 55—72 ч. Накопление в культуральной жидкости лизина начина­ется после 25—30 ч выращивания промышленной культуры и к концу ферментации достигает 40—50 г/л. Культуральную жид­кость отделяют от культуры клеток продуцента фильтрованием и используют для получения препаратов лизина.

На основе промышленной культуры синтезирующих лизин бактерий организовано производство нескольких видов товар­ной продукции: жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кор­мовой концентрат лизина (ККЛ), высококонцентрированные кормовые и высокоочищенные кристаллические препараты для пищевой и медицинской промышленности.

Жидкий концентрат лизина получают упариванием культу­ральной жидкости на вакуумной установке до концентрации сухого вещества 40%. Для предотвращения деградации лизина в процессе нагревания в культуральную жидкость добавляют бисульфит натрия и соляную кислоту до рН 4,5—5,0, в резуль­тате чего образуется соль — монохлоргидрат лизина.

Для получения сухого кормового концентрата лизина ЖКЛ сушат горячим воздухом на распылительной сушилке при 90° С до влажности препарата 4—8%. Высушенный таким образом препарат содержит 15—20% монохлоргидрата лизина, 15—17% белков, 14% других аминокислот, витамины группы В, минеральные вещества. В целях снижения гигроскопичности препарата в него добавляют наполнители: мясокостную муку, негашеную известь, бентонит, пшеничные отруби. Чаще всего в

287

 

качестве наполнителя используют отруби, которые добавляют в ЖКЛ после упаривания. Полученную в результате тщательно­го перемешивания пасту высушивают на вальцово-ленточной сушилке и гранулируют. Гранулированный препарат ККЛ не­гигроскопичен, содержит 7—10% лизина.

288

Для получения очищенного высококонцентрированного пре­парата лизина культуральную жидкость после фильтрования подкисляют соляной кислотой до рН 1,6—2,0. Образовавшийся в результате взаимодействия с соляной кислотой раствор моно-хлоргидрата лизина направляют на колонки с катионитом, где происходит сорбция аминокислоты и отделение ее от.культу-ральной жидкости. Затем проводят десорбцию аминокислоты путем элюирования 0,5—5%-ным раствором аммиака. Элюат упаривают под вакуумом при 60° С до концентрации сухого ве­щества 30—50%, после чего подкисленный соляной кислотой раствор монохлоргидрата высушивают и используют как кор­мовой концентрат. Путем перекристаллизации полученной соли можно получить препараты лизина с содержанием монохлор­гидрата 97—98%.

В процессе производства лизина кроме основного продукта применение находят также побочные продукты и отходы. Так, после отделения культуральной жидкости в осадке остаются клетки бактерий — продуцентов, фосфаты и другие компоненты питательной среды, которые после высушивания могут быть ис­пользованы в качестве кормовой белковой добавки. Технологи­ческие стоки и промывные воды после выделения монохлоргид­рата лизина, содержащие в растворенном состоянии аминокис­лоты, другие ценные компоненты культуральной жидкости, остаточный лизин, объединяют и полученную смесь упаривают, а затем высушивают с наполнителем до влажности 10%, в ре­зультате получают кормовой препарат с высоким содержанием белков (до 40%) и незаменимых аминокислот.

В ряде стран (Япония, США) для получения лизина приме­няется химико-энзиматический метод, позволяющий создать вы­сокоэффективные технологии, сочетающие достоинства химиче­ского и микробиологического синтеза. Эти технологии основаны на ферментативной конверсии в лизин а-амино-е-капролакта-ма, который получают путем химических реакций из циклогек-сана:

 

В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь D- и L-капролактама. Эта смесь направляется в реактор с ферментом гидролазой а-амино-е-капролактама, который ка­тализирует превращение L-капролактама в L-лизин. D-изомер капролактама далее превращается в L-изомер с помощью спе­цифической рацемазы. При такой технологии получения лизина его содержание в реакционной смеси по завершении рабочего цикла достигает свыше 150 г/л.

Продуцентами гидролазы а-амино-е-капролактама служат некоторые штаммы дрожжей из родов Cryptococcus , Candida , Trichosporon . Дрожжи выращиваются в щелочной среде на оп­тимизированной для синтеза фермента питательной среде, со­держащей активаторы — Mn²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺. Для ферментатив­ной реакции превращения капролактама в лизин может ис­пользоваться клеточная суспензия дрожжевых клеток с активным ферментом, клеточный экстракт (после разрушения и отделения клеток) или очищенный фермент. Рацемазу, катали­зирующую превращение D-капролактама в L-изомер, получают из бактерий Achromobacter , Flavobacteriumи др.

Процессы изомеризации D-капролактама в L-изомер и пре­вращение L-капролактама в лизин можно проводить одновре­менно. Для этого в водный раствор D, L-капролактама вводит­ся необходимое количество дрожжевых и бактериальных кле­ток, задаются оптимальные режимы температуры, рН, аэрации. На выходе из реактора образуется преимущественно один продукт — L-лизин, который выделяют из смеси и далее очищают и сушат.

Кроме изложенной выше технологии получения,чистых пре­паратов лизина разрабатываются и другие, сочетающие в себе использование химического синтеза для получения предшест­венников лизина и энзиматическое превращение их в лизин на конечной стадии производства, что позволяет значительно ин­тенсифицировать производственный процесс и снизить себе­стоимость продукции.

Микробиологический синтез триптофана. Наряду с лизином разработаны промышленные технологии получения кормовых и высокоочищенных препаратов другой незаменимой аминокисло­ты— триптофана. Для производства этой аминокислоты при­меняют как одноступенчатый синтез с помощью бактериальных ауксотрофных мутантов с нарушенной регуляцией синтеза ами­нокислот, так и двухступенчатый синтез, включающий вначале получение предшественника триптофана, а затем его фермен­тативное превращение в конечный продукт — триптофан.

 

290

У бактерий и многих других организмов аминокислота триптофан образуется из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпиро-виноградной кислоты через ряд последовательных реакций, включающих образование шикимовой и хоризмовой кислот, а непосредственным предшественником триптофана в процессе его синтеза является антраниловая кислота (схема 2).

Синтез триптофана аллостерически ингибируется конечны­ми продуктами, которые действуют на ферменты, катализирую­щие начальные этапы превращений, связанные с образованием хоризмовой кислоты. Из схемы 2 видно, что для смещения ме­таболических реакций по пути преимущественного образования триптофана необходимо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую. Это достигается действием мутагенных факторов. У мутантов с пониженной активностью ферментов, катализирующих превращение хоризмовой кислоты в префено­вую, наблюдается повышенный синтез аминокислоты трипто­фана, однако для нормального развития этих мутантов в пита­тельную среду необходимо добавлять дефицитные аминокисло­ты — фенилаланин и тирозин—в количествах, не вызывающих регуляторное ингибирование ферментов синтеза триптофана.

Для промышленного колучения триптофана разработаны технологии на основе использования ауксотрофных мутантов

 

бактерии Bacillussibtilisс нарушенным синтезом фенилалани-на и тирозина. Все технологические процессы организованы примерно по такой же схеме, как и получение лизина с помо­щью мутантов коринебактерий. Ферментация длится 48 ч при 37° С, концентрация триптофана в культуральной жидкости достигает 10 г/л. После отделения культуральной жидкости от клеток бактерий она упаривается и высушивается при 110—120° С. Высушенный продукт называют кормовым концен­тратом триптофана (ККТ).

При получении высококонцентрированных препаратов трип­тофана культуральную жидкость подвергают дополнительной очистке. Вначале ее подкисляют соляной кислотой до рН 1,0 и затем центрифугированием отделяют образовавшийся осадок. Далее центрифугат, содержащий триптофан, пропускают через ионо-обменные колонки с катионитом, в результате происходит связывание аминокислоты и, таким образом, отделение ее от культуральной жидкости. После промывки колонок производят десорбцию триптофана 5%-ным раствором аммиака в смеси изопропанола и воды. Элюат направляют на вакуумный выпа-риватель, после чего кристаллизуют аминокислоту при 4—8° С. Выделенную в кристаллическом виде соль триптофана промыва­ют этанолом и высушивают под вакуумом при 60 С. Высушен­ный кристаллический препарат содержит не менее 99% трипто­фана в виде его хлорида. Осадок после отделения культураль­ной жидкости, содержащий клетки культуры бактерий, также высушивают и используют как высокобелковую кормовую до­бавку, содержащую, кроме того, повышенное количество трипто­фана.

Синтез триптофана в нашей стране производится преиму­щественно по двухступенчатой схеме. Вначале методом химиче­ского синтеза получают предшественник триптофана — антраниловую кислоту, которую затем с участием ферментов мик­робного происхождения превращают в триптофан. Биохимическое превращение антраниловой кислоты в трипто­фан проходит в три этапа:

 

На первом этапе из антраниловой кислоты с участием фосфорибозилпирофосфата (ФРПФ) образуется аминогликозид— N-(5'-фосфорибозил) антраниловая кислота, которая в ре­зультате внутримолекулярной перегруппировки и декарбоксили-рования превращается в индол-3-глицерофосфат. На последнем этапе под действием фермента триптофансинтетазы из индол-3-глицерофосфата и аминокислоты серина образуется трип­тофан. В связи с тем, что в качестве активной группы у фермен­та триптофансинтетазы служит пиридоксальфосфат, от наличия в среде этого кофермента зависит скорость превращения антра­ниловой кислоты в триптофан. В качестве источника ферментов для указанных реакций используются дрожжи С. utilis .

Производственный процесс биохимического превращения антраниловой кислоты в триптофан проводится в две стадии. На первой стадии производится наращивание биомассы дрож­жей, являющихся продуцентами ферментов. Питательная среда для выращивания дрожжей готовится из свекловичной мелас­сы, мочевины и минеральных солей. Ферментация продолжает­ся в течение 24 ч при 30° С. Далее в ферментер начинают вво­дить спиртовой 5%-ный раствор антраниловой кислоты и 50%-ный раствор мочевины. Через 3—4 ч после добавления ан­траниловой кислоты в ферментер дополнительно подается угле­родный субстрат —меласса в виде 25%-ного раствора. На по­следующих этапах ферментации периодически производится подача антраниловой кислоты и мочевины через каждые 6 ч и раствора мелассы — через каждые 12 ч. Длительность фермен­тации около 120 ч, а с учетом времени наращивания биомассы дрожжей— 144 ч. Содержание триптофана в культуральной среде составляет 0,3—0,5% или примерно 6 г/л. После упари­вания и сушки получают кормовой концентрат триптофана (ККТ), содержащий 90% сухого вещества, 48—54% белков, 1—3% триптофана, 1,5—1,9 мг% витамина В₁, 2,5—3,3 мг% витамина В₂, 62—68 мг% витамина PP.

Для получения высококонцентрированных препаратов трип­тофан выделяют из культуральной жидкости и очищают по ме­тодике, указанной выше (см. с. 289).

 

 

---

Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 306; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!