КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ

 

Число потомков от одной особи, как правило, у высших жи­вотных бывает небольшим, а специфический комплекс генов, оп­ределяющий высокую продуктивность, возникает редко и в по­следующих поколениях претерпевает значительные изменения.

Вместе с тем известно, что ядро соматической клетки обла­дает полной генетической информацией о данном организме, и если создать условия для реализации этой информации, то можно получить практически неограниченное число генетиче­ских копий (клонов) определенной особи. Однако, поскольку яд­ра большинства соматических клеток находятся в дифференци­рованном состоянии, то эту задачу на данном этапе решают, используя эмбриональные клетки на определенной стадии раз­вития зародыша, когда еще не произошла их дифференциация. Пересадка ядер (бластомеров) в зрелые ооциты дает такую возможность, потому что цитоплазма ооцитов содержит специ­фические факторы, способные репрограммировать пересажен­ное ядро и запускать программу развития нового эмбриона.

Получение однояйцевых близнецов. Получение однояйце­вых близнецов имеет большое значение для животноводства. С одной стороны, увеличивается выход телят от одного донора, а с другой — появляются генетчески идентичные двойни. Получе­ние идентичных двоен в большом количестве могло бы облег­чить оценку быков по качеству потомства, уменьшить стои­мость спермопродукции, ускорить и удешевить тестирование препаратов и упростить исследования в области кормления животных.

Возможность микрохирургического разделения эмбрионов млекопитающих на ранних стадиях развития на две и более части, чтобы каждая в последующем развивалась в отдельный организм, была высказана несколько десятилетий назад. Пер­вое потомство однояйцевых мышей было получено из механиче­ски изолированных бластомеров двухклеточных эмбрионов в 1970 г. Используя ту же технику разделения, но с применением метода заключения в агар СМ. Вилладсен (1979) описал полу­чение однояйцевых двоен у овец разделением 2-клеточных эм­брионов. Он использовал при этом метод заключения в агар эмбриона с поврежденной зоной пеллюцидои и лигатированныи

 

237

яцевод для временного культивирования половинок эмбриона до стадии поздней морулы и бластоцисты. Выживаемость поло­винок эмбриона на этой стадии развития после пересадки ре­ципиентам составила около 50%. Уменьшение выживаемости половинок по сравнению с пересадкой нормальных эмбрионов у овец может вызвать механическое повреждение эмбрионов во время удаления агара перед трансплантацией постоянному ре­ципиенту. Однако эти эксперименты дали основание автору за­ключить, что единичные бластомеры из 2-клеточного эмбриона имеют потенциальные возможности к развитию и получению нормального потомства.

У овец 2-клеточные эмбрионы можно получить только в те­чение очень короткого периода времени. Лишь единичные дро­бящиеся эмбрионы извлекают у овец раньше чем за 48 ч после начала охоты, а через 60 ч после начала охоты большинство эмбрионов находятся на 4-клеточной стадии развития. Ввиду значительных колебаний интервалов времени между инъекцией СЖК и началом охоты, началом охоты и началом овуляции, между первой и последующей овуляциями почти невозможно добиться того, чтобы хирургическое извлечение эмбрионов у оп­ределенной овцы проводилось в тот момент, когда все эмбрио­ны находятся на 2-клеточной стадии. Последующие экспери­менты показали, что одинаковые двойни могут быть также по­лучены из 4- и 8-клеточных эмбрионов разделением бластомеров на две группы (СМ. Вилладсен, 1980). Половинки из 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов так же жизнеспособны, как и нормальные эмбрионы овец. Их можно хранить в заморожен­ном состоянии, что позволило применить их в эксперименте для получения монозиготных двоен разного возраста.

Выживаемость четвертей эмбрионов клетки или 8-клеточных эмбрионов на четыре пары клеток ниже, чем нормальных. Не­смотря на это, получили одну группу монозиготных четвертных и несколько пар монозиготных двоен. Выживаемость эмбрио­нов, полученных из отдельных бластомеров 8-клеточных эм­брионов, почти нулевая. Понижение выживаемости, по-видимо­му, связано с уменьшением числа клеток у таких эмбрионов во время бластуляции, что способствует формированию трофоэк-тодермальных пузырьков в большей степени, чем нормальной бластоцисты.

Установлено, что бластоцисты, полученные из половинок эм­брионов, состоят из 32 клеток, т. е. составляют лишь 50% нор­мального числа клеток. Отдельные бластомеры из 4-клеточного эмбриона также способны развиться в бластоцисту. Однако бластоциста из такой четверти состоит из 16 клеток и меньше.

 

238

Четверть эмбриона, полученная из пары бластомеров 8-клеточного эмбриона, развивается в бластоцисту, не отличающуюся от той, которая образуется из одного бластомера 4-клеточного эмбриона. Обе категории четвертей эмбрионов имеют понижен­ную выживаемость, и только около 50% из пересаженных раз­виваются до приплода.

На 8-клеточной стадии каждый бластомер имеет потенци­альную возможность развиваться в бластоцисту, но очень ма­ленького размера, примерно из восьми клеток. При пересадке таких бластоцист менее 10% из них развиваются до стадии ро­ждения.

На основе этих исследований можно предположить, что рез­кое уменьшение числа клеток эмбриона является основным фактором, понижающим способность этих эмбрионов разви­ваться в жизнеспособные бластоцисты, хотя стадия развития, на которой происходит разделение, имеет малое значение.

После того как для эмбрионов большинства животных за­канчивается компактизация морулы, защита со стороны зоны пеллюциды становится несущественной. Поэтому последующие разработки по получению монозиготных двоен были направле­ны на использование поздних морул и бластоцист.

В настоящее время применяют простую технику разделения эмбрионов на различной стадии развития (от поздней морулы до вылупившейся бластоцисты) на две равные части одновре­менно с разрезом зоны пеллюциды. При этом не выявлена су­щественная роль присутствия зоны пеллюциды для эффектив­ности развития разделенных бластоцист.

Использование эмбрионов на более поздних стадиях разви­тия у крупного рогатого скота для получения однояйцевых близнецов облегчается тем, что их извлекают нехирургическим способом.

При пересадке эмбрионов от доноров с положительной ре­акцией на вирус лейкоза крупного рогатого скота (БЛВ) полу­чают телят с отрицательной реакцией.

Простая техника разделения разработана и для 6-дневных эмбрионов свиней. При этом стеклянной иглой разрезают внут­реннюю клеточную массу эмбриона и примерно 40% зоны пел­люциды. Затем разрезают слой трофоэктодермы внутри зоны пеллюциды. Одну половинку эмбриона в собственной зоне пел­люциды, а другую без зоны пеллюциды пересаживают в рог матки 6-дневного реципиента на расстоянии 5 см от маточ-но-трубного соединения.

Техника разделения на половинки эмбрионов успешно при­меняется на овцах и на козах.

239

Деление на стадии поздней бластоцисты считается более удобным, так как блестящая оболочка тоньше и цитоплазма эластичнее, чем у ранней бластоцисты.

Совершенствование способов получения монозиготных близ­нецов проходило по пути их упрощения. Если в ранних экспе­риментах для удаления зоны пеллюциды, разделения и обрат­ной пересадки оперированных эмбрионов требовалось четыре и даже шесть инструментов, то в дальнейшем те же задачи ус­пешно решали с помощью трех — удерживающей пипетки, микроскальпеля и инъекционной пипетки, двух — удерживаю­щей пипетки и стеклянной микроиглы и даже одного инстру­мента — стеклянной микроиглы или микроскальпеля.

Упрощение техники разделения эмбрионов обусловлено в основном двумя причинами: 1) отказом от техники заключения в агар и использования временных реципиентов; 2) исключени­ем этапов по извлечению из блестящей оболочки и ретранс-плантации в нее оперированных эмбрионов.

В качестве исходного материала для получения однояйце­вых близнецов в последнее время используют 5,5—8-дневные эмбрионы на стадии ранней морулы-бластоцисты.

При разработке оптимальных условий получения монозигот­ных близнецов большое внимание уделялось продолжительно­сти культивирования invitro после разделения и транспланта­ции половинок эмбрионов, а также их хранению в заморожен­ном состоянии. Установлено, что продолжительность культивирования половинок эмбрионов более 4 ч снижает ре­зультативность их последующей приживляемости. Культивиро­вание invitro половинок эмбрионов крупного рогатого скота в течение 24 ч снижает их приживляемость примерно в три раза, по сравнению с культивированием invitro в течение 4—6 ч.

Разделенные эмбрионы коров могут храниться в заморожен­ном состоянии.

Клонирование эмбрионов путем пересадки ядер эмбрио­нальных клеток в энуклеированные яйцеклетки. Несмотря на то, что разработанная техника разделения эмбрионов на поло­винки явилась значительным шагом в повышении возможности размножения животных и улучшения их генетического потен­циала, она имеет целый ряд ограничений в клонировании жи­вотных: а) методом разделения эмбрионов клонируется не вы­сокопродуктивный родитель, а его потомок, хозяйственно полез­ные признаки которого еще неизвестны; б) максимальное получение особей на один эмбрион ограничено тремя — четырь­мя новорожденными; в) последовательное разделение эмбрио-

240

нов сопровождается формированием структуры бластоцист меньшего размера с уменьшением числа клеток.

Если бластомеры кролика были отделены после третьего, четвертого или пятого деления на 8-, 16- или 32-клеточной ста­дии и культивировались индивидуально invitro, то формирова­лись бластоцисты (без внутренней клеточной массы) меньшего размера. Среднее число клеток в этих бластоцистах было 29, 16 и 7, что составляло около ¹/₈, ¹/,₆, ¹/₃₂ числа клеток эмбрионов, не подвергнутых манипуляции (среднее число клеток 244).

После пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеиро­ванные яйцеклетки ядро репрограммируется таким образом, что начинает развиваться новый эмбрион. Теоретически все бластомеры из эмбриона донора имеют одну и ту же генетиче­скую основу и, таким образом, способны обеспечить развитие идентичных особей. Эмбрионы, развившиеся после пересадки ядер, в свою очередь, могут быть использованы как доноры ядер. После нескольких генераций создается возможность полу­чения сотен и даже тысяч идентичных эмбрионов.

Клонирование эмбрионов путем пересадки ядра включает три основных этапа: выделение интактного ядра донора, энук­леацию ооцита, пересадку ядра в энуклеированную яйцеклет­ку. В отличие от амфибий пересадка ядра у млекопитающих не стимулирует ооцит. Поэтому требуется четвертый этап — акти­вация ооцита и слияние мембран яйца и ооцита. Под действи­ем электрического импульса происходят активация ооцита и слияние мембран между ядром клетки донора и энуклеирован-ным ооцитом-реципиентом. Технология пересадки ядер клеток способствовала успешному получению клонированных живых кроликов, мышей, овец, коз, крупного рогатого скота и свиней. Было показано, что только эмбрионы на предимплантационной стадии являются тотипотентными, но эффективность этой тех­нологии пока низка. У крупного рогатого скота была продемон­стрирована следующая эффективность этой технологии на каж­дом этапе (%): энуклеация—70—80, развитие морулы-бласто­цисты клонированных эмбрионов — 20—30 и выживаемость до получения потомства — 20—30. В исследованиях КР- Вондиоли (1991) 190 эмбрионов с пересаженными ядрами были получены из одного эмбриона путем многократной пересадки ядер из по­следовательно клонированных эмбрионов. Однако последова­тельные пересадки ядер после четвертого цикла сопровожда­лись высокими эмбриональными потерями в матке. В итоге не

 

241

удалось получить телят от пересадки эмбрионов, полученных после третьего цикла клонирования.

При использовании в качестве доноров ядер более продвиг-нутых в развитии эмбрионов крупного рогатого скота 6-дневно­го возраста (47—68 бластомеров), по сравнению с использова­нием малоклеточных эмбрионов (около 30 бластомеров), дости­гается более высокая эффективность слияния бластомера и ооцита, дробления эмбрионов и развития до стадии бластоци-сты (В.И. Захарченко и др., 1996). Число клонированных бла-стоцист, полученных от эмбрионов одного и того же возраста, более продвигнутых в развитии, значительно выше, чем от ме­нее продвигнутых. Эффективность развития клонированных эм­брионов крупного рогатого скота выше при использовании в качестве источника бластомеров морул на стадии прекавита-ции. При этом свежевымытые морулы являются лучшими доно­рами ядер, чем развившиеся invitro.

Широкомасштабное клонирование эмбрионов крупного ро­гатого скота было проведено двумя коммерческими фирмами в США и Канаде. В первом случае ядра-доноры получили от 32—64-клеточных эмбрионов, а во втором—от 8—64-клеточ-ных. В обоих случаях ооциты брали от телок с вызванной су­перовуляций через 24—48 ч после начала охоты, а эмбрионы извлекали нехирургическим способом. Все реконструированные ооциты с пересаженными ядрами культивировали в лигатиро-ванных яйцеводах овцы в течение 4—5 дней в США и 5—7 дней в Канаде до пересадки их постоянному реципиенту. В Ка­наде 128 (42,4 %) коров-реципиентов из 302 стали беременными на 35-й день от начала охоты, 14 (4,6%) абортировали до 90-го дня беременности, 4 (1,3%) абортировали между 6,5-м и 8-м месяцами беременности. Из оставшихся ПО (36,4%) беремен­ных коров-реципиентов 10 погибли из-за неблагоприятных ус­ловий содержания, а 100 принесли живых телят. В США часть эмбрионов, нормально развивавшихся в яйцеводе овцы, были использованы в качестве доноров в последующих циклах пере­садки ядер. Результаты этого эксперимента (табл. 4.9) показа­ли, что эмбрионы, полученные в результате множественных ге­нераций, имеют низкую степень слияния и небольшое число клеток, развившихся до морулы-бластоцисты. Однако цикличе­ская пересадка ядра эмбрионов обеспечивает получение нор­мальных эмбрионов, содержащих такое же число клеток в по­следующих генерациях. Из эмбрионов с трансплантированны­ми ядрами первой и третьей генераций были получены телята.

 

242

Таблица 4.9. Характеристика генераций эмбрионов после пересадки ядер эмбриональных клеток крупного рогатого скота

 

	Генерации транс­ плантированного ядра	Число ооцитов со слившимися мем­ бранами	Число эмбрионов, развившихся до стадии морулы- бластоцисты	Среднее число кле­ ток в результате трансплантации ядра
	Нулевая Первая Вторая Третья	584/887 (66) 576/961 (60) 230/441 (52) 67/124 (54)	84/417 (20) 63/610(10) 49/255(19) 8/68(12)	27,5 27,5 35,4 Не подсчитано

Примечание.В скобках приведены значения в процентах.

 

Осложняет пересадку ядер эмбриональных клеток получение телят с большой живой массой примерно на 15—20% больше, чем у контрольных животных. Это приводит к тяжелым родам (рождению мертворожденных телят, задержке выхода последа).

Пересадка ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки имеет много преимуществ по сравнению с техноло­гией разделения эмбрионов. Эти преимущества следующие:

отдельные эмбриональные клетки, полученные из эмбриона на стадии до 64 клеток, могут быть репрограммированы в од­ноклеточные зиготы и давать множественные копии генетиче­ски одинаковых животных;

повторное клонирование путем пересадки ядер от клониро­ванных эмбрионов повышает потенциальные возможности тех­нологии в производстве большего числа клонов;

определение пола эмбриона может быть включено в схему клонирования, что позволит всем клонам иметь пол, установ­ленный для первоначального эмбриона;

эмбрионы, полученные от различных генетических линий, могут быть заморожены и размножены после тестирования клона на продуктивность и иметь высокую экономическую цен­ность.

Еще более перспективным может стать использование эм­бриональных стволовых клеток в получении клонированных сельскохозяйственных животных. Эмбриональные стволовые клетки — это плюропотентные клетки, выделенные из эмбрио­нов. Они проявляют пролифирацию в культуре и сохраняют способность к дифференциации в условиях invitro и invivo. Наиболее яркий пример их дифференциации invivo — это инъ­ецирование в бластоцель бластоцисты. При этом развивается химера с тканями как от эмбриона-хозяина, так и из стволовых клеток. В 1981 г. две лаборатории независимо друг от друга со-

 

243

общили о том, что плюропотентные клетки (т. е. эмбриональные стволовые клетки) могут быть выделены и прокультивированы непосредственно из бластоцист мыши. Схема получения стволо­вых эмбриональных клеток следующая. После оплодотворения ооцита спермиями зигота проходит цикл делений, формируя морулу, которая затем переходит в бластоцисту. Внутренняя клеточная масса бластоцисты может быть удалена и помещена на культивирование для получения линии стволовых эмбрио­нальных клеток. Эмбриональные стволовые клетки могут быть использованы для решения различных генетических целей и за­тем возвращены в бластоцисту донора для создания, например, трансгенного животного. Кроме того, эмбриональные стволовые клетки могут служить в качестве источника ядер-доноров для инъекции в энуклеированные ооциты при получении клониро­ванного (идентичного) потомства.

Несмотря на потенциальные возможности использования эмбриональных стволовых клеток в исследованиях по изучению развития эмбриона и для получения трансгенных животных, в настоящее время эмбриональные стволовые клетки получены только из эмбрионов мышей и хомячков. Было показано, что только эмбриональные стволовые клетки мыши способны обес­печить получение половых химер. Вместе с тем известны еди­ничные сообщения о получении изолированных клеток из внут­ренней клеточной массы бластоцисты у свиней, овец и крупного рогатого скота. Однако пока не установлено, являются ли эти клетки, полученные от сельскохозяйственных животных, плюро-потентными и недифференцированными и можно ли их поддер­живать в культуре тканей.

Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных. Принято считать, что успешная пересадка эмбрио­нов может быть осуществлена только между самками одного вида. Пересадка эмбрионов, например, овец козам и наоборот сопровождается их приживляемостью, но не завершается рож­дением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функ­ции плаценты, по-видимому, за счет иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода.

Эта несовместимость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помощью микрохирургии.

Сначала были получены химерные животные путем объеди­нения бластомеров из эмбрионов одного вида. С этой целью по­лучали сложные химерные эмбрионы овец объединением 2-, 4-, 8-клеточных эмбрионов. Каждый сложный объединенный эм­брион состоял из равного числа бластомеров эмбрионов от 2—8

244

родителей. При этом общее число клеток колебалось от четы­рех- до восьмикратного увеличения нормального числа клеток. Эмбрионы вводили в агар и переносили в лигатированные яй­цеводы овец для развития до стадии ранней бластоцисты. Нор­мально развивающиеся бластоцисты пересаживали реципиен­там и получили живых ягнят, большинство из которых оказа­лись химерными по данным анализа крови и внешним признакам.

Получены химерные овцы путем инъекций внутренней кле­точной массы, выделенной иммунохирургическим путем из эм­брионов доноров в бластоцисты эмбрионов реципиентов. Зону пеллюциду у бластоцист доноров удаляли инкубированием в 0,5%-ной проназе и пипетированием.

Для восстановления их функции после обработки проназой эмбрионы культивировали в течение 3 ч. Затем эмбрионы без прозрачной оболочки культивировали в течение 1 ч в антисыво­ротке к клеткам печени овцы, три раза отмывали и помещали в раствор (1:4) сыворотки крови морской свинки на 1 ч. Лизиро-ванные клетки трофобласта удаляли пипетированием, а изоли­рованную внутреннюю клеточную массу вводили проколом инъекционной пипетки через зону пеллюциду в трофобласт бластоцисты реципиента.

После пересадки этих бластоцист получены химерные ягнята как по признакам групп крови, так и по внешним признакам.

Получены химеры и у крупного рогатого скота (Г. Брем и др., 1985) соединением половинок 5—6,5-дневных эмбрионов. Пять из семи телят, полученных после нехирургической пере­садки агрегированных эмбрионов, не имели признаков химериз-ма. Один теленок был химерой двух пород — бурой швицкой и голштинофризской. Однако масть бурой швицкой породы доми­нировала. Анализ крови этого теленка показал присутствие групп крови только от родителей голштинофризской породы. Другой теленок был химерой неопределенного происхождения.

Показана высокая эффективность получения химер крупно­го рогатого скота объединением морул без зоны пеллюциды. Авторы получили химеры крупного рогатого скота с «двойной мускулатурой» из меченых хромосомной транслокацией эм­брионов и нормальных эмбрионов в целях модификации и ис­пользования особенностей роста животных с «двойной мускула­турой». В этих исследованиях показано, что передача химерам родительского типа носит случайный характер, т. е. потомство может развиваться из клеток, происходящих или от любого эм­бриона, или от сочетания эмбрионов. Половина всех химер представляет собой интерсексов.

 

245

Наиболее показательно получение химер от объединенных частей эмбрионов разных видов, например, овцы и козы.

Исследования СВ. Фехилли и др. (1984) показали, что бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4—5 сут в лигатированный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоцисты. Эти бластоцисты жизнеспособ­ны и могут развиваться до рождения нормального потомства. В первом опыте в результате объединения по одному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, пересадка которых завершилась получением семи потомков. Все потомки были похожи в основном на ягнят, но у трех из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко кон­трастирующие с плотно вьющейся шерстью.

Во втором опыте объединением 8-клеточных эмбрионов с удаленной зоной пеллюцидой овцы и козы с разделенными бластомерами 8-клеточного эмбриона другого вида получено пять потомков, похожих на ягнят, но два из них с отклонениями в шерстном покрове, как и в первом опыте, и два потомка, похо­жих на козлят, с некоторыми отклонениями в шерстном покро­ве у одного из них.

В третьем опыте после введения внутренней клеточной мас­сы и полярного трофэктодерма от 8-дневных эмбрионов и 8-дневных бластоцист другого вида получено шесть из девяти потомков, похожих на ягнят, и три потомка с внешними при­знаками химеризма. Только у одного животного с внешними признаками химеризма во втором опыте обнаружены группы крови родителей обоих видов. Все остальные животные с внеш­ними признаками химеризма имели группы крови овцы.

 

 

---

Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 783; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!