ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ
Развитие молекулярной генетики, позволяющей целенаправленно нарабытывать ДНК как носителя генетической информации, открывает животноводству новые перспективы. Применение методов генной инженерии в животноводстве дает основание прогнозировать, что традиционные методы разведения животных будут дополнены и даже заменены новыми технологиями.
Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, определяют как трансгенных, а интегрировавшийся в геном рецепиента ген — как трансген. Продукт этого гена — белок — является трансгенным продуктом.
246
С помощью переноса генов при синтезе рекомбинантных белков можно добиться изменения некоторых свойств организма, придать ему новые качества. При передаче трансгена по наследству потомству возможно создание трансгенных линий животных.
Создание и выделение трансгенов, их клонирование являются объектом исследований генных инженеров, и поэтому эти вопросы не рассматриваются в данном учебном пособии.
После выбора и приобретения необходимой генной конструкции получение трансгенных сельскохозяйственных животных можно разделить на следующие этапы.
1. Приготовление раствора ДНК для микроинъекции.
2. Подготовка доноров и извлечение эмбрионов.
3. Визуализация пронуклеусов в эмбрионах сельскохозяйственных животных и микроинъекция ДНК-
4. Пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или (после промежуточного культивирования) в матку синхронизированных реципиентов.
|
|
|
5. Доказательство интеграции у родившихся потоков и, если возможно, первое исследование экспрессии трансгена на уровне транскрипции (РНК) и трансляции (протеин).
6. Получение трансгенных потомков с использованием методов традиционного животноводства.
Приготовление раствора ДНК для микроинъекций. В растворе ДНК для микроинъекции должны отсутствовать механические примеси, которые могут вызвать закупоривание инъекционной пипетки или повреждение инъецируемых клеток. Растворы, соприкасающиеся с ДНК, предварительно стерилизуют, а посуду тщательно промывают. Конечную концентрацию ДНК устанавливают таким образом, чтобы в 1 пкл инъекционного раствора содержалось более 100 копий генной конструкции. Обычно используют раствор с концентрацией 1000 копий в 1 пкл. Для фрагментов ДНК длиной от 5 до 8 кб в 1 мл содержатся 100 копий при концентрации 1—2 мкг/мл. Связь между количеством инъецируемой ДНК и числом интегрировавшихся копий не обнаружена. Готовый для инъекции раствор ДНК хранят в замороженном состоянии.
Частота интеграции при получении трансгенных животных методом микроинъекции зависит от следующих факторов: очистки инъекционного раствора; формы ДНК (кольцевая, линейная); вида концов (тупые или неравные); концентрации ДНК; буферного раствора.
|
|
|
Таким образом, уже от приготовления инъекционного раствора зависит эффективность получения трансгенных животных.
247
Подготовка доноров и извлечение эмбрионов. При получении трансгенных животных исследователи стремятся к тому, чтобы все соматические и особенно генеративные клетки содержали генную конструкцию. Поэтому гены транспортируют на ранних стадиях развития животного: в большинстве случаев на стадии зиготы или 2-клеточных эмбрионов.
Для получения большого числа эмбрионов вызывают суперовуляцию у доноров, после чего их спаривают или осеменяют. Схемы гормональной обработки свиней и овец для вызывания суперовуляции и синхронизации охоты у доноров и реципиентов показаны в табл. 4.10, 4.11 и 4.12.
Таблица 4.10. Вызывание суперовуляции у свиней и синхронизация охоты у доноров и реципиентов
| Дни | Время суток | Обработка | |
| доноров | реципиентов | ||
| —19 —5 | 7—00 | 5 мл Регумейта | 5 мл Регумейта |
| —4 — 1 0 + 1 + 2 | 17-00 17-00 17-00 7-00 8-00— 12-00 | 1500 и. е. СЖК 750 и. е. ХГ 1-е осеменение 2-е осеменение извлечение эмбрионов | 750 и. е. СЖК 750 и. е. ХГ Выявление охоты Выявление охоты Пересадка эмбрионов |
|
|
|
Таблица 4.11. Вызывание суперовуляции у овец и синхронизации охоты у доноров и реципиентов
| Дни | Обработка |
| 0 | Выявление в охоте |
| 7 | 19-00 ФСГ — 4 мг донорам |
| 8 | 7-00 ФСГ — 4 мг донорам |
| 19-00 ФСГ — Змг донорам | |
| 19-00 простагландин (эстуфалан —1 мл) реципиентам | |
| 9 | 7-00 ФСГ — Змг донорам |
| 7-00 простагландин (эстуфалан — 1 мл) донорам | |
| 19-00 ФСГ — 2 мг донорам | |
| 10 | 17-00 ФСГ — 2 мг донорам |
| 11 | 7-00 Выявление охоты доноров и реципиентов и осеменение доно- |
| ров | |
| 19-00 Осеменение доноров | |
| 12 | 14-00 Вымывание и пересадка эмбрионов |
248
Таблица 4.12. Сравнение эффективности получения трансгенов у лабораторных и сельскохозяйственных животных (по Г. Брему, 1991)
| Круп- | |||||
| Показатели | Мышь | Кролик | Свинья | Овца | ный рогатый скот |
| Число пригодных для | |||||
| инъекции эмбрионов на | |||||
| донора | 15 | 20 | 20 | 4 | 7 |
| Число доноров на одного | |||||
| реципиента | 2 | 2 | 2 | 1,5 | 1 |
| Беременность (%) | 60 | 50 | 50 | 40 | 30 |
| Родившиеся живот- | |||||
| ные/инъецированные эм- | |||||
| брионы, % | 10—20 | 10 | 5—8 | 15 | 10 |
| Степень интеграции | |||||
| (трансгенные живот- | |||||
| ные/родившиеся живот- | |||||
| ные), % | 15 | 10 | 10—15 | 5—10 | 5—10 |
| Трансгенные живот- | |||||
| ные/пересаженные эм- | |||||
| брионы, % | 2 | 1 | 0,5 | 0,5—1 | 0,5 |
| Требующееся число жи- | |||||
| вотных для получения од- | |||||
| ного трансгенного живот- | |||||
| ного | 10 | 15 | 20 | 40 | 40 |
Визуализация пронуклеусов в эмбрионах сельскохозяйст венных животных и микроинъекция ДНК. Для введения генов в геном животного в настоящее время используют три основных метода:
|
|
|
микроинъекция ДНК в пронуклеус зигот или в каждый бла-стомер у 2-клеточного эмбриона;
введение ДНК с использованием ретровирусных векторов;
получение трансгенных химер из генетически трансформированных клеток и эмбрионов.
Наиболее распространен метод микроинъекции ДНК. Два других метода имеют ряд ограничений и пока не нашли применения на сельскохозяйственных животных.
Для микроинъекции эмбрионов необходим устойчивый стол, на котором устанавливают инвертированный микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы. Эмбрионы фиксируют посредством
249
пониженного давления на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден. Кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр около 1 мкм) наполняют раствором ДНК. Пипетку вводят в пронуклеус через прозрачную оболочку и клеточную мембрану и затем инъецируют 1—2 пкл раствора ДНК. О точности операции судят по набуханию пронуклеуса. Увеличение объема пронуклеуса свидетельствует о том, что раствор ДНК действительно введен. После инъекции эмбрионы освобождают от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам.
В оплодотворенных яйцеклетках мыши и кролика, извлеченных в соответствии со стадией их развития, пронуклеусы очень хорошо видны и могут быть легко инъецированы. У эмбрионов сельскохозяйственных животных в цитоплазме имеются темные липидосодержащие гранулы, которые затрудняют визуализацию пронуклеусов. В результате центрифугирования при 15000 g/мин в течение 3—5 мин гранулы смещаются к одному полюсу яйцеклетки, а лежащие недалеко от центра пронуклеусы становятся видимыми и доступными для микроинъекций. Для эмбрионов овцы, как правило, не требуется центрифугирования: для визуализации пронуклеусов достаточно применить оптику Номарского с интерференционным контрастом. Несмотря на сложную обработку (центрифугирование), микроинъекция эмбрионов сельскохозяйственных животных все же сложнее и не может быть выполнена с такой же надежностью и эффективностью, как у мышей и кроликов.
Пересадка эмбрионов. После кратковременного культивирования invitro проинъецированные эмбрионы хирургическим путем переносят в яйцеводы синхронизированных реципиентов.
Синхронизация охоты у реципиентов и доноров, от которых получают эмбрионы, является необходимым условием для успешного выполнения программы по переносу генов (эмбрионов), так как яичники, яйцеводы и матка должны находиться в соответствующей стадии, чтобы физиологически обеспечить дальнейшее развитие пересаженных эмбрионов.
Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают 20—30 инъецированных зигот, причем у свиней все эмбрионы трансплантируются в один яйцевод, а у мышей и кроликов— раздельно по яйцеводам. У овец, коз и крупного рогатого скота каждому реципиенту пересаживают два-четыре эмбриона.
Синхронизация охоты достигается спариванием с вазэкто-мированными (стерильными) самцами, индукцией овуляции хо-
250
рионическим гонадотропином человека (НСР), «мягкой» суперовуляцией или лютеолизом желтого тела.
Микроинъецированные яйцеклетки переносят реципиенту хирургической трансплантацией, так как бескровный доступ к яйцеводам даже у крупных сельскохозяйственных животных, кроме коров и кобыл, невозможен. С этой целью реципиентам под наркозом вскрывают брюшную полость, локализуют яичники и яйцеводы, контролируют реакцию яичников на индукцию овуляции (присутствие овуляционных точек, желтых тел) для исключения непригодных (несинхрозированных) реципиентов. Затем специальный катетер с находящимися в нем микроинъе-цированными эмбрионами вводят в яйцевод через воронку, после чего в канал яйцевода инъецируют среду с эмбрионами.
Чтобы пересаживать проинъецированные эмбрионы крупного рогатого скота нехирургическим путем в матку реципиента, их культивируют invitro до стадии морулы.
Изучение интеграции и экспрессии генов у трансгенных жи вотных. Для доказательства интеграции используют три основных метода: блот-анализ, дот-блот-анализ и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Материалом для исследований служат ядросодержащие клетки тканей или внутренних жидкостей организма исследуемых животных. Отбирают пробы тканей для крови (с добавлением антикоагулирующих веществ), из которых выделяют ДНК. Для блот-анализа, например, требуется 20—30 мкг ДНК. С помощью блот-анализа можно получить самое точное и надежное доказательство интеграции ДНК. Метод дот-блот-анализа используют для установления числа интегрировавших в геном копий. По технологии ПЦР результаты анализа могут быть получены за относительно короткое время и при наличии чрезвычайно малого количества клеточного материала.
Выделение РНК для исследования трансгенных животных на транскрипцию микроинъецированных генных конструкций проводят из тех тканей, в которых ожидается наиболее высокий уровень экспрессии.
Исследование трансляции генной конструкции проводят путем качественного и количественного анализа экзогенного протеина. Существуют различные методы доказательства присутствия тех или иных протеинов (радиоиммунологические, имму-ноферментные, биологические и т. д.)
Наследование трансгенов. Для образования трансгенных линий животных решающее значение в животноводстве имеет получение таких трансгенных животных (трансгенные особи, родившиеся из инъецированных эмбрионов), все или по крайней мере часть половых клеток которых содержат трансген.
251
При исследовании родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства было показано, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях (в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток), могут появляться мозаики. Мозаиками считаются животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящих из одной зиготы, но имеющих различные генотипы. Трансгенные мозаики кроме клеточных линий, содержащих трансген, имеют нетрансгенные клеточные линии. При получении от таких животных трансгенного потомства и при выделении трансгенных линий могут возникнуть трудности. Так, если клетки гонад не содержат трансген, потомство не может наследовать инъецированный ген от трансгенной родительской формы.
На основании существующих данных можно сделать вывод, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции, являются мозаиками. Поэтому трансген не передается потомству с ожидаемой, согласно законам Менделя, частотой 50%. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству.
В Норме наследование трансгена соответствует законам Менделя для моногибридного скрещивания, так как в большинстве случаев интеграция происходит только в одной-единствен-ной точке одной хромосомы. По этой причине таких трансгенных животных определяют как гемизиготных. Термин «гетеро-зигота» здесь неприменим, потому что на гомологичной нетрансгенной хромосоме отсутствует соответствующий трансгену аллель. Что касается мозаиков, то они появляются, как правило, только в /F0-генерации. Животные F1-генерации в последующих поколениях (если они позитивные) содержат генную конструкцию во всех соматических и эмбриональных клетках.
Относительно редко в геноме первичных трансгенных животных наблюдается сразу несколько точек интеграции. У трансгенного животного с двумя независимыми участками интеграции можно ожидать, что 75% потомства будут наследовать трансген (при этом 25% наследуют один из двух трансгенов и у 25% в геноме присутствуют обе точки интеграции) и лишь 25% потомства будут нетрансгенными.
При спаривании гомозиготного трансгенного потомства в норме ожидается следующее расщепление: 50% — гемизиготных (по трансгену), 25% — гомозиготных и 25% — негативных (нетрансгенных) особей.
Создание разных типов трансгенных животных. Мечтой многих исследований-селекционеров мира является разработка возможности не просто отбора животных с измененной хозяйст-
252
венно-полезной изменчивостью, а преднамеренное изменение генотипа и направленное создание желаемого типа животных. Это оставалось неосуществимой мечтой до тех пор, пока не были сделаны выдающиеся открытия — выявление ДНК как носителя генетической информации, пока не были заложены основы рекомбинантной техники (открытие рестрикционных энзим, клонирования ДНК и т. д.) или генной инженерии. В относительно короткие сроки были разработаны методы выделения из генома отдельных генов, создания эффективно функционируе-мых генных конструкций. В последующие годы были разработаны методы введения чужеродных генов в геном животных-реципиентов. Селекционеры получили в свое распоряжение могучий инструмент для создания животных с совершенно новыми свойствами.
Что касается областей применения переноса генов у сельскохозяйственных животных, то надежды ученых в настоящее время связаны с улучшением продуктивности и качества животноводческой продукции, резистентности к болезням и создания так называемых «генных форм» или трансгенных животных-биореакторов ценных биологически активных веществ.
Трансгенныеживотныес новымихозяйственно-полезнымисвойствами.Одним из основных направлений генной инженерии на первом этапе было направленное изменение наследственности животных в отношении увеличения скорости роста, повышения надоев и улучшения качества продукции.
Рост животного является чрезвычайно сложным процессом, который зависит от действия генов, условий питания и факторов окружающей среды. С генетической точки зрения особенно интересны гены, кодирующие протеины каскада гормона роста, а именно, непосредственно гормон роста (ГР), рилизинг фактора гормона роста (Р) и инсулинподобный фактор гормона роста (ИФ ГР).
Еще в 40-е годы было установлено стимулирующее действие гипофйзарного ГР на молочную продуктивность коров. Однако, ввиду высокой стоимости препаратов гипофйзарного ГР и невозможности его получения из гипофизов.животных в больших количествах, они не нашли практического применения.
К концу 70-х годов, с началом эры генной инженерии и появлением дешевых гормональных препаратов, полученных путем микробиального синтеза на основе технологии рекомбинантной ДНК, был синтезирован ГР. Было показано, что ГР микробного происхождения оказывает такое же стимулирую-
253
щее действие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР.
При крупномасштабном применении рекомбинантного ГР в дозе 13 мг в день увеличение удоев составляет 23—31%. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие проводить обработку один раз в две недели и даже в месяц.
Ежедневные инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней и овец вызывает увеличение суточных привесов на 20—30% и сопровождаются сокращением расхода кормов на единицу прироста. У молодняка свиней ускорение роста сопровождается увеличением содержания белка и уменьшением содержания жира в тканях, что повышает ценность мясопродукции.
Первые трансгенные мыши с геном ГР были получены в 1982 г. У них была установлена повышенная скорость роста (четырехкратная) и удвоенная конечная Живая масса.
В противоположность результатам, полученным на мышах, у трансгенных свиней с геном ГР у Пурсела и др. (1988, 1989) не наблюдалось соответствующего ускорения роста.
По сообщению Л.К. Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7% выше, чем у контрольных животных.
Известно, что для ускорения роста свиней при инъекции ГР необходимо скармливать животным корма с повышенным содержанием протеина (18% сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина. У потомства трансгенных свиней, получавших соответствующий модифицированный кормовой рацион, наблюдались на 16,5% более высокие среднесуточные привесы (Г. Брем и др., 1991).
Трансгенные овцы с геном ГР и РФ ГР имели повышенный уровень ГР, но не обладали повышенной скоростью роста.
Вместе с тем, все авторы единодушно отмечают, что трансгенные свиньи имеют более чем двукратное уменьшение толщины шпика (18—20 мм у контрольных свиней против 7—8 мм у трансгенных). Аналогичным образом трансгенные овцы имели 5—7% жира по сравнению с 25—30% у контрольных животных. Разницу по скорости роста между трансгенными мышами и трансгенными сельскохозяйственными животными некоторые исследователи объясняют следующим образом. В используемых для переноса генов линий мышей не велась селекция по их ростовой продуктивности, тогда как большинство исследуемых свиней происходили из популяций, в которых в течение десятилетий велась селекция по этому показателю. Подтверждением
254
этого предположения является тот факт, что селекция мышей в течение 30 поколений по скорости роста сопровождалась удвоением у них живой массы. Они имели лишь незначительно меньшую конечную живую массу по сравнению с трансгенными мышами. Отсюда можно сделать вывод, что введение чужеродного гена ГР в популяцию линий мышей, не подвергнутых селекции на скорость роста, вызывает скачок на более высокое ростовое плато. В имеющихся популяциях свиней, наоборот, генетический потенциал роста, по-видимому, находится недалеко от потенциального плато и поэтому дополнительным введением гормона роста или переносом генов гормона роста можно добиться лишь сравнительно незначительного эффекта в скорости роста.
Более реальные перспективы улучшения качества или состава продуктов животноводства достигают введением соответствующих генных конструкций в организм животного. Рассматривается, например, возможность уменьшения лактозы в молоке путем создания трансгенных овец или крупного рогатого скота, которые несут специфический для молочной железы промотор, сцепленный с геном лактозы. При этом становится возможным расщепление лактозы (молочного сахара) на глюкозу и галактозу уже в молоке коров. Молоко таких животных может использоваться теми людьми, у которых отсутствует фермент лактозы.
Обсуждается также возможность введения генов, вырабатывающих определенные антитела, которые предотвращают маститы.
Все исследователи отмечают увеличение содержания белка и уменьшение содержания жира в тканях трансгенных животных с генами гормона роста, что заметно повышает качество и товарную ценность получаемых мясопродуктов. По сообщению В.Г. Пурселя и др. (1989), толщина шпика у трансгенных линий свиней на спине в области 10-го ребра составила 7,4+2,3 мм по сравнению с толщиной шпика у контрольных животных (сиб-сов) 21 + 1,7 мм. По данным Л.К. Эрнста (1996), содержание жира в туше трансгенных свиней было на 10,5—13,1% ниже, чем у контрольных.
Эти данные исследований дают основание предполагать, что молекулярные методы повышения продуктивности и особенно улучшения качества продукции будут играть важную роль в зоотехнической науке и в развитии животноводства в целом.
Трансгенныеживотныес устойчивостью к заболеваниям. Потери, вызванные заболеваемостью у сельскохозяйственных животных, составляют более 10% стоимости продукции. Поэтому все более важное значение приобре-
255
тает селекция животных по резистентности к заболеваниям. Резистентность — это наследственная генетически обусловленная восприимчивость животных к определенным микроорганизмам, вирусам, паразитам или токсинам.
К сожалению, попытки вести селекцию на устойчивость к разным заболеваниям не дали радикальных результатов, хотя известны отдельные положительные примеры. Созданы, в частности, популяции крупного рогатого скота с примесью крови зебу, которые устойчивы к ряду кровепаразиторных заболеваний. Резистентность к ряду заболеваний является полигенным признаком, как, например, трипанотолерантность определенных африканских пород крупного рогатого скота, которые, кроме резистентности к заболеваниям, отличаются хорошей жаровыносливостью и нетребовательностью к условиям содержания и кормления. Вместе с тем, имеются механизмы резистентности, которые основываются на единичных генах, как, например, резистентность к диарее у новорожденных поросят, обусловленная Е. coliК88, или резистентность к гриппу у мышей.
Это послужило основанием для получения трансгенных животных с чужеродными генами, которые, возможно, обеспечат невосприимчивость таких животных к отдельным заболеваниям.
Защитные механизмы от инфекционных заболеваний функционируют или путем препятствия вторжению возбудителя, или путем изменения рецепторов. Вторжению или размножению возбудителей препятствуют, главным образом, иммунные механизмы и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости, а также иммунологические способности различных молекул, таких, как интерферон, нейропептиды, гормоны и ин-терлейкины.
Одним из примеров гена резистентности является ген Мх мыши. Этот ген, найденный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх+-мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Этот ген был выделен, клонирован и использован, в частности, для получения трансгенных свиней, которые экспрессировали ген Мх на уровне РНК (Г. Брем и др., 1991). Однако пока не получено данных об экспрессии у трансгенных свиней Мх-протеина и доказательства резистентности трансгенных свиней к вирусу гриппа.
В Голландии исследуется возможность получения трансгенных животных, способных повысить содержание лактоферина в тканях молочной железы с целью повышения резистентности к маститу.
256
Большой интерес представляют исследования по получению трансгенных животных с генами антисмысловой (ас) РНК. Экспрессия антисмысловой РНК в клетках приводит к последующей гибридизаци со смысловой РНК и, следовательно, к инги-бированию репликации вирусального генома.
Т.Н. Тихоненко была создана конструкция гена антисмысловой РНК против аденовируса Н5 (Ad5) и в Биотехцентре (М.И. Прокофьев) получены трансгенные кролики (Л.К. Эрнст и др., 1991). На культуре клеток из почек этих животных было показано, что клеточные линии, содержащие трансгенную антисмысловую РНК, имели на 90—98% более высокую резистентность против Ad5 по сравнению с контрольными линиями клеток.
В других экспериментах этой же группы ученых продемонстрирована устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК против лейкоза крупного рогатого скота на ор-ганизменном уровне к заражению вирусом лейкоза. У трансгенных кроликов с геном антисмысловой РНК против лейкоза крупного рогатого скота, зараженных антигеном р24, уровень антител был значительно ниже и не превышал титр 1:500 по сравнению с контрольными, у которых он изменялся в пределах 1:6000—1:8000.
Показана возможность создания внутриклеточной иммунизации против инфекционных вирусов. Эндогенные вирусные белки, в особенности их мутационные формы, могут служить защитой от соответствующих вирусов. В частности, получены трансгенные куры, устойчивые к вирусу лейкоза, у которых в клетках экспрессировался белок вирусной оболочки.
Приведенные выше данные открывают реальные перспективы повышения резистентности трансгенных животных к заболеваниям.
Трансгенныеживотные,продуцирующие биологическиактивныевещества медицинскогои технологическогоназначения. Основа стратегии использования трансгенных животных как биореакторов состоит во включении в клетки организма генов, которые вызывают у них синтез новых белков, как правило, медицинского и технологического назначения.
Раньше такие белки были выделены из тканей и биологической жидкости тканей человека, таких, как кровь (фактор свертываемости крови и другие белки крови) и гипофиз (гормон роста). Вследствие дороговизны и трудности получения человеческих тканей, эти белки могут производиться в малых количествах и к тому же являются объектом контаминации патогенных организмов, таких, как вирус гепатита и др.
9-177257
На первом этапе практического применения молекулярной генетики было создание рекомбинантных микроорганизмов, а позднее трансгенных клеточных линий, млекопитающих, которые выращиваются в системах биореакторов и способны производить белки, закодированные экзогенными (чужеродными) генами. Эти системы были успешно использованы в получении ценных продуктов фармакологического и медицинского назначения, такие, как инсулин, некоторые кровесвертывающие факторы, человеческий гормон роста и др.
Трансгенные животные, как продуценты ценных биологически активных белков, имеют ряд преимуществ перед микроорганизмами и клеточными системами.
Белки млекопитающих, продуцируемые микроорганизмами, не могут быть нормально гликолизированы, В-гидроксилированы или карбоксилированы. В простых рекомбинантных системах микроорганизмов это в большинстве случаев или невозможно, или возможно, но с недостаточной точностью, что приводит к изменению структуры протеинов и, как следствие, к снижению их биологической активности.
Получаемые новые белки в линиях генноинжеңерных клеток млекопитающих могут быть в некоторых случаях правильно модифицированы, с активностью, сравнимой с нативными протеинами, но выход белка из культуральных клеток в основном низкий. К тому же создание клеточных культур является сложной и дорогой процедурой. Промышленные реакторы, в которых клетки выращиваются, также являются дорогими, как в отношении их стоимости, так и в отношении их обслуживания. Трансгенные животные могут быть трудно создаваемыми и дорогими, но однажды созданная линия таких животных воспроизводит себе подобных, они легко размножаются и их содержание сравнительно дешево и, в принципе, могут продуцировать чрезвычайно большое количество белков с низкой стоимостью.
Гетерогенные белки могут быть получены большинством тканей тела животного. Путем сочетания структурных генов со специфическими, регуляторными элементами можно добиться экспрессии'трансгенов в определенных органах.
Наибольший прогресс в производстве трансгенных биореакторов был достигнут в целенаправленной трансгенной экспрессии в эпителиальные клетки молочной железы и производстве белков с молоком. Структурный ген, связанный с промотором гена молочного протеина, в первую очередь будет экспрессиро-ваться в клетках молочной железы.
Одним из основных этапов в получении трансгенных животных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, является
258
идентификация промотора, который будет направлять экспрессию в секреторный эпителий молочной железы. В настоящее время выделены гены и промоторы αSl-казеина, β-казеина, α-лактоальбумина, β-лактоглобулина и сывороточного клелого протеина (WAP).
Использование молочной железы как места производства чужеродных протеинов обосновывается огромной синтетической белковой продуктивностью молочной железы. Общая концентрация эндогенных молочных белков в зависимости от вида находится в пределах 2—10% (табл. 4.13), т. е. на уровне 20—100 граммов на литр. Если еще нет возможности получать такое же количество рекомбинантного белка из 1 л молока, то выделение одного и более граммов такого белка уже достаточно для коммерческого производства фармацевтически важных белков.
Таблица 4.13. Содержание белка в молоке разных видов животных по В.И. Георгиевскому
| Вид животного | Содержание белка в молоке, % |
| Кобыла | 2,2 |
| Корова | 3,3 |
| Коза | 3,7 |
| Свинья | 4,9 |
| Овца | 5,8 |
| Собака | 7,1 |
| Крольчиха | 10,4 |
Среди рекомбинантных белков, полученных из молока трансгенных животных, известны следующие: человеческий белок С, антигемофильный фактор IX, альфа-1-антитрипсин, тканевый плазменный активатор, лактоферин, человеческий сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназа и химозин. За исключением альфа-1-антитрипсина и химозина работы по получению большинства других белков не достигли стадии, которая бы представляла коммерческий интерес. В большинстве проектов эта работа на стадии экспериментов, когда генная конструкция оценивается лишь на трансгенных мышах.
Что же касается человеческого альфа-1-антитрипсина и химозина, то получение этих рекомбинантных протеинов уже находится на стадии, близкой к коммерческой.
Группа ученых в Эдинбурге (Великобритания) в 1992 г. получила трансгенных овец с человеческим геном альфа-1-антитрипсина и бета-глобулиновым промотором. У четырех овец содержание этого белка составляет более 1 г/л, а одна овца сна-
259
чала продуцировала 60 г/л, а затем стабилизовалась на 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. Все овцы здоровы и не имеют каких-либо нарушений лактации. При таком уровне продукции белка может быть получено более 10 кг белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов : при лечении эмфиземы легких.
Группа ученых в Москве (Л.К. Эрнст, Г. Брем, М.И. Прокофьев, И.Л. Гольдман и др.) получила трансгенных овец с геном химозина, которые продуцируют с молоком в среднем 200—300 мг фермента химозина в 1 л молока. Этот новый источник получения химозина — основного компонента для производства сыра—может заменить традиционный способ его получения из сычугов молочных телят и ягнят, так как его стоимость будет в 5—10 раз ниже. Из трех литров молока трансгенной овцы можно получить такое количество химозина, которое достаточно для производства одной тонны сыра из коровьего молока.
Из сказанного можно заключить, что многие белки, используемые при лечении человека и для технологических целей, могут быть получены с помощью трансгенных животных, продуцирующих их с молоком.
Контрольные вопросы к главе 4
1. В чем состоит принцип метода трансплантации? Его практическое значение для разведения животных.
2. Назовите основные схемы вызывания суперовуляции у коров, их эффективность. Особенности искусственного осеменения суперовулировавших коров.
3. Какие схемы гормональных обработок для вызывания суперовуляции применяются у овечд? Какой метод искусственного осеменения суперовулировавших овец наиболее эффективен?
4. В какие сроки и на каких видах животных применяют хирургические и нехирургинеские методы извлечения эмбрионов? Техника их применения.
5. Опишите метод нехирургической пересадки эмбрионов крупного рогатого скота.
6. От каких факторов зависит эффективность нехирургической пересадки эмбрионов у коров?
7. Как достигается двойневость у коров при пересадке эмбрионов?
8.Назовите особенности хирургической пересадки эмбрионов у свиней и * овец и ее результативность.
9. Какие видовые особенности условий хранения эмбрионов при температу
ре тела и пониженной температуре?
10. Основные принципы замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Сущность метода одноступенчатого разбавления замороженных и оттаянных эмбрионов крупного рогатого скота.
11. Приведите основные приемы замораживания и оттаивания эмбрио'нов овец.
260
12. Какое практическое и научное значение имеет метод оплодотворения яйцеклеток вне организма животного?
13. Каковы потенциальные запасы ооцитов в яичниках животных и как они используются в течение жизни животного?
14. В каких условиях происходит спонтанное возобновление мейоза ооцитов млекопитающих? В какие сроки происходят основные этапы созревания ооцита после возобновления мейоза? Каковы их видовые различия?
15. Какие основные факторы культуральной среды влияют на полноценное созревание ооцитов вне организма животного?
16. Два основных способа извлечения ооцитов из фолликулов коров. Какие преимущества прижизненного получения ооцитов из яичников коров?
17. Что означает термин «капацитация сперматозоидов»? Какие изменения происходят в сперматозоиде во время капацитации?
18. Методика вызывания капацитации сперматозоидов крупного рогатого скота с применением гепарина.
19. Как влияет продолжительность капацитации сперматозоидов крупного рогатого скота в среде с гепарином и многократность использования всплывших сперматозоидов из одного и того же образца спермы на оплодотворяемость сперматозоидов вне организма?
20. Назовите основные приемы оплодотворения вне организма ооцитовкрупного рогатого скота.
21. Каковы успехи в оплодотворении ооцитов овец и свиней вне организма?
22. На чем основано получение однояйцевых близнецов в условиях вне организма животного?
23. Какие успехи достигнуты в получении однояйцевых близнецов при разделении эмбрионов на половинки и четвертинки у крупного рогатого скота,
овец и свиней?
24. На каких стадиях развития эмбрионов возможно их успешное разделение на половинки с получением потомства?
25. Каковы ограничения использования техники разделения эмбрионов на половинки в технологии разведения животных?
26. Назовите основные этапы клонирования эмбрионов животных путем пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки. На каких стадиях развития эмбрионов возможно использование их ядер для клонирования?
27. Какие факторы влияют на эффективность клонирования эмбрионов (возраст эмбриона, продвинутость в развитии эмбриона, оплодотворенные в организме или вне организма)?
28. Каковы успехи клонирования эмбрионов крупного рогатого скота в широкомасштабных экспериментах?
29. Какие преимущества техники клонирования эмбрионов путем пересадки ядер по сравнению с разделением эмбрионов на половинки?
30. Что такое химерное животное? Каковы успехи получения химерных животных одного вида путем объединения бластомеров разных эмбрионов?
31. Возможно ли получение химер от объединения частей эмбрионов разных видов? Каковы успехи в этой области клеточной инженерии?
32. Что означает понятие трансгенные животные?
33. Назовите основные этапы получения трансгенных животных.
34. Каковы видовые различия в получении трансгенных животных (эффективность приживляемости пересаженных микроинъецированных эмбрионов, степень интеграции гена, требующееся число животных для получения одного трансгенного)?
35. Особенности наследования чужеродных генов у трансгенных животных.
36. Как влияет инъекция гормона роста животным на скорость роста и молочную продуктивность?
261
37. Чем объясняется разница в скорости роста первых трансгенных мышей и трансгенных свиней с этим же геном?
38. Назовите известные изменения в качестве продукции у трансгенных животных.
39. Приведите примеры получения животных с устойчивостью к заболеваниям при традиционных методах селекции.
40. Назовите примеры получения трансгенных животных с устойчивостью к определенным заболеваниям.
41. Что означает выражение «трансгенные животные — биореакторы биологически активных веществ»?
42. Какие традиционные методы получения ценных человеческих белков для лечебных целей вы знаете?
43. Какие ограничения существуют в использовании рекомбинантных микроорганизмов и линий генноинженерных клеток млекопитающих при получении ценных биологически активных веществ медицинского и технологического назначения?
44. Какие преимущества имеют трансгенные животные по сравнению с ре-комбинантными микроорганизмами и клеточными линиями млекопитающих в получении ценных фармакологических веществ?
45. Чем обосновано использование молочной железы как места производства чужеродных протеинов у трансгенных животных?
ГЛАВА 5
Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 1176; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!