ФИТОГОРМОНЫ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ РЕГУЛЯТОРЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ
Фиторегуляторы занимают особое место в арсенале средств биотехнологии растений, поскольку являются главными инструментами, позволяющими управлять процессами каллусообразования, дифференцировки, роста и развития растений-регенерантов.
Регуляция органогенеза. Гениальный физиолог растений XIX в. Ю. Сакс более ста лет назад, в 1880 г., предсказал наличие регуляторных веществ, ответственных за дифференцировку и развитие основных органов растения — корня, стебля и листа, назвав их соответственно ризоколином, кауликолином и фолиоколином. Время во многом подтвердило справедливость таких взглядов, не поддержанных его современниками. Дальнейшим развитием их стала теория флоригена, предложенная выдающимся отечественным исследователем М.Х. Чайлахяном. И хотя поиски флоригена еще не увенчались успехом, они пока-
342
зали правомочность этой теории, так же как и современные данные о регуляции развития и роста корня под действием ауксина, а побега — под действием цитокинина подтверждают справедливость взглядов Сакса.
В связи с развитием биотехнологии сельскохозяйственных растений значимость сведений о фитогормональной регуляции органогенеза неуклонно возрастает, поскольку именно фитогормоны являются основным инструментом при различных манипуляциях с культурами клеток и тканей растений.
Корнеобразование.Искусственное укоренение побега, листа или стебля широко применялось в растениеводстве во все времена, однако этот путь размножения был пригоден далеко не для всех случаев, трудоемок и дорог. Лишь с открытием ауксина в начале 30-х годов и его способности индуцировать образование адвентивных корней и стимулировать развитие корневой системы появилась возможность массового размножения практически всех видов растений черенкованием.
|
|
В настоящее время, несмотря на значительную модернизацию, суть данного способа размножения осталась неизменной— обработка черенков аналогом ауксина перед высадкой на укоренение. Огромная работа по изучению процесса корнеобразования и определению оптимальных технологий черенкования проделана научной школой кафедры плодоводства ТСХА.
Образование адвентивного корня происходит из клеток камбия, причем строго в зоне сочленения его с сердцевинным лучом. Наиболее эффективно этот процес идет в период максимальной пролиферирующей активности камбиальной ткани. Формирование корня из клеток меристематической ткани детерминировано генетически. Изменение транскрипции генетических программ, приводящее к ризогенезу, контролируется ауксином, который после взаимодействия с определенным рецептором и образования соответствующего гормон-рецепторного комплекса запускает систему ответа, приводящую к снятию ре-прессорной блокады с оперонов генов ферментов, изменяющих метаболизм и приводящих к корнеобразованию.
|
|
Не все синтетические аналоги ауксина обладают способностью индуцировать корнеобразование. Так, ризогенная активность индолил-3-масляной (ИМК) и нафтилуксусной (НУК) кислот, синтетических аналогов ауксина значительно превышает то же действие настоящего природного фитогормона — ИУК. Это связано с большей стабильностью синтетических регуляторов в клетке, обусловленной меньшим сродством их к ферментам дезактивации гормона. В то же время, другой аналог ауксина— 2, 4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д)—практи-
343
чески не способна вызывать ризогенез, и при длительном применении этого вещества обработанная ткань утрачивает способность к корневому морфогенезу.
Корнеобразующая активность синтетических ауксинов стимулируется при совместном применении с ними витаминов, в частности аскорбиновой кислоты, которая в этом случае, вероятно, действует как антиоксидант, препятствующий деструкции ауксина.
|
|
Значительное стимулирование корнеобразования дает предварительная обработка маточных растений ретардантами. Этот эффект показан на многих культурах: землянике, картофеле, яблоне, вишне, смородине, крыжовнике и др. Во всех случаях обработка маточных растений перед срезкой черенков или выделение меристем приводила к лучшему формированию корневой системы растения. Объяснение этого факта может быть связано с рядом причин, наиболее вероятной из которых является антагонизм между ауксином и гиббереллином в их влиянии на процесс корнеобразования. Ретарданты, являющиеся антигибберел-линами, изменяют соотношение гормонов в растении в пользу ауксинов, стимулируя тем самым процесс ризогенеза.
Побегообразование.Органогенез побега главным образом контролируется другой группой фитогормонов — цито-кининами. Это показано на каллусной культуре практически всех растительных видов. Повышение уровня цитокинина в среде приводит к индуцированию закладки зачатков почек в каллусе. При направленном стимулировании формирования зачатков вегетативных почек в каллусе особое внимание следует уделять абсолютному уровню ауксинов и цитокининов в питательной среде и соотношению этих фитогормонов.
|
|
Внимания биотехнологов заслуживает альтернативность морфогенеза из каллуса: начавшийся корневой органогенез подавляет формирование зачатков почек и наоборот.
Рис. 6.8. Схема совместного дейст- вия ИУК (2мг/л) и кинетика в концентрации (мг/л): 0 (1), 0,02 (2), 0,5 – 1 (3), 5 (4) на орга- ногенез каллуса табака |
Участие цитокининов в регуляции органогеза у недифференцированной ткани каллуса табака было впервые показано Ф. Скугом и К.О. Миллером. В опытах с помощью ИУК и кинетина вызывали образование у каллуса корней и побегов. Причем дифференциация каждого из этих органов тре-
бовала определенных концентраций обоих фитогормонов (рис. 6,8).
344
Изменение концентраций цитокинина и ауксинина в среде позволяет направлять органогенез в сторону образования корней или побегов. Так, при концентрации ауксина 2 мг/л и кинетина 0,02—0,1 мг/л происходит ризогенез, а увеличение содержания кинетина в среде до 0,5—1 мг/л при неизменной концентрации ИУК вызывает образование стеблевых почек.
Одним из частных случаев побегового органогенеза, имеющим важнейшее значение для сельскохозяйственного производства, является клубнеобразование. Этот процесс блокируется ауксинами, что допускает проведение параллелей с органогенезом в каллусной культуре — как и в том случае, под действием повышенных доз ауксинов стимулируются корнеобразование и подавляется формирование клубней.
По мнению М.Х. Чайлахяна, получившим подтверждение других исследователей, фитогормональная регуляция клубнеоб-разования осуществляется гиббереллинами и абсцизовой кислотой (АБК) в следующей последовательности: сначала под действием гиббереллинов стимулируется образование и рост столонов, а на следующем этапе под действием АБК рост столонов прекращается, при этом они утолщаются и формируют клубень на столоне. Обработка растений картофеля АБК существенно повышает урожайность за счет увеличения массы клубня.
Гормональная регуляция каллусообразования. Один из основных этапов работы биотехнологов растений связан с получением каллусной ткани из дифференцированных тканей листа, побега, корня. Основа получения каллуса — дедифференциров-ка растительных клеток экспланта, их возврат в меристемати-ческое, пролиферирующее состояние. Для этого должно произойти следующее: 1) модификация тех элементов структуры клетки, которые мешают процессу деления (прежде всего — ис-тоньшение толстой вторичной клеточной стенки); 2) экспрессия генов, ответственных за процесс митоза.
Каллусообразование происходит в растительном мире довольно широко. Открытые раны растений способны достаточно быстро затянуться каллусной тканью, которая впоследствии дифференцируется. В подавляющем большинстве каллус образуется из меристематической ткани, главным образом камбия. При этом не возникает необходимость в модификации клеточной структуры.
При получении каллуса invitro часто применяется посадка экспланта на питательную среду с высоким содержанием синтетического аналога ауксина — 2,4-Д, который стимулирует процесс дедифференцировки. Механизм такого стимулирования можно объяснить регуляторными эффектами ауксина: актива-
345
цией протонной помпы и связанного с ним истоньшения клеточной стенки за счет эффекта «кислого роста», индукцией синтеза ряда ферментов, вызывающих частичный гидролиз клеточной стенки, а также индукцией репликации ДНК. Кроме того, следует отметить, что именно 2,4-Д способен также стимулировать деление клеток по способу действия цитокинина, стимулируя синтез нуклеиновых кислот.
При длительном пассировании каллусной ткани возможно ее перерождение в опухолевую, т. е. ткань, рост которой не контролируется организмом. Причина этого явления заключается в приобретении способности синтезировать фитогормоны (ауксины и цитокинины), необходимые для ее деления внутри себя, а не получать их от других органов. Опухолевая ткань в культуре invitro, не реагирующая на изменение концентрации фитогормонов во внешней среде, называется гормоннезависимой или «привыкшей».
Явление приобретенной гормоннезависимости существенно ограничивает возможности биотехнологии растений, поскольку клетки тканей, обладающие данным свойством, практически не способны к дифференцировке, а следовательно, и к регенерации целого растения. Изучение причин и механизмов приобретения гормоннезависимости крайне важно, поскольку может дать ключ не только к решению проблем сельскохозяйственной биотехнологии, но и к лечению онкологических заболеваний человека.
В норме клетки проходят митоз, после чего вступают в стадию G(), на которой и происходит дифференцировка и клетка приобретает специализацию. В случае опухолевых клеток в гор-моннезависимых каллусных тканях клетки бесконечно проходят клеточный цикл и не переходят к стадии G„. На примере прокариот (дрожжей) показано, что клеточный цикл строго контролируется геномом, Переключение блоков генов «cdc» включает ту или иную стадию цикла. Выход из клеточного цикла в стадию G0 контролируется специальными rest-генами. Механизм регуляции клеточного цикла у эукариот много сложнее и обусловлен связыванием ДНК с гистонами, белками-репрессорами, метилированием регуляторных участков ДНК и рядом других причин.
Среди генов, обеспечивающих клеточный цикл, важное место занимают гены ферментов синтеза фитогормонов — ауксина и цитокинина. В целом растении нет ни одного органа, где бы происходил синтез этих фитогормонов,— меристемы побега, продуцирующие ауксин, нуждаются в цитокинине, синтезируемым меристемами корня, и наоборот. Соответственно, ни одна меристема не может в норме обеспечить себя регуляторными веществами для бесконечного поддержания клеточного деле-
346
ния. Приобретение такой способности при длительном пассировании каллусной ткани делает ее бесконечно делящейся.
Возможные подходы к преодолению гормоннезависимости каллуса при длительном пассировании могут быть связаны с блокированием синтеза избыточного количества как фитогормонов, так и их рецепторов. Очень интересные результаты по индукции морфогенеза ауксиннезависимого каллуса табака получены немецкими исследователями, показавшими, что при введении в гормональную среду других фитогормонов — брассино-стероидов каллус приобретает способность к образованию эмбриоидных структур. Эмпирически был найден и другой путь повышения морфогенной способности каллуса при пассировании — включение в питательную среду азотнокислого серебра, блокирующего образование этилена.
Регуляторная подготовка материнских растений. Сравнительно новым направлением фиторегуляции в биотехнологии растений является подготовка маточных растений, позволяющая значительно повысить эффективность ряда операций. Впервые этот прием разработан в лаборатории регуляторов роста и развития сельскохозяйственных растений ТСХА для повышения приживаемости апикальных меристем картофеля и некоторых плодовых пород при их оздоровлении и микроклональном размножении.
Суть данного приема заключается в предварительной обработке материнских растений ретардантами, главным образом, хлорхолинхлоридом. При этом подавляется биосинтез гиббереллинов, что обусловливает некоторое сокращение осевого вегетативного роста. При пересадке на искусственную питательную среду такие меристемы гораздо лучше приживаются.
Улучшение приживаемости меристем при предварительной обработке маточных растений ретардантами, по-видимому, связано с изменением гормонального статуса в сторону подавления гиббереллинов, являющихся антагонистами ауксина при ризогенезе. Другим объяснением может быть тот факт, что при обработке маточных растений ретардантами образуется меристема более плоской формы, что обеспечивает больший контакт экспланта с питательной средой.
Наряду с достоинствами данного приема, следует отметить и весьма существенный недостаток — повышение вероятности заражения вирусной инфекцией.
Принцип предварительной обработки маточных растений для получения желаемых признаков культуры invitro можно использовать для снятия апикального доминирования и ряда других эффектов.
347
Получение трансгенных растений с измененным гормональным статусом. Процесс получения трансгенной растительной ткани с измененным фитогормональным статусом происходит в природе без вмешательства человека. В ходе эволюции у двух видов агробактерий ( Agrobacteriumtumifaciensи А. rizogenes ) сформировался очень интересный паразитический механизм, позволяющий им не только синтезировать необходимые белки, используя генетический аппарат растения-хозяина, но и обеспечивать постоянный приток пластических веществ, дедифференцировку и пролиферацию зараженных клеток.
Основа паразитического механизма агробактерий — введение в растительную клетку плазмиды, встраивающейся в хромосомную ДНК растения и содержащей наряду с генами специфических бактериальных белков (наполина и октапина) гены ферментов синтеза фитогормонов — ауксина и цитокинина. При этом уровень этих гормонов повышается, специализированная растительная клетка дедифференцируется и бесконечно делится, образуя галл при заражении A . tumifaciensи множество нитевидных воздушных корней при заражении А. rizogenes . Значительный интерес представляют новейшие научные данные, свидетельствующие о том, . что при внедрении плазмиды в геном растения-хозяина подавляется синтез фитогормонов, ранее присущих данной клетке.
На основе плазмид агробактерий созданы векторные системы для переноса генов в хромосомный геном растения.
В настоящее время работы в области генетической инженерии растений связаны главным образом с получением исходных форм, обладающих устойчивостью к гербицидам, патогенам или насекомым-вредителям. Такая достаточна узкая направленность обусловлена, в основном, двумя причинами. Во-первых, придание растениям вышеперечисленных свойств значительно сокращает необходимость применения ядохимикатов и следовательно, обеспечивает большую экологическую безопасность растениеводства; а во-вторых, уровень развития генетической инженерии растений сегодня позволяет вводить в растительный геном и добиваться экспрессии лишь крайне ограниченного числа генов.
В практике промышленного растениеводства бывает крайне важно получить растение не только высокопродуктивное и устойчивое, но и имеющее определенный характер роста, что делает его приспособленным к погодным и агротехническим условиям выращивания и сельскохозяйственной технике. Особое значение это имеет при механизации процессов уборки урожая. По всей видимости, в подобных ситуациях перспективно управлять фитогормональным статусом, увеличивая или уменьшая продук-
348
цию того или иного фитогормона за счет изменения «дозы» генов ферментов его синтеза или за счет замены промотора.
В связи с очевидной перспективностью создания растений с измененным фитогормональным статусом эта работа активно проводится во многих лабораториях мира.
Применение фиторегуляторов в биотехнологиях переработки растительной продукции. Фиторегуляторы применяются в других отраслях производства, основой которых является культивирование растений или переработка растительной продукции— в пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности. Так, при получении ячменного солода часто используют обработку прорастающего зерна гиббереллином, что повышает активность α-амилазы и обеспечивает более полное использование растительного сырья.
Современные биотехнологии получения ряда важных лекарственных и микробиологических препаратов включают в себя этапы глубинного культивирования клеточных суспензий. Как правило, фиторегуляторы являются необходимым компонентом питательных сред, а оптимизация их концентраций в среде способна значительно повысить выход необходимого продукта за счет изменений метаболизма.
Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 501; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!