Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций.
Наиболее часто при диагностике вирусных инфекций используют следующие методы:
1. Вирусоскопическое исследование;
2. Вирусологическое исследование;
3. Серологические методы;
4. Биологические методы
Вирусоскопия – обнаружение вириона в материале с помощью электронной микроскопии. На светооптическом уровне вирусы не видны, однако их можно визуализировать в виде внутриклеточных включений, которых в норме быть не должно.
Вирусологическое исследование – это культивирование вируса в куриных эмбрионах или в культуре клеток.
Факт инфицирования, т.е. факт наличия вируса в исследуемом материале, называется индикацией вирусов, а вот установление семейства, вида вируса – это идентификация, которую часто осуществляется методами иммунологии или молекулярно-генетическими (ПЦР).
Вирусы можно культивировать в организме восприимчивых животных, которых заражают вируссодержащим материалом различными способами в зависимости от тропизма вирусов (подкожно, внутримышечно, интраназально и т.д.). Наличие вируса у животных устанавливают по клиническим проявлениям, а также на основании реакции гемагглютинации (РГА), заключающейся в том, что многие вирусы могут склеивать эритроциты за счёт наличия гликопротеиновых шипиков.
Другой моделью культивирования вирусов является заражение куриных эмбрионов (5-10-дневные), причём факт заражения также устанавливают по клиническим проявлениям, а также по РГА, которую проводят с жидкостью, полученной из полости заражённого эмбриона.
|
|
|
Часто вирусы культивируют на культуре клеток. Этот метод был разработан Эндерсом 1949 году, а в 1954 году он получил Нобелевскую премию за технику культивирования вируса полиомиелита. Очень часто для культивирования используют эмбриональные клетки или опухолевые, поскольку они имеют очень высокий пролиферативный потенциал. Нередко культура клеток содержит несколько типов клеток: наряду с основными эпителиальными клетками пролиферируют и фибробласты. Это очень показательная смесь клеток, поскольку их морфология выраженно отличается: эпителиальные клетки полигональные, а фибробласты – вытянутые клетки.
Культуру клеток выращивают с соблюдением определённых условий:
- температурный оптимум – 36-38 
;
- асептические условия в специальной лабораторной посуде (пробирки, флаконы, чашки Петри);
- сложные питательные среды (чаще среда Игла), содержащие весь необходимый набор питательных веществ: белки, жиры, углеводы, витамины, а также буферные растворы для поддержания оптимального pH;
- для предупреждения размножения посторонней микрофлоры используют антибиотики.
|
|
|
По свойствам жизнеспособных генераций культуры клеток делят на следующие группы: первичные, перевиваемые и полуперевиваемые.
Первичные культуры клеток размножаются только в первых генерациях, т.е. выдерживают не более 5-10 пассажей после выделения из тканей. Их получают при обработке тканей (эмбриональных, опухолевых) протеолитическими ферментами.
Перевиваемые культуры клеток способны размножаться в лабораторных условиях неопределённо длительный срок, выдерживая многочисленные пассажи. Их получают часто из опухолевых тканей (например, клеточная линия HeLa), причём возможность использовать такие культуры десятилетиями – их несомненный плюс, но многочисленные мутации, появляющиеся в ходе множественных генераций, огранивают использование таких культур, в частности, их нельзя использовать для создания противовирусных вакцин.
Полуперевиваемые культуры клеток выдерживают порядка 40-50 пассажей. Эти культуры занимают промежуточное положение между предыдущими двумя. Их получают из диплоидных клеток человека, поэтому свой кариотип такие клетки в ходе пролиферации не изменяют, а достаточная во времени генерация позволяет использовать данные культуры как в диагностике, так и в создании вакцин.
|
|
|
О репродукции вирусов в культуре клеток можно судить по следующим эффектам:
- цитопатогенный эффект (ЦПЭ);
- образование внутриклеточных включений;
- образование бляшек;
- реакция гемадсорбции;
- цветная реакция
ЦПЭ – видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, возникающие в ходе репродукции вируса. Это изменения чрезвычайно многообразны: вакуолизация, деструкция митохондрий, сморщивание клеток вплоть до отторжения от стекла, укрупнение клеток с образованием многоядерного симпласта и т.д. Также при вирусном инфицировании в клетках можно обнаруживать включения, которых в норме быть не должно. Эти включения выявляются на светооптическом уровне, при этом включения предварительно прокрашивают анилиновыми красителями или флюорохромами.
Бляшки – это разрушенные участки клеток на фоне монослоя целых клеток, которые видны и невооружённым глазом: светлые пятна на фоне окрашенного монослоя.
Реакция гемадсорбции – способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, что позволяет применять эту реакцию для индикации вирусов даже без выраженного цитопатического эффекта. Механизмы реакций гемадсорбции и гемагглютинации сходны, поэтому можно проводить реакцию клеточной жидкости с эритроцитарной массой.
В культуру клеток можно добавить индикатор, который не окрасит культуральную жидкость, если клетки погибнут ввиду репродукции вируса. Но если этой репродукции не будет, то кислые продукты обмена приведут к изменению цвета среды, и это называется цветной реакцией.
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 354; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!