Метод выявления колиформных бактерий
9.1.1 Навеска и исходное разведение
Отбор навесок и приготовление исходного разведения - по ГОСТ 26669.
9.1.2 Инокуляция и инкубация
9.1.2.1 В зависимости от требуемых пределов выявления 
см 
жидкой пробы или см 
исходной суспензии при использовании других продуктов переносят в пробирку, содержащую 10 см 
обогатительной селективной среды двойной концентрации [см. таблицы 1а, 2а, 3а], когда 1 см 
10 см 
, или в пробирку, содержащую 10 см 
обогатительной селективной среды нормальной концентрации [см. таблицы 1б, 2б, 3б] , если 
1 см .
При испытании высококислотных продуктов для предотвращения резкого снижения рН (на 0,5 и более) питательных сред после внесения в них продукта или его разведения рН питательных сред доводят до допустимых значений с помощью стерильного раствора гидроокиси натрия, приготовленного по ГОСТ 10444.1, или при приготовлении питательных сред рН устанавливают выше заданного с учетом его последующего снижения при внесении продукта. Количество добавляемого стерильного раствора гидроокиси натрия или величину, на которую необходимо увеличить рН при приготовлении питательных сред, устанавливают опытным путем.
Допускается доводить рН до нейтрального значения с помощью стерильного раствора гидроокиси натрия в самом высококислотном продукте.
9.1.2.2 Пробирки с посевами в среду двойной концентрации (см. 9.1.2.1) инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.
|
|
|
9.1.2.3 Пробирки с посевами в среду нормальной концентрации (см. 9.1.2.1) инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если нет образования газа или помутнения, затрудняющего выявление газа, продолжают инкубацию еще (24±2) ч.
9.1.3 Подтверждение
9.1.3.1 Из пробирок (см. 9.1.2.2) после инкубации инокулируют петлей подтверждающую среду нормальной концентрации (см. 6.1-6.4). Посевы инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч, если нет образования газа, то продолжают наблюдение до (48±2) ч.
В качестве арбитражной среды используют бриллиантовый зеленый лактозный желчный бульон.
9.1.3.2 Повторяют процедуру, описанную в 9.1.3.1, для пробирок после инкубации по 9.1.2.3, в которых отмечено образование газа или помутнение, препятствующее выявлению образования газа, после (24±2) ч или после (48±2) ч инкубирования.
9.1.4 Оценка результатов
Возможные случаи оценки результатов приведены в приложении А.
Пробирки по 9.1.3.1 или 9.1.3.2, в которых отмечено образование газа после (24±2) ч или после (48±2) ч, считают положительными.
При выявлении колиформных бактерий отмечают присутствие или отсутствие их в навеске 
г или см 
продукта.
Метод НВЧ - определение количества колиформных бактерий
|
|
|
При определении количества колиформных бактерий по методу НВЧ высевают не менее трех последовательных навесок продукта и (или) его разведений, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз.
9.2.1 Навеска, исходная суспензия и разведения
Отбор навесок, приготовление исходного разведения и десятикратных разведений проводят по ГОСТ 26669.
Готовят достаточное число разведений по ГОСТ 26669, гарантируя, что все пробирки, соответствующие конечному разведению, покажут отрицательный результат.
9.2.2 Инокуляция и инкубация
9.2.2.1 Используют три пробирки для каждой навески продукта и(или) его разведения.
9.2.2.2 Стерильной пипеткой переносят в каждую из трех пробирок с одной из селективных обогатительных сред двойной концентрации [см. таблицы 1а, 2а, 3а] 10 см пробы, если она жидкая, или 10 см 
исходной суспензии при использовании других продуктов.
Каждую навеску продукта в трехкратной повторности высевают в среду двойной концентрации в пробирки размером 20х200 мм.
Соотношение между количеством высеваемого продукта и питательной средой двойной концентрации 1:1.
9.2.2.3 Другой стерильной пипеткой переносят в каждую из трех пробирок с одной из селективных обогатительных сред нормальной концентрации [см. таблицы 1б, 2б, 3б] 1 см пробы, если продукт жидкий, или 1 см 
исходной суспензии при использовании других продуктов.
Каждую навеску продукта и (или) его разведения в трехкратной повторности высевают в пробирки размером 16х160 мм.
Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1:10.
|
|
|
9.2.2.4 Каждое последующее разведение высевают в соответствии с 9.2.2.3, используя новую стерильную пипетку. Осторожно перемешивают инокулум и среду.
9.2.2.5 Пробирки с посевами в среду двойной концентрации (см. 9.2.2.2) инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.
9.2.2.6 Пробирки с посевами в среду нормальной концентрации (см. 9.2.2.3 и 9.2.2.4) инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если нет образования газа и/или помутнения, препятствующего выявлению образования газа, продолжают инкубирование еще (24±2) ч.
9.2.3 Подтверждение
9.2.3.1 Из каждой пробирки после инкубации по 9.2.2.5 инокулируют петлей подтверждающую среду (6.1б-6.4б). Посевы инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если нет образования газа и/или помутнения, то продолжают инкубирование еще (24±2) ч.
В качестве арбитражной среды используют бриллиантовый зеленый лактозный желчный бульон.
|
|
|
9.2.3.2 Повторяют процедуру, описанную в 9.2.3.1 для пробирок после инкубации по 9.2.2.6, показавших образование газа и/или помутнение после (24±2) ч или после (48±2) ч.
Допускается не проводить пересев на жидкую подтверждающую среду при явном газообразовании на жидких средах нормальной концентрации, считая при этом эти посевы положительными.
9.2.4 Оценка результатов
Возможные случаи оценки результатов приведены в приложении А.
Для каждой навески продукта и/или его разведения подсчитывают число пробирок, в которых обнаружено образование газа (положительные пробирки) после (24±2) ч и (если использовали) после (48±2) ч.
9.2.5 Подсчет и выражение результатов
Подсчитывают наиболее вероятное число, исходя из числа положительных пробирок в каждой навеске продукта и/или его разведении. По ГОСТ 26670 определяют НВЧ колиформных бактерий в 1 г или 1 см 
продукта.
9.3 Метод определения количества колиформных бактерий - подсчет колоний
9.3.1 Навеска и исходное разведение
Отбор навесок и приготовление исходного разведения - по ГОСТ 26669.
9.3.2 Инокуляция и инкубация
9.3.2.1 Для посева жидкого продукта и/или каждого разведения используют две параллельные чашки Петри. Переносят стерильной пипеткой 1 см жидкого продукта или соответствующего разведения в центр каждой чашки. При посеве жидкого продукта и/или каждого разведения в чашку Петри используют отдельную стерильную пипетку.
9.3.2.2 В каждую чашку Петри (9.3.2.1) наливают около 15 см 
одной из сред (6.5-6.7) температурой 44 °С - 47 °С. Время, прошедшее между посевом продукта и/или его разведения в чашку Петри и заливкой среды, не должно превышать 15 мин.
Аккуратно перемешивают инокулят со средой и оставляют смесь для застывания, для этого чашки Петри помещают на холодную горизонтальную поверхность.
В качестве арбитражной среды используют VRBL-агар.
Параллельно для контроля стерильности агаризованной среды в стерильную чашку Петри наливают приблизительно 15 см 
среды и инкубируют вместе с посевами.
9.3.2.3 После застывания среды в чашках Петри на ее поверхность наливают около 4 см 
использованной агаризованной среды (6.5-6.7) температурой 44 °С - 47 °С для создания второго слоя. Добавленная среда должна затвердеть, как описано в 9.3.2.2.
9.3.2.4 При определении колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды (6.5-6.7) по 0,1 или 0,2 см навески продукта или его разведения наносят на поверхность одной из этих сред, разлитых в две параллельные чашки Петри. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.
При применении метода мембранных фильтров по ГОСТ 26670 фильтры переносят на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, избегая образования пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
При посеве методом мембранных фильтров на них подсчитывают количество колоний и в том случае, если их менее 15.
9.3.2.5 Переворачивают крышкой вниз приготовленные чашки по 9.3.2.3 и 9.3.2.4 и инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.
9.3.3 Подсчет количества колоний
После инкубации по 9.3.2.5 отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний. Посевы просматривают и отмечают рост типичных и атипичных колоний.
На VRBL-arape типичные колонии колиформных бактерий пурпурно-красные диаметром не менее 0,5 мм, иногда окружены красноватой зоной преципитата (осадка) желчи.
На агаре с бриллиантовым зеленым и феноловым красным типичные колонии колиформных бактерий зеленоватые, окруженные яркой желто-зеленой зоной.
На среде Эндо типичные колонии колиформных бактерий от розового до красного цвета, часто с металлическим блеском.
Атипичные колонии отличаются от типичных по цвету и размеру. К атипичным относят также все типичные колонии, выросшие в результате ферментации сахаров, за исключением лактозы, содержащихся в пищевых продуктах. Такие колонии не будут принадлежать к колиформным бактериям.
Подсчитывают на агаризованных средах отдельно количество типичных и атипичных колоний.
9.3.4 Подтверждение принадлежности бактерий из колоний к колиформным бактериям
Отбирают не менее чем по пять атипичных и типичных колоний. Каждую отобранную колонию пересевают в пробирки с одной из жидких питательных сред, приготовленной по 6.1-6.4.
В качестве арбитражной среды используют лактозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью.
Рост с газообразованием при температуре (37±1) °С в течение 24 ч указывает на принадлежность бактерий из атипичных и типичных колоний к колиформным.
9.3.5 Подсчет и выражение результатов
Если при подтверждении типичных или атипичных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в четырех из пяти колоний, подтвержден рост колиформных бактерий, то считают, что все колонии, выросшие на чашке Петри (см. 9.3.3), принадлежат к колиформным бактериям. В остальных случаях количество колиформных бактерий определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству колоний, взятых для подтверждения.
Пересчет количества колиформных бактерий, определенного посевом в или на агаризованные среды, на 1 г (см ) продукта проводят по ГОСТ 26670.
Результаты определения количества колиформных бактерий и выявления их в определенной навеске продукта записывают по ГОСТ 26670.
9.3.6 Допускается также выявление колиформных бактерий проводить посевом в или на агаризованную среду при условии, что навеску продукта, в которой предусматривается выявление, возможно посеять по этому методу.
При выявлении колиформных бактерий посевом в или на агаризованную среду подсчета количества колоний не проводят.
Дата добавления: 2020-12-12; просмотров: 76; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!