Организация искусственного осеменения в полевых условиях

Перед выгоном в летний лагерь коров и телок иссле­дуют на инфекционные заболевания, вакцинируют в соот­ветствии с планом ветеринарно-профилактических меро­приятий.

Молодняк взвешивают, группируют по живой массе и развитию. Проводят диспансеризацию, обращая особое внимание на уровень развития. Восстанавливают утрачен­ную или неясную нумерацию. Индивидуальный инвентар­ный номер желательно выстричь большими цифрами на видном месте и подкрасить одним из стойких красителей или провести таврение с применением жидкого азота.

Летний лагерь представляет собой загон для обособ­ленного содержания животных различных возрастных групп. Один из вариантов такого лагеря представлен на рис. 63. По периметру загона устраивают кормушки с на­весами для подкармливания животных. Расчетная норма площади загона на одну голову — 18...20 м2. Для выделе­ния животных из общего стада каждый загон оборудуют малым предраскольным загоном на 10...15 голов, который, в свою очередь, переходит в раскол с шириной прохода 80 см. К нему примыкает передвижной пункт искусственного осе­менения (см. рис. 43). Для удобства передвижения его устанавливают на деревянной раме в виде саней с по­лозьями, оббитыми металлической полосой. Крышу по­крывают рубероидом или шифером. Стены окрашивают масляными красками светлых тонов. Пункт искусственно­го осеменения должен иметь лабораторную комнату и ма­неж с фиксационным станком со сквозным выходом. Ря­дом с пунктом оборудуют навес с кормушками для фикса­ции телок после осеменения (Пакенас и др., 1975)

В фасадной стороне лабораторной комнаты делают окно. У окна устанавливаются стол с микроскопом. В лаборатории должен быть шкаф для инструмента и медикаментов, сосуд Дьюара с хладоагентом для хранения спермы. На стене укрепляют календарь оператора по искусственному осеме­нению, полку для документации и специальной литературы.

Постоянное наблюдение за животными ведут пастухи. При проявлении первых признаков охоты записывают но­мера животных и время проявления начала охоты. Спустя 5...7 часов, с помощью раскола, этих животных выделяют и направляют на пункт искусственного осеменения. Осе­мененных животных выдерживают на привязи до конца

117

 

 

охоты. Если спустя 10...12 часов признаки охоты продолжаются осемене­ние следует повторить.

При искусственном осеменении коров и те­лок в полевых условиях (летние лагеря, частный сектор и другие места содержания) применяют специальный портатив­ный комплект оператора по осеменению животных (Осташко и др., 1990). (см. рис. 61). Рее ком­плектующие: растворы, инструменты и материа­лы размещены удобно для работы, с фиксацией их в специальном порта­тивном термостатирован­ном контейнере, имеющем ручку для переноса на короткие расстояния и ремень — для переноса на плече или закрепления при доставке транспортными средствами. В рабочем положении контейнер устой­чиво размещается на имею­щихся подставках на вы-

соте 50 см от уровня пола. Нижний термостатированный рабочий отсек контейнера закрывается горизонтальной перегородкой, одновременно служащей как для предохра­нения от перепадов температуры в нижнем отсеке, так и частью рабочего столика, на котором располагают и кре­пят ножницы, пинцет, корнцанг, скальпель и другие ин­струменты и материалы. В термостатированном отсеке размещаются подготовленные инструменты для введения спермы асептическим способом, раствор фурациллина и физраствор, влагалищные зеркала для коров и телок, кружка Эсмарха, аккумулятор тепла, все остальные ин­струменты и принадлежности.

Внутренняя поверхность откидывающейся верхней час­ти контейнера (крышки) имеет угубления для использо­ванных инструментов, емкости со спиртовыми тампонами,

118

мыльницы, пакетов с ватой, салфетками, полотенцем, перчатками и другими мелкими принадлежностями с при­способлениями для фиксации этих комплектующих. В ра­бочем положении крышка фиксируется и одновременно служит частью рабочего столика.

Все комплектующие подобраны из перечня поставляе­мых через систему "Зооветснабпром" и "Минмедбиопром" изделий. В пастбищный период возле каждого гурта дой­ного стада необходимо иметь раскол для отделения жи­вотных в состоянии половой охоты, станок для их фикса­ции с навесом, предохраняющим животных от осадков и воздействия прямых солнечных лучей, комнату летнего типа для размещения сосуда Дьюара и других необходи­мых материалов для работы оператора по искусственному осеменению.

Использование разработанного нами (Осташко, Кузне­цов, Павленко, 1990) асептического способа введения спермы и устройства для его осуществления позволяет ис­ключить микробный фактор при искусственном осемене­нии коров и телок в производственных условиях, приме­няя при этом сперму, загерметизированную в пленочной упаковке.

Принципиальной отличительной особенностью пред­ложенного устройства является возможность расчехления его стерильного наконечника после прохождения зоны, опасной для инфицирования одновременно с введением его в цервикалъный канал, что обеспечивается конструк­тивными особенностями устройства.

ОРГАНИЗАЦИЯ ОСЕМЕНЕНИЯ ЖИВОТНЫХ В ИНДИВИДУАЛЬНЫХ И ФЕРМЕРСКИХ ХОЗЯЙСТВАХ

Организация обслуживания животных индивидуальных и фермерских хозяйств может строиться по трем принци­пам.

Во многих странах обслуживание мелких хозяйств осу­ществляется по кольцевому принципу: техник-осеменатор, находящийся в штате центра или предприятия по ис­кусственному осеменению, ежедневно объезжает хо­зяйства, заявившие по телефону о наличии животных в состоянии охоты, обследует их и осеменяет.

Второй принцип — когда пункт искусственного осеме­нения животных устраивается в удобном для населения месте в соответствии с требованиями ветеринарного зако­нодательства и работает на хозрасчете как малое пред­приятие. Животные доставляются на пункт самим населением или техник осеменяет их непосредственно в местах содержания или на пастбище. Работа пункта и обеспече­ние его спермой контролируется региональным племен­ным предприятием.

Третий принцип, который применяется особенно ши­роко это принцип "делай сам". При этом хозяин или фер­мер может купить сперму, необходимые инструменты, ма­териалы и осуществить осеменение сам. Однако для реа­лизации этого принципа население следует обучить на се­минаре, рекомендовав мано- или ректоцервикалъный ме­тоды, как наиболее эффективные. При этом следует поль­зоваться готовыми стерильными одноразовыми инструмен­тами и спермой, расфасованной в герметические дозы — пайетты, облицованные гранулы или ампулы. Наиболее подходящим для этого принципа инструментом является описанный выше модернизированный полимерный сте­рильный инструмент одноразового применения (см. рис. 58).

 

ИСКУССТВЕННОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЗАРОДЫШЕЙ

ВОПРОСЫ ОРГАНИЗАЦИИ

Крупномасштабная селекция, ставшая возможной благодаря методу искусственного осеменения, позволила осуществить гигантский скачок в повышении эффектив­ности молочного и мясного скотоводства, продуктивность которого в целом ряде стран возросла за последние 40 лет в 3...5 раз. Метод искусственного осеменения в ското­водстве себя далеко не исчерпал, а в других отраслях жи­вотноводства он только начинает использоваться. Если в свиноводстве и овцеводстве метод искусственного осеме­нения уже находит производственное применение, то в птицеводстве, звероводстве, пчеловодстве, рыбоводстве и других отраслях только разрабатываются промышленные биотехнологии, сулящие немалую экономическую выгоду. Метод во многих странах прочно вошел в медицинскую практику, а его применение позволяет решать ряд соци­альных, экономических и этических проблем общества.

Серьезным подспорьем для повышения эффективности искусственного осеменения является метод искусственного оплодотворения животных, при котором в организм самки пересаживается не сперма, а готовый плод — зародыш. Метод трансплантации зародышей позволяет более эффек­тивно использовать генетический потенциал самки и вести селекцию гамет и зигот на основе оценки по качеству по­томства как самцов-производителей, так и самок-доноров женских половых клеток. Это позволяет фактически в 1,5 раза ускорить селекционнБШ процесс и добиться ежегод­ного повышения продуктивности стад на 15...20 %. При­мером эффективного использования этой системы се­лекции может быть Оснабрюккский центр по разведе­нию голштинского скота — Die Osnabrucker Herdbuch-Genossenschaft (Германия). Схема применяемого в этом центре селекционного процесса, который носит название ПОЭТ (полиовуляция и эмбриотрансплантация), приведе­на на рис. 64 и 65.

Как видно из рисунков, по этой системе из каждых 10 тысяч нетелей в 28-месячном возрасте ежегодно отбирают 100 лучших первотелок, которых в 31-месячном возрасте подвергают суперовуляции и осеменяют спермой лучших в мире быков-улучшателей. От отобранных из этой группы 70 доноров 40-месячного возраста получают 300 телят-трансплантатов, из которых 150 телок поступают на выра­щивание и включаются в следующий цикл селекции, а бычков от лучших коров-доноров отбирают для индивиду­ального доращивания и оценки как производителей. Семьдесят коров-доноров поступают на станцию оценки доноров для второй селекции. Их осеменяют в 42 месяч­ном возрасте. Конец тестирования доноров осуществляет­ся после второй лактации — в 50-месячном возрасте.

Отобранные от лучших доноров бычки поступают на станцию искусственного осеменения и в 14-месячном воз­расте спермой каждого из них осеменяют по 800 коров, после чего они поступают в группу "ждущих результатов оценки", где. находятся в течение 4 лет. После оценки бычков, занявших первое, второе и третье места, отбирают для селекционно-племенной работы, а остальных бракуют.

Работа одновременно с самцами и самками позволила создать биотехнологические методы длительного хранения зародышей, оплодотворения и селекции яйцеклеток in vitro, а также клонирования эмбрионов.

Научной программой сети координируемых МНПА "Эмбрион" исследовательских учреждений намечена разра­ботка нетрадиционных методов и техники индукции супе­ровуляции у доноров путем возбуждения их собственного механизма продукции фолликулостимулирующего гормона, криобиологии гамет и зигот, оплодотворения in vitro, мик­рохирургии и клонирования, а также развития искусствен­ного оплодотворения самок у различных видов. Проводи­мые в рамках этой программы обширные научные иссле­дования уже позволили создать оригинальную отечествен­ную технологию овотрансплантации, которая с успехом используется в различных странах.

Характерной особенностью Харьковской технологии искусственного оплодотворения коров является то, что все процессы, начиная от взятия зародышей у доноров и кон­чая трансплантацией их реципиентам, осуществляются в закрытой системе без непосредственного контакта заро­дышей с окружающей средой. Этой технологией увязаны в единой линии оригинальные методы, инструменты, среды, аппаратура и расходуемые материалы.

Для ее производственной реализации нами создана си­стема организации и разработаны проекты центра ово-трансплантации, а также производственной лаборатории по пересадке зародышей.

Проект центра овотрансплантации реализован в строи­тельстве в Белгороде при облплемобъединении "Белгород­ское", в Харькове — при Институте животноводства УААН. Начато строительство в Киеве при Институте разведения и генетики животных УААН, а проект производственной лаборатории овотрансплантации реализован в ряде об­ластей Украины и России — в Харьковской, в опытных хозяйствах Института животноводства "Украинка" и Кутузовка", в племзаводе "Червоный велетень", в совхозе им. Кирова, в Ахтырке Сумской области, Белгороде, Брян­ске, Курске, Казани, Томске и др., которые хорошо осна­щены, укомплектованы кадрами и успешно осуществляют свою деятельность. Вымыто десятки тысяч эмбрионов и

125

получено тысячи телят. В соответствии с предложенной нами системой организации селекционного процесса центр (лаборатория) овотрансплантации является основ­ным исполнителем и координатором работ по криокон-сервации и трансплантации эмбрионов в регионе, области. Эти подразделения размещают на базе институтов, опыт­ных станций, племпредприятий или племзаводов. В тех случаях, когда в отдельных хозяйствах работают пункты трансплантации, они координируют свою деятельность с центром или лабораторией трансплантации. Лаборатория овотрансплантации является предприятием закрытого ти­па, в связи с чем ее размещение, строительство и эксплуа­тация проводятся в соответствии с требованиями Ветери­нарного законодательства и нормативных руководств по проектированию, реконструкции и строительству живот­новодческих объектов. Один из вариантов помещения ла­боратории показан на рис. 66.

Лаборатория ведет работу по отбору коров-доноров и реципиентов, проводит гормональные обработки живот­ных, вымывает, оценивает, криоконсервирует и пересажи­вает эмбрионы, осуществляет зоотехнический учет исполь­зуемых в работе животных, обобщает результаты транс­плантации эмбрионов; обеспечивает иммуногенетический контроль телят-трансплантатов. В штате лаборатории — 11 человек, включая рабочих по уходу за животными. Техно­логические процессы этих центров и лабораторий описаны ниже.

 

ОТБОР ДОНОРОВ

При отборе животных-доноров учитывается их пле­менная ценность, состояние репродуктивной системы, общее состояние, возраст, благополучие хозяйства по ин­фекционным и инвазионным заболеваниям. Обычно в ка­честве доноров используют коров, проявивших высокую (не менее 220 % стандарта по породе) молочную продук­тивность при жирности молока не ниже стандарта породы. При этом обращают внимание на происхождение и про­дуктивность предков кандидата в доноры, поскольку это может иметь важное значение при определении ценности полученных зародышей.

Одним из важнейших критериев отбора является со­стояние репродуктивной системы животных. При клини-ко-гинекологическом обследовании методами ректальной пальпации и визуального осмотра обследуют отделы поло­вого тракта и яичники, чтобы исключить животных с цер-

126

гатом эндометритом, сальпингитом, фолликулярными «лютеальными кистами, гипофункцией и гипоплязией ттчников. Обращают внимание на состояние влагалища и Я львы По журналу техника-осеменатора устанавливают наличие безрезультатных осеменений, регулярность и про­должительность эстралъных циклов. Половой цикл должен быть в пределах 18...24 дней, с хорошим проявлением фе­номенов стадии возбуждения. Во время течки осматривают выделения, которые должны быть чистыми, без примеси крови и гноя. Специально исследуют состояние желтого тела яичника в разные стадии полового цикла.

Животных с нарушениями воспроизводительной функ­ции либо не используют вообще, либо лечат и затем ис­пользуют в зависимости от эффективности лечения. Одна­ко следует учитывать, что у животных, перенесших гине­кологические заболевания, обычно повышенный выход дегенерированных зародышей и яйцеклеток в сравнении со здоровыми коровами, не имевшими послеродовых ослож­нений.

Гормональную обработку доноров следует начинать не ранее 60-го дня после отела. Обычно ее проводят после 2...3 эстральных циклов.

Животные, выбракованные по причинам заболеваний конечностей, вымени и другим, не связанным с пораже­ниями генеративных органов, представляющие племенную ценность, могут быть использованы как доноры эмбрио­нов, но не во время развития заболевания, так как общее состояние организма животного может отразиться на ре­зультативности обработки.

По мнению большинства специалистов, возраст донора не имеет существенного значения. Так, в исследованиях J.F.Hasler et all. (1980) не установлено достоверных разли­чий по количеству полученных зародышей от животных голштинской породы в возрасте от 16 месяцев до 17 лет. Однако у коров старше 10 лет количество получаемых полноценных зародышей обычно снижается. Наиболее эмбриопродуктивны коровы, имевшие 2...4 лактации. При работе с первотелками следует иметь в виду, что после растела многие из них длительное время не проявляют половой цикличности, что не позволяет использовать их в обычные сроки. При определенных условиях в качестве доноров используют телок.

Как показали проведенные нами исследования (Сушко, 1989) на телках джерсейской и черно-пестрой пород 10...18-месячного возраста, приемлемый уровень эмбрио-продуктивности животными достигался на 14...15-м меся-

127

ЦС. У ЖИВОТИЫЛ UUJ1CC

выраженной супсровуляторной реакции выход нормальных эмбрионов колебался всего лишь в пределах 16...30 % об­щего числа полученных зародышей, а у телок 10...11-месячного возраста количество нормально развитых пол­ноценных эмбрионов равнялось 0,7±0,47 на одного доно­ра. В принципе, суперовуляцию у телок можно вызвать еще до наступления половой зрелости (Seidel et all., 1970-1971), однако число полученных оплодотворенных ооцитов при этом остается крайне низким. Поэтому такое исполь­зование телок носит лишь исследовательский характер.

Работа с донорами может вестись как в хозяйстве, ко­торому принадлежат данные животные, так и с последую­щим перемещением их на место расположения лаборато­рии. Поэтому отбор доноров должен производиться в хо­зяйствах, благополучных по вирусным, инфекционным и инвазионным заболеваниям.

Ввозимые животные дожны иметь ветеринарные свиде­тельства и пройти соответствующие ветеринарно-карантин-ные обработки.

 

ОСОБЕННОСТИ КОРМЛЕНИЯ И СОДЕРЖАНИЯ КОРОВ-ДОНОРОВ И ТЕЛОК-РЕЦИПИЕНТОВ

Кормить животных, используемых для трансплантации, необходимо согласно нормативам и зоотехническим требо­ваниям по кормлению племенного скота. Рацион должен быть обеспечен разнообразными качественными кормами с содержанием всех питательных веществ не ниже устано­вленных норм. Ежеквартально корма необходимо подвер­гать исследованию на их полноценность и токсичность в ветеринарных лабораториях. Корма растительного проис­хождения семейства бобовых, содержащие более 30 мкг на 1 кг сухого вещества фитоэстрогенов (изофлавина, гени-стеина, биоксанина, мирэстрола, кумэстрола и др.) долж­ны исключаться из рациона доноров и реципиентов. Предпочтение следует отдавать злакобобовым смесям. Ра­ционы должны быть сбалансированы по всем показателям, особое внимание необходимо уделить содержанию в них витаминов. Нельзя допускать белкового перекорма. Коли­чество концентрированных кормов не должно превышать допустимых норм. При снижении количества концентра­тов до 70...80 % нормы необходимо увеличить количество сена.

Животных доноров и реципиентов следует содержать в чистых, сухих, хорошо вентилируемых помещениях при температуре и влажности воздуха, отвечающих требова-

128

НИ-И-1»*----

летнее время — выпас на пастиищс. а ^т~^—-----------

территории для содержания скота следует выполнять все ветеринарные требования, предъявляемые к животновод­ческим предприятиям закрытого типа.

МЕТОДЫ ВЫЗЫВАНИЯ СУПЕРОВУЛЯЦИИ

Индукция суперовуляции у коров-доноров осу­ществляется при помощи гонадотропных гормонов в соче­тании с простагландином F^ или его аналогами. В на­стоящее время в животноводстве используют в основном два типа гонадотрогшнов: гонадотропин сыворотки жере­бых кобыл (ГСЖК) и фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). ГСЖК получают из крови кобыл с 40 по 130-й день жеребости. Гонадотропин имеет длительный (50...120 ча­сов) период полураспада в организме крупного рогатого скота (Schams et all., 1978), что объясняется наличием в его молекуле сиаловой кислоты. Достоинством ГСЖК являет­ся достаточность всего одной инъекции для вызывания суперовуляции, что позволяет сократить затраты труда и уменьшить стрессовое воздействие на животных. Актив­ность ГСЖК выражают в интернациональных (И.Е.) или мышиных (м.е.) единицах действия. Одна И.Е. эквива­лентна приблизительно 2,0...2,5 м.е. Обычная доза ГСЖК, применяемая для индукции суперовуляции, составляет 2500...3000 И.Е. Нередко фирмы производители дают свое название препарату. Так, некоторое время у нас широко использовался голландский ГСЖК — фоллигон.

Недостаток ГСЖК — в его высоких антигенных свойствах, что иммунизирует обработанных животных и делает проблематичным повторное использование доно­ров.

Фолликулостимулирующий гормон получают из гипо­физа животных, чаще всего свиней, или из мочи климак­терических женщин. Фолликулостимулирующий гормон имеет непродолжительный (около 6 ч) период полураспа­да. Поэтому его вводят в организм в течение 4...5 дней утром и вечером, с интервалом между инъекциями в 12 часов, с целью поддержания необходимой для суперовуля-Ции концентрации гормона в крови животного. Наиболь­шее распространение получили схемы вызывания суперо­вуляции с общей дозой 32 и 50 мг ФСГ со снижающейся дозировкой при последующих инъекциях. По мнению большинства исследователей (Elsden et all., 1978; Seidel et all., 1978; Boland et all., 1981), препараты ФСГ по эффек-

129

уровне с ГСЖК. Кроме того, препараты ч^1, в отличие от ГСЖК, не вызывают кистозных изменений в яичниках и не индуцируют выработку антител.

У нас хорошо зарекомендовали себя препараты ФСГ-П (США), Фолликотропин Спофа (Чехия), ФСГ-супер (Инсти­тут физиологии и биохимии питания с.-х. животных, г. Боровск, Россия). В наших опытах эти препараты обеспе­чивали получение по 11,7; 9,9; 10,4 желтых тел на донора при выходе полноценных эмбрионов 5,4; 4,2; 4,8 соответ­ственно.

Недостатком гипофизарных гонадотрогшнов является, как отмечалось выше, необходимость многократных инъ­екций. Нами (Осташко, Довгопол, Исаченко, 1992) разра­ботан специальный растворитель для ФСГ — препарат "Пролонгон", обеспечивающий депонирование препарата ФСГ и пролонгированное его действие. Пролонгон позво­ляет индуцировать у донора суперовуляцию после одно­кратного введения 39 мг ФСГ подкожно в область шеи. При этом достигалось получение 9,6 желтых тел на доно­ра, а выход полноценных эмбрионов составлял 4,2 на до­нора (рис. 67).

Общепринятые методики вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота предполагают введение через 48...56 часов после начала обработки гонадотрогшном про-стагландина F^ (30 мг) или его синтетического аналога клопростенола (0,5...1,0 мг). Признаки охоты проявляются через 2 суток. Наиболее широко используются в настоящее время как лютеолитические средства препараты Эстрофан, Ремофан (Спофа), Анипрост (Уфимский витаминный за­вод). Хороши также Энзапрост (Венгрия), Эструмат (Англия), Простин (США).

Ниже приводятся рекомендуемые схемы вызывания су­перовуляции у коров и телок-доноров эмбрионов (табл. 20).

Многие хозяйственники, организовуя работу по ово-трансплантации, опасаются, что лактирующие коровы после обработки на суперовуляцию снижают продуктив­ность. Следует сказать, что это снижение, как правило, не превышает 10 % и длится всего несколько дней.

ОСЕМЕНЕНИЕ ДОНОРОВ

Доноров осеменяют, соблюдая те же правила асептики, что и при искусственном осеменении обычных животных. Рекомендуется сперму вводить в краниальную часть шейки матки, применяя ректо-, мано- или визоцервикальный способы осеменения. При этом предпочтение отдается первому способу. Начинать осеменение следует через

130

---------- Схема N	----- • — День эстраль-кого цикла	Препарат	Время (кратность) введения	Доза
	8 ..12	ГСЖК	однократно	2500...3000 И.Е
	10.. .14	Клопростенол	утро/вечер 'через	0,5. ..1/0, 5 мг
			48 ч после инъек-
			ции СЖК
	8...12	ФСГ	утро/вечер	6/6 мг
	9... 13	ФСГ	утро/вечер	5/5 мг
	10. ..14	ФСГ	утро/вечер	3/3 мг
	11...15	ФСГ	утро/вечер	2/2 мг
				Всего — 32 мг
	10.. .14	Клопростенол	утро/вечер через	0.5. ..1/0, 5 мг
			48 часов после
			первой инъекции
			ФСГ
з	8. ..12	ФСГ	утро/вечер	7/7 мг
	9..-13	ФСГ	утро/вечер	6,5/6,5 мг
	10.. .14	ФСГ	утро/вечер	6/6 мг
	11...15	ФСГ	утро/вечер	5,5/5,5 мг
				Всего — 50 мг
	10. ..14	Клопростенол	утро/вечер через	0,5. ..1/0,5 мг
			48 часов после
			первой инъекции
			ФСГ
4	8... 12	ФСГ+Пролон-	Однократно	32.. .50 мг
		гон
	10. ..14	Клопростенол	утро/вечер через	0,5-1/0,5 мг
			48 часов после
			инъекции ФСГ

48...54 часов после введения простагландина. Используе­мая сперма должна иметь активность не ниже 4 баллов при температуре 38...40 °С, каждая доза должна содержать 10... 15 млн активных спермиев, а общая доза — не менее 50 млн. Доноров осеменяют 3...4 раза с интервалом 10...12 часов.

G.E.Seidel et all. (1978) рекомендуют осеменять доно­ров, вводя сначала две дозы через 12 часов после наступ­ления охоты, затем еще три через 12 часов после первого осеменения, а если охота продолжается, еще одну — через 12 часов после второго осеменения.

Оплодотворяемость яйцеклеток доноров может быть разной в зависимости от индивидуальных особенностей быка (Callaghan, et. all., 1980; Viller et all., 1981). В связи с растянутостью суперовуляции и многократным осеменени­ем доноров получаемые от них эмбрионы бывают разных стадий развития — от ранней морулы до поздней бласто-цисты, что не должно смущать специалистов. Если эти эмбрионы не имеют признаков дегенерации или повреж­дений, они пригодны для пересадки.

И»

131

В настоящее время при получении зародышей крупно­го рогатого скота применяется в основном нехирургиче­ский метод. Известно большое число инструментов для нехирургического извлечения эмбрионов. Используются жесткие металлические, эластичные полимерные и рези­новые инструменты. Наиболее известными устройствами являются катетеры германской фирмы "Руш Нойштадт" и французской — "IMV".

Нами (Осташко и др., 1980; 1989) разработан ряд ори­гинальных устройств для получения эмбрионов — 2- и 3-канальные катетеры (рис. 68, 69), не уступающие по своим характеристикам зарубежным аналогам. Трехканальное устройство (рис. 70) отличается тем, что имеет ряд съем­ных полимерных наконечников разной длины, подби­раемых в зависимости от размеров рогов матки животного. Двухканальный катетер (рис. 70) удобен тем, что имеет малый диаметр и легко проходит шейку матки. Трехка­нальное телескопическое устройство имеет цилиндриче­ский полый корпус из нержавеющей стали диаметром 6 мм, в котором располагается одноразовый эластичный катетер, выдвигаемый в рог матки через боковое отверстие и копи­рующий его кривизну изгиба. В корпусе имеется третий канал — для нагнетания воздуха в съемный эластомерный баллончик, служащий для запирания рога матки. Это устройство позволяет продвинуть конец катетера непо­средственно к месту локализации эмбрионов и полностью их извлечь из матки. Разработана закрытая система для подачи под контролем оператора и забора промывной сре­ды (комплект "Эмбрион" рис. 71), состоящая из полимер­ных емкостей и трубок одноразового применения. Пред­ложена специальная термокамера УАР-2-01 (рис. 72) для поддержания необходимой температуры и подачи промыв­ной среды во время получения эмбрионов (Осташко и др., 1987; 1988).

В качестве промывной среды чаще всего используется фосфатносолевой буфер Дюльбекко с добавлением 1 % феталъной сыворотки теленка, инактивированной лю-теальной сыворотки коровы или бычьего сывороточного альбумина. В среду вводят пенициллин из расчета 100 ед. на 1 мл раствора или другой антибиотик. В качестве про­мывной жидкости могут быть использованы и иные среды: Тироде, Хемса, № 199 и пр. Нами (Осташко, Дибиров и др., 1989) разработан стабилизированный солевой буфер СФСБ для вымывания эмбрионов, имеющий ряд преиму^ ществ. Налажено его производство. Это физиологический

132

D ЛАЗАЛ A A

U.J.VL V A ^ V^AJ

стабилизацией

давления, вязкости и т. д. ). При необходимости

можно вносить любые дополнительные компоненты ? Нтооотку крови, глицерин и пр.). СФСБ выпускается во £ конах емкостью 500 мл или в пакетах из полимерной снки, являющихся подающей емкостью к комплекту

 

эмбрионов производят на 7.. .8-й день пос-осеменения. За день до их извлечения произво-ат пекталъное исследование донора на определение уров­ня пеакции суперовуляции. Перед извлечением эмбрионов манеже для санитарной обработки производят очистку ттоямой кишки животного от каловых масс, обмывают и высушивают наружные половые органы и заднюю часть животного. Донора переводят в манеж для вымывания, Фиксируют в СТанке, дополнительно дезинфицируют зад­нюю часть и наружные половые органы, делают эгшду-ральную анестезию. Для этого корове вводят 5 мл 2 % рас­твора новокаина или его аналогов — медокаина, ксило-каина или 8... 10 мл 2 % прокаина. Затем приступают к из­влечению эмбрионов. При этом вводят одну руку в пря­мую кишку животного, захватывают шейку матки. Второй рукой вводят зачехленный катетер во влагалище животно­го, расчехляют его, проводят через цервикальный канал и направляют в один из рогов матки. В двухканальных си­стемах постепенно удаляют стилет, продвигая катетер в глубь рога матки. В трехканальном катетере в канал рога матки подается специальный гибкий зонд. Достигнув не­обходимой глубины (передняя треть рога матки) в элас­тичный баллон нагнетают 10... 12 мл воздуха. Подсоединя­ют одноразовую систему — комплект "Эмбрион", разме­щенную в термокамере устройства УАР-2-01 (рис. 72). Прием и подачу промывной среды при использовании двухканального катетера регулируют зажимами, перекры­вая приемную или подающую емкость. Термостат УАР-2-01 оборудован герметичным цилиндром, в котором подве­шивается подающая емкость. Оператор может ногой под­качивать в этот цилиндр воздух и регулировать интенсив­ность подачи промывной среды под контролем манометра. При использовании трехканального катетера промыв­ная среда двигается самотеком из подающей емкости в катетер и верхушку рога матки, а в дальнейшем в прием­ную емкость через гибкий зонд катетера.

Для полного удаления промывной среды проводят ма­нипуляции с рогом матки — легкий массаж и расправле­ние в сторону верхушки ее рога. Для промывания одного рога матки расходуют 400.. .500 мл среды. Объем среды

133

после промывания должен быть равен объему до промы­вания.

При промывании другого рога матки повторяют ту же процедуру. После окончания работы в матку животного вводят раствор антибиотиков (суммарная доза 1 млн И.Е.).

Эффективность извлечения эмбрионов колеблется в пределах 75...80 % числа желтых тел и в значительной сте­пени определяется навыками исполнителя. Применение закрытой системы позволило увеличить выход эмбрионов на 16 % и достигнуть 96 % получения стерильных смывов (и=1102).

ПОИСК И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ

Температура в лаборатории для работы с эмбрионами должна быть 20...25 °С. За три часа до начала работы по­мещение обрабатывают ультрафиолетовыми лучами при помощи бактерицидных ламп, которые устанавливают из расчета 1 Вт на 1 м . Приемные емкости подвешивают на специальном лабораторном штативе для седиментации и обрабатывают 70° спиртом. Длительность оседания эм­брионов — 15...20 минут.

По окончании седиментации нижнюю часть приемной емкости (эмбриоприемник) перепаивают термозажимом и ножницами отсекают от приемной емкости (см. рис. 18). Через прозрачную стенку эмбриоприемника производят подсчет эмбрионов и их предварительную оценку под микроскопом. При необходимости, например если вымы­вание эмбрионов проводилось в полевых условиях в пере­движной лаборатории, эмбриоприемник с эмбрионами транспортируют. Если транспортировка эмбрионов зани­мает более 2 часов, эмбриоприемник охлаждают до О °С погружением в тающий лед. При О °С эмбрионы могут храниться в эмбриоприемнике до 48 часов.

Для извлечения эмбрионов из эмбриоприемника его нижнюю часть, незаполненную средой, отрезают ножни­цами так, чтобы до среды оставалось не менее 1 мм. Затем среду с эмбрионами выдавливают в чашку Петри диа­метром 90 мм. Поиск эмбрионов, а также другие манипу­ляции проводят под микроскопом МБС-9 или МБС-10 под увеличением 14 или 28 (1x14 или 2x14). Для поиска эм­брионов в слизи используют гистологические иглы. Все работы с открытыми эмбрионами ведут на столе лaминapJ ного шкафа, в который постоянно подается стерильный

134

воздух, что позволяет предотвратить микробную контами­нацию.

Обнаруженные эмбрионы пересаживают пастеровской пипеткой или 1 мл шприцем с полимерной иглой в чашку Петри диаметром 40 мм. В качестве среды для кратко­срочного хранения эмбрионов при комнатной температуре используют 20 % раствор феталъной сыворотки (ФС) в фосфатносолевом буфере Дюльбекко или СФБ. Необходи­мо следить, чтобы при переносе зародышей не возникали пузырьки воздуха. При этом капилляр пастеровской пи­петки или иглу шприца полностью заполняют средой. Для замораживания, краткосрочного хранения, микрохирургии и пересадки используют эмбрионы хорошего и отличного качества. Оценку их проводят при увеличении в 100—200 раз по общепринятым методикам на микроскопах МБИ-15, МБИ-13, МР-13, МР-17 и др. При этом контролируют состояние зоны пеллюцида, равномерность размещения бластомеров, отсутствие зернистости в цитоплазме, харак­тер содержимого перивителлинового пространства, соот­ветствие стадии развития эмбриона его возрасту и пр.

Полноценные эмбрионы имеют шарообразную форму, не поврежденную прозрачную оболочку, одинаковые бласто-меры с четкой плазматической оболочкой и светлую гомо­генную цитоплазму.

Количество бластомеров у развивающегося зародыша ежесуточно удваивается и на 4...7-й день они достигают стадии ранней морулы, на 7...8-й день — ранней, а на 9...10-й поздней бластоцисты. На 10...11-е сутки эмбрион выходит из прозрачной оболочки.

П.Кауффольд, И.Тамм, И.Ф.Шихов и др. (1990) дают наиболее развернутую систему оценки эмбрионов, которую мы рекомендуем использовать при практическом примене­нии метода овотрансплантации.

u Характеристика стадий развития эмбрионов с 6-го по °-й день, разработанная этими авторами, приведена в табл. 21, которая может быть использована при оценке ЭДбрионов в центрах и лабораториях овотрансплантации. *Фоме того, для ориентировки приводятся схемы и рисун­ки различных стадий развития эмбрионов, а также различ­ных форм их патологии.

После оценки пригодные к использованию эмбрионы

трижды отмывают стерильным 20 % раствором ФС в ФСБ.

эмб °псрацию проводят, последовательно пересаживая

РИОНЫ из капли в каплю. При всех манипуляциях контро-

135

Ст;шия развития		назва­ние		Число клеток		Диаметр, мм		Признаки
Ранняя		__		2. ..16		0,14. ..0,17		Круглые или овальные
стадия								бластомеры
дробления								в неплотно организован-
								ном клеточном теле
Морула:								Компактная стадия —
								разная степень упрочне-
								ния связи клеток в заро-
								дышевом теле
ранняя		Mol		>16...>32		0,14. ..0,17		Начало уплотнения:
								бластомеры круглые, каж-
								дый из них различим
поздняя		Мо2		>32...>64		0,14. ..0,17		Завершение уплотнения:
								компактное клеточное
								тело, по периферии мож-
								но видеть отдельные
								бластомеры, набухание
								свободной поверхности
Бластоциста:								Дифференцировка на
								эмбриобласт, трофобласт и
								полость бластоцисты,
								объем изменяющийся;
								иногда наблюдается ежа
								тие бластоцисты (похожа
								на Мо2)
ранняя		Бла!		>64...>130		0,14. ..0,17		Похожа на позднюю мо-
								рулу с маленькой, чаще с
								трещинообразной эксцен-
								тричной полостью бласто-
								цисты, которая увеличи
								вается в размере при на-
								личии ПВП. Эмбриобласт
								и трофобласт плохо разли-
								чимы
экспанди-		Бла2а		>64...>130		0,14. ..0,20		Прогрессирующая диффе-
руюшая								ренциация. Эмбриобласт
								темный, четко обозначен-
								ные клетки трофобласта
								очень плоские, ПВП пол-
								ностью вытеснено расши-
								рившейся полостью блас-
								тоцисты
полностью		Бла2		>130...>20		0,18. ..0,22		Такая же, как ц экспаиди-
чкснанди-		б		0				руюшая, однако большего
рованная								размера, растянута ЗП,
								толщина клеток уменьше-
								на
Стадая раяяпя*	крап» назва­ние		Число клеток		Диаметр, мм		Признаки
вылупляю­щаяся	БлаЗ		>200		0,18. ..0,22		Такая, как и экспандиро-ваяная, однако ЗП с рас­щелиной, часть тела заро-
вылупив­шаяся	Бла4		200...800		0,20...0,80		дыша вышла наружу Форма шарообразная. Эмбриобласт и трофобласт ясно различимы. Полость б.тастошсты в разных
							состояниях — от
							спавшейся до
							раздутой, ЗП отсутствует

лируют количество эмбрионов, четкость идентификации, маркируют чашки Петри и т.п. После выполнения опи­санных выше манипуляций пригодные для транспланта­ции эмбрионы расфасовывают в пайетты и используют при пересадке. Нами (Осташко и др., 1988) разработана конструкция и налажен выпуск плоских пайетт, обеспечи­вающих хорошую видимость эмбриона под микроскопом (рис. 73). Каждую пайетту маркируют с помощью поли­мерных пробок нашей конструкции. Все данные об эм­брионе фиксируют в соответствующем журнале.

Интервал времени между получением зародыша и на­чалом следующего технологического этапа (краткосроч­ного хранения, криоконсервации) не должен превышать двух часов.

КРАТКОСРОЧНОЕ ХРАНЕНИЕ ЭМБРИОНОВ

Краткосрочное хранение целесообразно, если рассин-хронизация между стадией развития эмбриона и половым циклом реципиента не превышает 1,5 суток.

^Для краткосрочного хранения эмбрион заправляют в пайетту следующим образом: насасывают 20 % раствор ФС в ФСБ или СФСБ на длину 30...45 мм, затем воздушный пузырек на 5... 10 мм, 20 % раствор ФС в ФСБ (на 20...30 мм) с эмбрионом, опять воздушный пузырек — 5... 10 мм и оставшееся пространство заполняют 20 % раствором ФС в ФСБ. Для заправки среды и эмбриона используют 1 мл полимерный шприц, который соединяют с пайеттой с по­мощью полимерной трубки. Забор эмбриона в пайетту проводят под микроскопическим контролем.

137

 

щают в полиэтиленовую трубку диа­метром 3,8 мм и герметизируют с помощью термозажима или прибор а "Молния".

Для хранения эмбрионов при 0 °с используют ледяную баню, смешивая растолченный лед с дистиллирован­ной водой в соотношении 1:1. В ка­честве емкости используют бытовой термос. При О °С возможно хранение зародышей в течение двух суток. Перед использованием пайетты вынимают из ледяной бани, извлекают из полиэтиленового чехла и заправляют в инструмент для пересадки. Со времени извлечения пайет­ты из ледяной бани до пересадки не должно проходить более двух часов. В наших исследованиях (Осташко, Пе-соцкий, 1990) после пересадки 64 эмбрионов, сохраняв­шихся при температуре О °С, прижилось 32 (50 %).

МИКРОХИРУРГИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ЭМБРИОНОВ

В практике работы по искусственному оплодотворению коров и телок с целью увеличения количества получаемых потомков от высокоценных животных установлена воз­можность микрохирургического разделения эмбрионов на две половинки, а иногда даже на четыре части. Доказано, что из прижившихся частей эмбриона развиваются вполне полноценные потомки. При этом уровень приживляемости снижается незначительно.

К разделению допускаются свежеполученные хранив­шиеся при О °С или деконсервированные эмбрионы хоро­шего и отличного качества на стадии морулы, ранней, расширяющейся и расширенной бластоцисты. Перед раз­делением эмбрионы пересаживают в каплю 20 % раствора ФС в ФСБ на предметном стекле и помещают под микро­скоп. Устройство для цитохирургических манипуляций изображено на рис. 74.

Разделение проводят стеклянной иглой в плоскости симметрии зародыша путем раздвигания бластомеров при медленном надавливании иглы на зародыши. Нами разра­ботан способ микрохирургических операций на яйцеклет­ках и эмбрионах (Осташко, Безуглый, Гордиенко, 1990), отличающийся тем, что с целью повышения сохранности объекта и технологичности операции (извлечение эмбрио­нов из прозрачной оболочки, пересадка бластомеров, раз-

 

ление на части и т.п.) выполняются в гипертоническом оастворе непроникающих веществ с концентрацией 12 1 5 М в биологически полноценной среде. При этом эмбрион сжимается внутри зоны, что облегчает микрома-нипуляции при его разделении (рис. 75). Для пересадки используют половинки зародыша, которые заряжают в пайетты сразу после разделения. Более высокий уровень приживляемости разделенных эмбрионов достигается при предварительном заключении их в пустые прозрачные оболочки, которые заготавливают заранее.

ГЛУБОКОЕ ЗАМОРАЖИВАНИЕ И ДЛИТЕЛЬНОЕ ХРАНЕНИЕ ЭМБРИОНОВ

Замораживание эмбрионов по медленному режиму

Для криоконсервации эмбрионов технология пре­дусматривает использование как традиционного метода замораживания (Whittingham et all., 1972), так и прямого погружения в жидкий азот (Rail, Fahy, 1985).

При замерзании эмбрионов в их протоплазме образует­ся много льда, который может быть причиной либо меха­нического разрушения внутриклеточных органелл и цито-плазматической мембраны, либо осмотического шока в результате кристаллизации или рекристаллизации внутри­клеточной воды.

Удаление воды из клеток производится в диапазоне субнулевых температур. Во время кристаллообразования в суспензионной среде возрастает концентрация внеклеточ­ных растворов, давление паров воды внутри клетки и вода устремляется из клетки через цитоплазматическую мем-орану, что ведет к обезвоживанию бластомеров; при даль­нейшем замораживании крупные кристаллы внутри клеток Уже не образуются.

К настоящему времени впервые описанный D.G. wiiittingham et all., (1972) метод модифицирован, но его

139

основные требования остались неизменными: присутствие проникающих криопротекторов в процессе охлаждения; инициация (посев) кристаллизации льда при температурах ниже точки замерзания замораживаемой среды; медленное охлаждение (0,3 °С/мин), заканчивающееся при —40 °С; последующее погружение и хранение в жидком азоте.

Технологический регламент использования медленного режима замораживания предусматривает следующее.

Когда все эмбрионы от одного донора обнаружены и оценены, их подготавливают к криоконсервации, не ожи­дая окончания работ со смывами от других доноров. Перед замораживанием эмбрионы насыщают глицерином, ис­пользуя 1,2 М раствор глицерина в 20 % растворе ФС в ФСБ или СФСБ. Для приготовления такого раствора в асептических условиях к 1,1 г глицерина добавляют 9,12 мл 20 % ФС в ФСБ. Глицерин расфасовывают перед работой по 1,1 гв 10мл или 20 мл стерильные флаконы, гермети­зируют пробками и парафином и хранят до употребления в холодильнике. Насыщение эмбрионов глицерином прово­дят в одну ступень при комнатной температуре. Для этого эмбрионы от одного донора с соблюденим правил асепти­ки переносят в чашку Петри диаметром 40 мм с 1,2 М рас­твором глицерина на 7 минут. Процесс насыщения следует контролировать под микроскопом. При этом изменение объема зародыша (быстрое начальное уменьшение объема бластомеров и более медленное восстановление первона­чального объема при неизменных размерах зоны пеллюци-да) свидетельствует о целостности мембранного аппарата зародыша.

Насыщенные глицерином зародыши расфасовывают в пайетты для замораживания и пересадки. При этом набор сред проводят в следующем порядке: 0,75 М раствор саха­розы в 20 % растворе ФС в ФСБ, воздушный пузырек 2...3 мм; эмбрион в 1 М растворе глицерина в 20 % растворе ФС в ФСБ, воздушный пузырек 3...5 мм; оставшееся про­странство пайетты заполняют 0,75 М раствором сахарозы в 20 % растворе ФС в ФСБ.

При заправке эмбриона в пайетту необходимо следить, чтобы среда с глицерином находилась от края пайетты с пробкой на расстоянии 66±3 мм. Порядок размещения и количество сред указано на рис. 76.

Для приготовления 0,75 М раствора сахарозы к 2,7 г ее приливают 5 мл 20 % раствора ФС в ФСБ и растворяют, перемешивая содержимое стеклянной палочкой. После этого общий объем раствора доводят до 10 мл. Для удобства сахарозу заранее расфасовывают по 27 г в стерильные флаконы, имеющие отметку ддя объема 10 мл.

Установка для замораживания эмбрионов состоит из сосуда Дьюара, контейнера для пайетт, штатива для крепления контейнера на горловине сосуда Дьюара и термопар для уста­новки программы охлаждения (рис. 77, 78).

Пайетты с эмбрионами размещают в кон­тейнере для замораживания и опускают в гор­ловину сосуда Дьюара. Термоизоляционные свойства контейнера обеспечивают получение оптимального режима падения температуры.

Перевозят эмбрионы в транспортных сосу­дах Дьюара "ХТ-35" или "Х-5".

Оттаивают — перенося пайетту из канист­ры сосуда Дьюара в водяную баню комнатной температуры (20...22 °С).

После оттаивания содержимое пайетты пе­ремешивают встряхиванием. При этом среда в пайеттах должна перемещаться в сторону проб­ки.

Через 5 минут после смешивания сред эм­брионы оценивают микроскопически через прозрачную стенку плоской пайетты. Если же эмбрионы помещены во французские пайетты, в которых не представляется возможным оце­нить эмбрион через стенку, их содержимое выливают в чашку Петри и исследуют под микроскопом. Для пересадки пригодны непо­врежденные эмбрионы, имеющие нормальную морфологическую структуру. Возможно также использование эмбрионов с незначительными поврежде­ниями — разрывы одного или нескольких бластомеров, незначительные разрушения зоны пеллюцида.

После оттаивания зародыши необходимо использовать в течение 2 часов.

5-3-

141

Криоконсервация эмбрионов

путем прямого погружения

в жидкий азот

Технологический регламент по использованию сверх-быстрого метода замораживания эмбрионов предусматри-вает следующее (Грищенко и др., 1992; Осташко и др. 1994).

Оцененные эмбрионы подготавливают к криоконсер-вации, не ожидая окончания работ по извлечению их у других доноров.

Для приготовления эквилибрационной и заморажи­ваемой сред должны быть использованы только высокока­чественные СФСБ, ФСБ, ФС, глицерин и сахароза. Все работы проводят при комнатной температуре с соблюде­нием правил асептики.

Каплю (150...300 мкл) эквилибрирующего раствора (10 % глицерина на 20 % ФС в ФСБ) помещают в чашку Петри. С помощью полимерной или стеклянной пипетки, конец которой оттянут до объема 200...400 мкл, эмбрионы пере­носят в эту кашпо и выдерживают 10 минут. При этом можно наблюдать осмотическую реакцию: вначале эм­брионы всплывают в растворе, их цитоплазма сжимается, затем к концу 5...7-й минуты эмбрионы принимают перво­начальную форму и оседают на дно.

Раствор для замораживания готовят смешивая 30 % глицерина и 70 % 1 М сахарозы, приготовленной на пита­тельной среде (20 % ФС на ФСБ). Каплю раствора для замораживания (150...300 мл) помещают в чашку Петри с помощью описанной выше пипетки. Эмбрион, который прошел стадию 10-минутной эквилибрации, переносят в раствор для замораживания и заправляют в соломинку объемом 0,25 мл.

Во время смачивания пробки из поливинилового спир­та в процессе зарядки эмбриона в соломинку нужно до­биться максимально возможной пропитки пробки жид­костью. В противном случае во время погружения в жид­кий азот последний попадает в пространство между поли­виниловой и целлюлозной частями пробки и в дальней­шем это приводит к ее выстреливанию. После этого соло­минку закрывают промаркированной пробкой и погружа­ют в жидкий азот.

Вначале ту часть, в которой находится замораживаемая среда, а затем — часть соломинки вместе с пробкой.

Во время нахождения эмбриона в растворе для замо­раживания можно наблюдать ярко выраженную осмоти-

142

"

реакцию. Зона пеллюцида и цитоплазма эмбриона форму эритроцита. Это свидетельствует об ин-

нсивных дегидратационных процессах. Оттаивание эмбрионов проводят в водяной бане при 40 °С в

чение 5 секунд. При этом во избежание выстреливания Толивиниловой пробки во время погружения соломинки в П

0дяную

ее после извлечения из жидкого азота до

погружения в воду выдерживают на воздухе 3...4 секунды. Затем ножницами отсекают поливиниловую пробку, пред­варительно протерев место отсечения 70 % этиловым спиртом, и со стороны отсечения выдувают заморажи­ваемую среду с эмбрионами в каплю (150.. .300 мкл) 1 М раствора сахарозы, приготовленного на питательной среде (20 % ФС на ФСБ или СФСБ).

Удаление криопротектора производится на протяжении 7 минут. Осаждение эмбрионов на дно чашки Петри сви­детельствует о максимально возможном удалении глице­рина из бластомеров.

После этого эмбрионы переносят в питательную среду, заправляют в соломинку, как описано выше, и пересажи­вают реципиентам.

В 1991—1992 годах в рамках международной научно-производственной ассоциации "Эмбрион" проведено около 200 пересадок эмбрионов, замороженных прямым погру­жением в жидкий азот. Приживляемость при пересадках 114 таких эмбрионов составила 68 %, что находится на уровне показателей ведущих мировых центров по пересад­кам эмбрионов крупного рогатого скота. При проведении указанных работ нами (Осташко и др., 1992; Isachenko et, all., 1993) используются замороженные частицы тро-фобласта поздних эмбрионов, методика получения и крио-консервации которых описана ниже. Внесение в матку реципиента вместе с эмбрионом 2...3 частиц трофобласта способствовало повышению уровня приживляемости эм­брионов на 18.. .20 %.

ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ООЦИТОВ IN VITRO

Интенсивное изучение вопроса и создание технологий т^т°Д°ТВОрсния яйцеклеток in vitro, приемлемых для прак-

(Iritani' Niwa> 1977' Brackett et

ляютт    ^А. "Эмбрион" разработана технология, позво-

ток з к Получать Дополнительное потомство из яйцекле-

ский тых высокоценных животных. Весь технологиче-

процесс оплодотворения яйцеклеток in vitro можно

143

разделить на три этапа: извлечение яйцеклеток из яичнц-ков животных высокоценной породы и дозревание их дп стадии Метафаза—11, собственно осеменение спермо^ высокоценного быка, культивирование полученной зиготы до предимплантационных стадий.

Яичники доставляют в течение 3 часов при 4 °С или 18...34 °С в 0,9 % растворе NaCl с добавлением 300 мкг/мл канамицина.

Затем каждый яичник перед манипуляциями отмывают в струе стерильного 0,9 % NaCl с тем же количеством ан­тибиотика из расчета 50 мл на один яичник, зажимают в пинцет Кохера, помещают в 40 мм чашку Петри и острым скальпелем иссекают, начиная процесс с перфорации фол­ликулов. После окончания иссечения яичник омывают 20 мл 0,9 % NaCl с 300 мкг/мл канамицина и 1 ед./мл гепарина. Поиск ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) проводят под микроскопом МБС-9, МБС-10 (1x14; 2x14), для дозре­вания используют все ОКК за исключением тех, у которых полностью отсутствуют кумулюсные клетки или ярко вы­ражена фрагментация цитоплазмы.

ОКК помещают для дозревания на 24...26 часов в атмо­сфере с 5 % СО2 при 38 °С в среду 199 с 1 % термоинакти-вированной (56 °С, 30 мин.) астральной сыворотки коров с добавлением 6-106 фолликулярных клеток и гормонов фол-ликулостимулирующего (ФСГ, 1 мкг/мл) и лютеинизи-рующего (ЛГ, 2 мкг/мл) из расчета 10 ОКК на 300 мл сре­ды. По многочисленным литературным данным, в кулъту-ральную среду необходимо добавлять также прогестерон и 17р эстрадиол. Однако проведенные нами исследования (Isachenlco et all., 1994) показали, что при термоинактива­ции в течение 30 минут при 56 °С уровень стероидных гормонов (эстрадиол, прогестерон) практически не сни­жается, в то время как уровень гормонов-гликопротеидов (ФСГ, ЛГ) снижается практически до нуля.

Эстральную сыворотку получают по общепринятым ме­тодикам из крови обработанных на суперовуляцию коров, находящихся на ранних этапах течки (вытекание прозрач­ной цервикалъной слизи). Сыворотку расфасовывают по 0,5 мл в 1,5 мл полимерные емкости, замораживают и хра­нят в жидком азоте. Благодаря этому избегают снижения активности стероидных гормонов в сыворотке.

Фолликулярные клетки получают путем аспирации жидкости из фолликулов 1Ги III фазы зрелости и отмывки их в среде 199. Подсчет клеток проводят по общепринятой методике в камере Горяева. Через 24...26 часов культиви­рования начинается этап осеменения яйцеклеток in vitro.

144

1/ядацигацию спермы проводят с учетом данных J.S. Parrish ГМЛ984) с использованием гепарина. Оттаянную спер-et т двух-трех быков переносят в коническую пробирку с т^°3 0 мл среды 199 из расчета 1 млн живых спермиев на вменение одной яйцеклетки и проводят ее центрифуги-°пвание (2 мин., 200 g.). После этого собирают суперна-нт а на "пуговку" наслаивают 2,5...3,0 мл среды 199 и смешивают сперму со средой. Процедуру центрифугирова­ния повторяют еще 2 раза. Затем к среде со спермой до­бавляют 10 мкг/мл гепарина и в эту среду вносят на опло­дотворение ооциты. Процесс инсеминации проходит при t+38 5 °С в атмосфере с 5 % СО2. После оплодотворения зиготы переносят в среду 199 с добавками для дозревания до предимплантационных стадий. Свидетельством оплодо­творения яйцеклетки является наличие мужского и жен­ского пронуклеусов. Однако для определения этого часто требуется освобождение яйцеклетки от кумулюсных клеток и поэтому такое тестирование в практической биотехноло­гии не проводят. На 3...4-Й день после осеменения яйце­клетки или эмбрионы освобождаются от кумулюсных кле­ток, а свидетельством оплодотворения является наличие бластомеров. Именно в этот период из процесса выводятся неоплодотворенные яйцеклетки.

Известно, что в in vitro культивируемых эмбрионах раз­витие на стадии от 8 до 16 бластомеров замедляется или прекращается, то есть наблюдается так называемый "блок развития" (Thibault, 1966; Whight, 1981), что связано с "переключением" развития эмбриона с интрацеллюлярных на экстрацеллюлярные питательные вещества.

По нашим наблюдениям одной из причин этого явле­ния может быть израсходование эмбрионом запаса поляр­ных липидов, необходимых для роста и развития мем­бранного аппарата клеток, количество которых увеличи­вается в геометрической прогрессии. Наши расчеты пока­зывают, что площадь мембранной поверхности у двухблас-тового эмбриона больше в полтора раза, чем у зиготы, а четырехбластомерного — больше уже в два раза, у вось-мибластомерного — Б три раза и т.д. Кроме того интен­сивно начинает развиваться внутриклеточный мембранный аппарат различных органелл: митохондрий, лизосом и пр., а заласы пластического материала в желточном слое яйце­клетки млекопитающих очень ограничены. Это наталки-ает на мысль о необходимости обогащения кулътуралъных П5)ЛЯРНЫМИ липидами. Для этих целей подошел бы й Желток , являющийся специфическим материалом роста эмбрионов. При использовании желток необхо-

145

димо добавить в культурную среду в количестве 5...10 % отцентрифугировать для удаления желточных шариков и подвергнуть инактивации при температуре 67 °С в течении 60 мин.

Для стимуляции развития зиготы от стадии двух про-нуклеусов до поздних стадий довольно широко использу­ется сокультивирование с эпителиальными клетками (Eyestone, First, 1989; Fukui, 1989; Ellington et all., 1990 a,b-Boccart et all., 1991).

Помимо культивирования эмбрионов до поздних ста­дий эпителий яйцевода может быть также использован для поддержки активности и оплодотворяющей способности спермиев при оплодотворении in vitro (Pollard et all., 1991).

Разработаны и подробно описаны методики изоляции и культивирования эпителиальных клеток крупного рога­того скота (Ouhibi et all., 1989; Thibodeaux, 1991), а также фрагментов эпителия (Xu et all., 1992).

Имеются немногочисленные литературные данные по использованию деконсервированных после "конвекцион­ного" замораживания эпителиальных клеток, секреторная активность которых по сравнению со свежими практиче­ски не снизилась (Ellington et all., 1990). При конвекцион­ном способе отнятие тепла от замораживаемого объекта осуществляется благодаря пограничной конвекции моле­кул холодного газа и (или) жидкости.

Данные по изучению криоконсервации эпителиальных клеток конвекционным методом весьма ограничены. Что же касается метода криоконсервации прямым погружени­ем в жидкий азот, который нами успешно используется при замораживании аналогичных тканевых структур (фраг­ментов трофобласта) (Isachenko et all., 1993), таких данных не было вообще.

Поэтому нами были проведены исследования по разра­ботке упрощенной в сравнении с существующими методи­ками изоляции и криоконсервации эпителиальных клеток, заключающейся в следующем. На мясокомбинате отби­рают яйцеводы от нормально циклировавших животных с учетом морфологических особенностей яичников на любой стадии цикла и в течении 2 часов при 23 °С в 0,9 % NaCl с 300 мг/мл канамицина доставляют в лабораторию.

Каждый из яйцеводов после подсушивания путем лег­кого обжима между двумя листами фильтровальной бумаги с помощью зажатого в пинцет лезвия с длиной режушеи кромки 9... 12 см отделяют от сопутствующих тканей фибральной и утеро-тубальной части яйцевода, трижды ополаскивают в 0,9 % NaCl со 150 мг/мл гентамицина и

146

тают каждый в 35 мл пластиковую чашку Петри с 2 мл доме затем яйцеводы пинцетом прижимают ко дну чаш-средь • звием рассекают вдоль. После полного рассечения 101 И же лезвием соскабливают фрагменты эпителия. Затем удаляют из капли, а фрагменты эпителия яйцево-I) с использованием 0,25 мл соломинки и 2 мл переносят в 15 мл коническую пробирку с 5 мл "итагельной среды и дважды центрифугируют (2 мин., 200 g) удалением супернатанта и добавлением свежей питатель­ной среды. Третью отмывку ФЭЯ проводят не с центрифу­гированием, а с осаждением фрагментов эпителия в тече­ние 15 мин' Отбор ФЭЯ для сокультивирования с зигота­ми-эмбрионами проводят следующим образом.

Легким пощелкиванием пальцем по пробирке с осаж­денными ФЭЯ добиваются образования суспензии в пол­тора раза менее плотной, чем та, которая образовалась после осаждения. Из средней части суспензии с помощью О 25 мл соломинки и 2 мл шприца отбирают 20 мкл сус­пензии, в которой находится 25...35 ФЭЯ. Жизнеспособ­ность фрагментов контролируют по движению ресничек. В отобранной таким образом пробе содержится оптимальное количество ФЭЯ, необходимых для сокультивирования с ранними эмбрионами. ФЭЯ можно заморозить разрабо­танным нами методом прямого погружения в жидкий азот. При этом их переносят из питательной среды в 10 % гли­церин, выдерживают в нем 5 минут, а затем помещают в охлажденный до 4 °С верифицирующий раствор (25 % глицерина +25 % пропиленгликоля), заправляют в 25 мл соломинку и погружают в жидкий азот. Оттаивание прово­дят в водяной бане при 20 °С в течение 5 минут, выведе­ние криопротектора в 0,5 М растворе сахарозы в тече­ние 5 минут. Затем фрагменты переносят в питательную среду для их совместного культивирования с зиготой до тех пор, пока не разовьется эмбрион на стадиях от ранней морулы до бластоцисты.

МЕТОД И ТЕХНИКА ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ОТБОРА ГАМЕТ ПО ПОЛУ

т Известно (Bhatacharya, 1976; Amman, Seidel, 1982;

Ubbus, Johnson, 1988; et all.), что механизм индукции пола отомства у млекопитающих обусловлен наличием в муж-ких гаметах "X" или "У" хромосом, определяющих при таодотворении яйцеклетки, соответственно женский "XX"

сет »^Жско^ "ХУ" пол, так как женская гамета всегда не-

сг А ХрОМОСОМу. 12*

147

Образец

 

 

Многие исследовате ли (Шредер, 1936; 19б5~ Bhattacharya et аБ., 197?' Upreti, Riches, Johnson' 1988; Wachtel et all., 1988 и др.) пытались разделить популяцию спермиев на "X" и "У" — несуцще хромосомы группы путем электрофореза, седимен­тации, гравитации, им­мунной нейтрализации соответственно. Однако больших успехов не было достигнуто.

Тем не менее было установлено (Moruzzi J.F., 1979), что количество ДНК в спермиях, несу­щих "Х"-хромосому всегда больше, чем в спермиях, несущих "У"-хромосому. Эта разница для спермы хряков составляет 3,4 %, быков — 3,8 %, баранов — 4,2 % (Johnson, 1992). На основе этой разницы L.Johnson и S.Spring (1992) предложили метод предварительного отбора гамет по полу, позволяющий в 81...94 % случаев получать потомство же­лаемого пола. Этот метод заключается в том, что после окраски флюорохромом Hoechst Bisbenzimide H 33342 ли­шенные хвостов головки спермиев пропускают через по­точный цитометр, оснащенный лазерным сортером, прин­цип действия которого иллюстрируется рис. 79. Разделен­ные по полу головки спермиев используются для оплодо­творения яйцеклеток in vitro путем микроинъекции.

Таким образом, однозначно подтверждена хромосом­ная теория индукции пола потомства и сделаны первые шаги практической реализации этой теории. Мы считаем, что следующим шагом в совершенствовании предопреде­ления пола может быть создание неразрушающего метода и устройства, способных сориентировать собственное дви­жение спермиев в разные стороны в зависимости от про­центного содержания в них ДНК. Это позволило бы внед­рить его в практику крупномасштабной селекции в ското­водстве.

Не менее важным является определение пола эмбрио-их пересадки. Лучше всего техника этого метода ЙОБпаботана в лабораториях UNCEIA (Thibier, 1986). Суть ^ заключается в том, что путем биопсии от 7...8-дневных СГ<боионов отбирают по 5...8 клеток, которые подвергают-ЭМ электрофоретической сепарации ДНК и хромосомному °нялизу на наличие "X" или "У" хромосом.

По данным М. Nibart, G. Kohen, L. Esposito, P. Baudu, Т M Thuard, F. Desmettere и М. Thibier (1992), при массо­вом применении (n 622) метод позволяет получить 94...95,6 % правильных определений пола эмбрионов. При этом уро­вень приживляемости эмбрионов не снижается.

Следует отметить, что современный уровень достиже­ний в мировой биотехнологии в принципе уже позволяет использовать технологию крупномасштабной селекции в скотоводстве при размножении, конструировании и отборе желаемых генотипов в лабораторных условиях. Это может совершенно изменить систему и практику размножения животных, поставив ее полностью под контроль человека. Однако для практической реализации этого принципа не­обходимо создание специализированной биотехнологи­ческой промышленности по производству биологических сред, биологически активных соединений, гормонов, ин-терферонов, простагландинов, иммунологических реаген­тов, очищенных химических соединений, а также соответ­ствующей аппаратуры, инструментов и приборов.

Практика многих центров и пунктов овотранспланта-ции показала их полную зависимость от обеспечения их импортными материалами, средами, медикаментами, гор­мональными препаратами, а также инструментарием. По­этому эффективность внедрения этого метода в практику национального скотоводства будет определяться темпами развития национальной биологической промышленности.

ОТБОР РЕЦИПИЕНТОВ И ПЕРЕСАДКА ЭМБРИОНОВ

В качестве реципиентов используют интактных телок или молодых коров с проверенной способностью к опло­дотворению. К животным-реципиентам предъявляются те же ^требования, что и к донорам, за исключением племен­ной ценности.

Животные должны быть хорошо развитыми, живая масса телок - не меньше 350...380 кг в возрасте 16...18 Месяцев.

Нельзя использовать животных мелких пород для рансплантации им зародышей, полученных от доноров

149

КРУПНЫХ Пород, Ttui. JS.CLR. c»iw j^.»,.,^ ^------- _.г -„-.Aw

осложнений во время родов.

У отобранных кандидатов в реципиенты животны* синхронизируют охоту путем инъекции лютеолитических средств (Эстрофан, Ремофан, Анипрост). Инъецирую^, простагландин двухкратно с интервалом в 10... 11 дцС£ вводя по одной ампуле эстрофана (0,5 мг клопростенола)' Если планируется использование свежеполученных зароды, шей, охота реципиентов должна по времени совпадать с охотой донора, поэтому вторая инъекция клопростенола должна быть сделана животному-реципиенту в тот ^ день, что и донору во время обработки на суперовуляцию От точности синхронизации охоты донора и реципиента во времени зависит уровень приживления пересаженных эмбрионов. Одними из первых это установили L. Rowson R. Moor, R. Lawson (1969).

Допустимая асинхронность полового цикла донора и реципиента составляет ±1 день (Rowson et all., 1972).

При достаточном количестве животных реципиенты могут быть выбраны из числа коров или телок пришедших в спонтанную охоту.

Перед пересадкой зародышей реципиентов подвергают ректогенитальному исследованию, устанавливают наличие или отсутствие желтого тела в яичнике. Животные, не имеющие желтого тела, к пересадке не допускаются, не используются в качестве реципиентов также животные с патологией яичников и матки.

Перед нехирургической пересадкой животных фикси­руют в станке, а их прямую кишку освобождают от кало­вых масс. Санитарную обработку наружных половых орга­нов животных проводят путем обмывания теплой водой с мылом, с последующей дезинфекцией 70 % этанолом, сеп-тонексом или 2 % раствором диоцида. За 10 минут до пе­ресадки делают сакральную анестезию 2 % раствором но­вокаина в количестве 4...7 мл в зависимости от конститу­циональных особенностей. Животным с повышенной воз­будимостью вводят дополнительно мышечный релаксант (Рампун шш Комбелен) в дозе 0,4...0,7 мл или 0,7...1,0 мл, в зависимости от массы реципиента.

Для нехирургической пересадки эмбрионов используют различные инструменты. Широкое распространение полу­чили катетеры Кассу и его модификации (Boland et all., 1975, Sreenan, 1975; Hahn et all., 1976). Хорошие инстру­менты производит фирма "Руш Нейштадт". Оригинальные металлические, а также полимерные инструменты для пе­ресадки эмбрионов разработаны нами (рис. 80 и 81), изго­товлены их опытные партии.

150

_/\/WWV4^l

^^xSA^v^-vW"    '

_ основном в рог матки tt\ iu> !о стороны яичника с  [\— Желтым телом. Подготов-*7я заправку инструмен-я проводят в стерильном Ллксе с соблюдением пра-«ял асептики. Инструмент передают оператору не­посредственно перед пе-песадкой. Подготовленное и заряженное эмбрионом ^тройство в зачехленном виде вводят реципиенту во влагалище до церви-кального канала матки под ректальным контро­лем. Затем санитарный чехол прорывают и осто­рожно проводят инстру­мент через канал шейки матки в рог матки на глу­бину 7... 12 см. Осторож­ным движением, ректально, убеждаются в правиль­ности расположения го­ловной части инструмен­та в маточном роге. На­жимая на шток-толкатель (или баллон) вводят среду с эмбрионом в матку, после чего осторожно уда­ляют инструмент из поло­вого тракта. Успех транс­плантации во многом зави­сит от опыта специалиста. Многие авторы обращают вни­мание на неодинаковые уровни приживляемости, полу­чаемые разными специалистами (Schneider et all., 1980; Curtis, 1981). В целом же приживляемость зародышей ко­леблется в пределах 35...60 %.

Нестабильность результатов трансплантации побуждает многих исследователей искать пути повышения при­живляемости зародышей. Так, В.Ф. Довгопол (1988) сооб­щает, что одной из главных причин низкой приживляе­мости эмбрионов у крупного рогатого скота является за­раженность коров-доноров вирусом инфекционного рино-трахеита. Обработка в лабораторных условиях свежеполу-енных или деконсервированных эмбрионов 0,25 % рас-

 твором трипсина позволяет разрушить локализованный на поверхности эмбрионов вирус. В его исследованиях после трехминутной обработки из 45 пересаженных эмбрионов прижилось 27, или 60 %, а до применения обработки трипсином не удавалось получить ни одной беременности

Нами (Осташко, Исаченко, Сушко, 1993) разработан метод повышения приживляемости эмбрионов путем ис­кусственного увеличения в матке реципиента количества трофобластической ткани. Для этого получали 14...17-дневные зародыши, резали их трофобластическую трубку на фрагменты длиной 0,3...0,5 мм, криоконсервировали и хранили до момента пересадок (рис. 82, 83). Перед транс­плантацией в пайетту вместе с 7...8-дневными зародышами помещали, предварительно деконсервированные фрагмен­ты трофобластической ткани (ФТТ) — по три фрагмента на один зародыш. Контрольные пересадки выполняли без применения ФТТ. В матке животных ФТТ развиваются в трофобластические везикулы, которые, по-видимому, вы­деляют вещества, ответственные за взаимодействие плода с организмом матери. В наших опытах при пересадках свежих зародышей вместе с ФТТ прижилось 8 из 14 (57 %), а в контроле 6 из 15 (40 %). При трансплантации за­мороженных зародышей получено 24 стельности после 55 пересадок совместно с ФТТ (43 %). В группе, где не при­менялись ФТТ, получено 17 стельностей после 51 пересад­ки (33 %). После пересадок за животными-реципиентами ведут наблюдение, регистрируют пришедших в охоту. Че­рез 2,5...3 месяца после пересадки проводят ректогени-тальные исследования на наличие стельности, регистри­руют случаи абортов и устанавливают общее состояние организма животных.. Окончательно итоги работы подво­дятся по результатам растелов.

Для организации работ по заготовке и трансплантации эмбрионов непосредственно в хозяйствах Ф.И. Осташко, Н.Д. Безуглым и В.Н. Иващенко в 1989 году сконструиро­вана и изготовлена передвижная лаборатория овотранс-плантации (рис. 84). На шасси автомобиля КАМАЗ разме­щена собственно лаборатория для работы с эмбрионами от седиментации до замораживания и микроманипуляций. В прицепе оборудован манеж для работы с животным. В ла­боратории предусмотрено отопление, водо- и электро­снабжение. Лаборатория укомплектована холодильником, оснащена кондиционированием и стерилизацией воздуха, подъемником для животного и необходимой аппаратурой' инструментами и материалами. В стационарных условиях лаборатория подключается к внешней электросети.

152

КРИОГЕННЫЕ МЕТОДЫ И ТЕХНИКА, дрИМЕНЯЕМЫЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ

СРЕДСТВА ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛОДА

Лед

В народном хозяйстве в качестве источника холода на уровне температур, близтшх к О °С, широко применяется лед из обычной воды. Его физические свойства изложены в табл. 22.

В зависимости от состава растворенных в воде веществ физические свойства полученного из нее льда могут силь­но варьировать. На этом принципе построены методы по­лучения криогидратных смесей, температура плавления которых может колебаться в пределах от 0 до —40 °С. В табл. 23 приведены три состава криогидратных смесей, которые при необходимости могут быть использованы в лабораторной практике. Полный их список смотри в книге

Та&шца 22. Физические свойства водяного льда

Показатель

Удельная масса (плотность), кг/м3 коэффициент линейного расширения Уменьшение объема при таянии, % механическая прочность, кг/сму уплата плавления, ккал/кг теплоемкость, ккал/кг0 температура таяния при 760 мм рт. ст.

теплопроводность, ккал/м.час"

Р"УР°проводность, м2/час/а-103 ктрическая постоянная

Физические величины

8S0...920 0,000032

8

63,5

79,4

0,538

0°

1,93

3,89

3,7

153

Таблица JJ. Температура плавления неко­торых кряогидратных смесей

Химическая формула	Число весовых частей соли на 100 частей льда	Температура плавления
KN03 NaCl СаС12бН2О	11,2 82 20,6	—3 °С —21,5 °С -33,6 "С

Ф.С. Осташко "Глубп кое замораживание и дтГ тельное хранение спе мы производителей" (197Я\~ Каждая криогидр* ная смесь, которые ца~ зываются эвтектикамц' имеет свою температур^ плавления или эвтекти­ческую точку. £CJQJ

смесь многокомпо­нентна, она будет иметь соответствующее количество эв­тектических точек, а на графике таяния — соответствую­щее количество плато. Чаще всего в лабораторной практи­ке и в народном хозяйстве используется криогидратная смесь из хлористого натрия и льда, эвтектическая точка которой равна —21,5 °С. В практике искусственного осе­менения эта смесь применяется при определении осмоти­ческого давления криоскопическим методом.

Холодильные машины

В настоящее время как в народном хозяйстве, так и в лабораторной практике для получения холода наиболее широко применяются паровые компрессионные машины, с помощью которых можно получать температуру до —200 °С. Наиболее широко применяются фреоновые холодильные машины с замкнутым циклом, производство холода в ко­торых не сопровождается расходом хладоагента, а работа осуществляется в автоматическом режиме.

При получении необходимых для длительного хране­ния биологического материала температур в диапазоне — 75...—90 °С подбирают специальные низкокипящие фрео-ны и систему машин, работающих в каскадном или двух­ступенчатом цикле. Нами совместно с СКТБ "Укрторг-оборудование" сконструирован низкотемпературный гене­ратор холода с программным управлением (НГП-1), имею­щий камеру для замораживания емкостью 2,5 литра и для хранения биопродуктов — емкостью 50 литров. Генератор длительное время успешно эксплуатировался в лаборатор­ных условиях. В нем (рис. 85) использован принцип кас­кадного сочленения двух герметичных фреоновых работающих на фреоне 22 и фреоне 13 (Осташко, 1968; 1978).

Недостатком холодильных машин всех типов являете^ опасность потери биологического материала в случае о

154

электроэнергии, особенно в ночное время. По-К?1104е1холодильная камера генератора снабжена буферной этому ^ ^ теплоемким материалом, позволяющим в тече-емкос часов П0дцерживать необходимую температуру био-H**e * после выключения электроэнергии. Киевским «ПП "Холод" созданы образцы холодильной фреоновой ановки, автоматически поддерживающей в сосуде Дью-УСТ емкостью 20 литров постоянную температуру —135 °С /&аф Ивченко, 1995). Эта установка очень экономична, нкурентноспособна и перспективна для хранения спер-*?j и эмбрионов в хозяйствах.

Самым надежным способом бесперебойного поддержа­ния температуры хранения, особенно в условиях произ­водства, является использование твердых или ожиженных газов (твердой углекислоты, жидкого азота, жидкого гелия и пр.).

Сухой лед

Очень удобным и экономичным хладоагентом является твердая углекислота, которая при атмосферных условиях сублимирует, благодаря чему ее температура постоянно поддерживается на уровне —78,9 °С. Заключенный в хо­рошую теплоизоляцию, сухой лед способен длительное время поддерживать необходимую для сохранения жизне­способности замороженных биологических объектов тем­пературу. Этот хладоагент в свое время широко применял­ся в практике для длительного хранения спермы произво­дителей, однако с развитием дьюаростроения был вытес­нен технически более удобным жидким азотом.

Физические свойства сухого льда приведены в табл. 24, из которой видно: его теплота сублимации равна 137 ккал/кг, что значительно превышает соответствующий показатель ожиженных газов. Поэтому целесообразно вновь обратить­ся к исследованию этого источника холода для приклад­ной биотехнологии, в частности для хранения спермы в УСЛОВИЯХ молочно-товарных ферм при массовом примене­нии искусственного осеменения, как средства крупномас­штабной селекции, вместо жидкого. азота, который в несколько раз дороже и применение которого требует зна­чительно больших транспортных затрат и затрат энергии, чем при использовании твердой углекислоты.

Сухой лед очень удобен еще и тем, что его легко при-

отовить в лабораторных условиях из жидкой углекислоты.

^ля этого баллон с жидкой углекислотой устанавливают в

склонном положении краном вниз. На кран навинчивают

РУоку длиной 15...20 см диаметром 10... 15 мм, крепко

155

Таблица 24. Некоторые физические свойства сухого льда

Плотность	г/мл	-. >.3...1,5
Теплота сублимации Температура сублимации при	ккал/кг °С	"~— — ч 136,89 —789
760 мм рт.ст.
Холодопроизводительность при	ккал/кг	152
согревании до 0°

привязывают к ней мешочек из плотной двойной холщс вой ткани. Затем резко открывают вентиль на 2...3 обор0" та. Вытекая под большим давлением, жидкая углекислот" вследствие интенсивного испарения превращается в • сухой снег. Мешок следует обжать руками в перчатках, чтобы уплотнить • сухой снег. Из 30 литров жидкой углекислоты можно получить до 10 кг сухого снега. Смесь его со спир­том, помещенная в термос или сосуд Дьюара, может дли­тельное время поддерживать температуру около —80 °С вполне обеспечивающую длительное сохранение жизнен­ных параметров законсервированных биологических объ­ектов.

Ожиженные газы

Жидкий воздух. Синеватая жидкость плотностью от 0,87 до 1,13 г/см . Температура кипения —193,5...—183 °С в зависимости от концентрации кислорода или азота. Полу­чают жидкий воздух с помощью газово-холодильных ма­шин и используют для получения очищенных компонен­тов воздуха путем ректификации в специальных колонках. Жидкий воздух может быть использован для поддержания низкой температуры, но в связи с высокой концентрацией кислорода (21 %) способен образовывать взрывоопасные смеси, что существенно ограничивает возможности его производственного применения в качестве хладоагента.

Жидкий азот. Этот хладоагент широко используется в практике искусственного осеменения и в биотехнологии. Представляет собой прозрачную бесцветную жидкость плотностью 0,808 г/мл с температурой —195,7 °С (77,5 °К). Теплота испарения равна 47,7 ккал/кг, что в 2,9 Раза меньше, чем твердой углекислоты. Благодаря развитию отечественного дьюаростроения, уровень которого достиг мировых стандартов, стало экономически возможным ис­пользование жидкого азота в массовой практике крупно­масштабной селекции. Очень удобен тем, что является

156

нетоксичным газом и для его применения про-ййв*)ТНнность выпускает всю необходимую аппаратуру и ^иилен ws g СВязи с резким повышением цен, обус-оборУя° м экономическим и энергетическим кризисом, довлен шим нарОДНОе хозяйство многих стран, созда-захяест:у cgeperaIoinHx технологий, направленных на ис-яйб э ,|щИе более экономичных источников холода, в на-поДЬ1ее Время стало тематикой государственной важ-СТ°*Г 0 чем более подробно будет сказано ниже. Н°ЖиДКИЙ кислород. Иногда в лабораторной практике

родится использовать в качестве хладоагента жидкий ПР лород- Это голубоватого цвета жидкость плотностью ^14 г/мл, кипящая в атмосферных условиях при темпер а-iL-e __182,8 °С (90,19 °К). Теплота испарения равна 51 ккал/кг, что значительно выше, чем у жидкого азота. Од­нако кислород отличается высокой химической актив­ностью а в смеси с органическими компонентами (масло, уголь, глицерин и т.п.) образует взрывоопасные компози­ции. Поэтому при его использовании следует придержи­ваться особой аккуратности и чистоты. Следует также иметь в виду, что при использовании в качестве хладоаген­та жидкого воздуха или даже жидкого азота в первую оче­редь из него испаряется более летучий азот, а кислород при доливании емкости все время накапливается и может, в конце концов, достигнуть опасной концентрации. По­этому при длительном поддержании в емкостях низких температур с помощью указанных хладоагентов остатки жидкости, обогащенные кислородом, периодически следу­ет сливать.

Жидкий водород. Бесцветная жидкость с температурой кипения —252,8 °С (20,2 °К). Известен в твердом состоя­нии. Образует с кислородом и воздухом высокоэнергетиче­ские взрывоопасные смеси. При температуре этого хладба-гента жизненные структуры биологических объектов со­храняются хорошо (Осташко и др., 1972). В биотехнологии представляет интерес как хладоагент для лабораторных исследований.

Жидкий гелий. Бесцветная жидкость с температурой ожижения —268,93 °С (4,07 °К). При определенном давле­нии и температуре —272 °С может переходить в твердое с°стояние. Представляет интерес как хладоагент для полу­чения сверхнизких температур и исследования состояния живой материи в условиях отсутствия теплового расшире-ия и глубокого анабиоза вблизи абсолютного нуля, и безопасный хладоагент, однако работа с ним с высокими техническими трудностями.

157

 

РАЗВИТИЕ ДЪЮАРОСТРОЕНИЯ В УКРАИНЕ

Любая отрасль народного хозяйства может успецт развиваться только в том случае, если ее предприятия обеспечены современной технологией и в достаточной степени развиты смежные отрасли промышленности обеспечивающие эти предприятия новейшей аппаратурой' оборудованием, материалами и инструментами. Разработка биотехнологии репродукции сельскохозяйственных живот­ных на базе созданного в Харькове метода длительного хранения спермы производителей (Смирнов, 1949), совер­шившая переворот в практике генотипической крупно­масштабной селекции, потребовала прежде всего развития криогенной техники: производства жидкого азота, твердой углекислоты, портативных, транспортных и стационарных разновидностей сосудов Дьюара емкостью от нескольких литров до нескольких кубометров, аппаратуры для получе­ния, упаковки, замораживания, хранения и использования спермопродукции. Применение новой технологии позво­лило нам предложить новую систему организации крупно­масштабной селекции в скотоводстве Украины, в итоге была создана сеть племенных предприятий и объединений, охватившая все хозяйства.

Работу по развитию смежных отраслей промышлен­ности в Украине мы начали в 1958 году силами отдела биологии размножения и искусственного осеменения сельскохозяйственных животных института животновод­ства Лесостепи и Полесья Украины.

Первые модели биологических криостатов нами созда­ны в 1958 году на базе экспериментальных мастерских Харьковского физико-технического института при со­действии академика Б.Г. Лазарева. Они представляли со­бой медные 45-литровые сосуды Дьюара с диаметром гор­ловины 55 мм. Изоляция вакуумно-отражателъная с глуби­ной вакуума 1-10~5 мм рт. ст., поддерживаемого с по­мощью размещенного на дне внутреннего сосуда адсорб­ционного насоса из активированного угля (рис. 86). Сосуд оказался способным после одной заправки поддерживать температуру —196 °С в течение 10 дней. В дальнейшем работа велась в направлении создания более эффективной термоизоляции и более рациональной конструкции. Этому сосуду было дано название "Харьков-1".

В 1960 году была изготовлена модель сосуда "Харьков-2", в которой применена экрановакуумная изоляция, и "*-аР^ ков-3" с вакуумно-порошковой изоляцией. Эти модели поддерживали после одной заправки температуру жидк°

158

уясе в течение 12...15 суток. На основе этих разрабо-а3°Т и подготовленного нами предложения Совет Мини-Т°К Украины своим постановлением № 1223 от 30 июля года обязал нас совместно с Харьковским физико-ским институтом НАН Украины разработать необ-Д^1 промышленного производства транспортных стационарных емкостей техническую документацию, И торая была выдана Харьковскому авиационному заводу К°Тихорецкому заводу химического машиностроения уже в fo61 году. Этим же правительственным постановлением

ыделены необходимые для производства сосудов мате-алъ1. Институт животноводства Лесостепи и Полесья Украины был определен Головным предприятием по раз­витию отрасли криогенного сосудостроения для ис­кусственного осеменения сельскохозяйственных живот­ных а координатором работ назначен заведующий отде­лом'биологии размножения и искусственного осеменения животных Ф.И.Осташко. На Харьковском авиационном заводе был оборудован специальный цех промышленного производства сосудов для хранения и транспортировки спермы в жидком азоте (рис. 87). Была разработана модель сосуда "Харьков-5" (рис. 88) с вакуумно-порошковой изо­ляцией, в качестве которой -был использован перлит (вулка­ническое стекло) Калушского месторождения. Этот сосуд при тех же конструкторских параметрах поддерживал тем­пературу жидкого азота уже в течение 20...29 суток. Таких сосудов в 1962 году было изготовлено и отправлено пле­менным предприятиям 1000 штук. Так началось внедрение в практику скотоводства крупномасштабной генотипи­ческой селекции на основе длительного хранения спермы производителей, оцениваемых по качеству потомства.

В процессе этой работы нами была тщательно изучена эффективность различных видов вакуумной термоизоля­ции. Результаты исследований, проведенных в условиях промышленности, показали: на первых этапах развития отрасли наиболее целесообразным являлось использование вакуумно-порошковой изоляции с бронзовой пудрой. На этой основе была отработана модель сосуда "Харьков-15", который вмещал 48 литров жидкого азота и поддерживал

о температуру в среднем около 40 суток. Этот сосуд был Рекомендован Государственной комиссией для серийного производства.

по Харьковском заводе транспортного оборудования разв^ОИли специализированный цех, в котором и было ^, ернуго серийное производство сосудов вначале "Харьков-

' затем "Харьков-15" и целой гаммы других моделей

159

 

(рис. .89). Уже в 1966 году За вод перешел на выпуск сосупя модели "Харьков-30", Ко^ рый по своим техников эксплуатационным показате-лям приближался к лучцщ^ мировым образцам того вре-мени. Сосуд этой модели (рис. 90 и 91) емкостью 30 литров поддерживает темпера­туру —196 °С до 60 суток. Он имеет рациональное соотно­шение поверхности к объему, удлиненную горловину, Эк-ранно-вакуумно-гюрошковую изоляцию. Сосуд полностью выполнен из нержавеющей стали, отличается удобством в эксплуатации, высокой ггро.ч-ностью. На основе этой моде­ли были изготовлены первые сосуды со стеклопластиковой горловиной, что позволило увеличить срок поддержания в них' температуры жидкого азота до 100 суток после одной заправки. Одновременно с этим мы совместно с Харьковским физико-техническим институтом низких температур НАН Украины вели иссле­дования по созданию нового типа вакуумной суперизоля­ции, основанной на принципе множественного экранирования внутренней емкости сосуда алюминиевой фольгой или маиларом (терафталатная пленка, напыленная алюминием до зеркального блеска). Были сконструированы две модели сосудов емкостью 5 и 30 литров, которые имели стекло-пластиковую горловину и 50-слойный экран из алюминие­вой фольги, между слоями которой уложена стеклобумага. Сосуды были снабжены адсорбционными устройствами, а их межстенное пространство откачано до Ы(Г мм рт. с • Опытные образцы этих сосудов, поименованные "Харьков-5А" и "Харьков-30-В2", поддерживали туру жидкого азота соответственно 18 и 100 суток (рис.

На базе этой разработки был сконструирован пр ленный образец сосуда "Харьков-33" емкостью 33 который поддерживал температуру жидкого азота в ние 117 суток. Усовершенствование термоизоляции ^_ сосудов, улучшение вакуумной техники и вакуумн°и

160

Техническая характеристика сосуда "Харьков-34Б"

 

у<Н*л"^____- ------ — ---------                                     ....... ........... ------ " Гидравлический объем	л	35
„ полного испарения жидкого азота при Этических условиях (20 "С и 760 мм рт. ст.) Яез кассет диаметр горловины Количество кассет диаметр кассет Масса без кассет и азота Масса с кассетами и жидким азотом Материал сосуда - алюминиевый сшив Материал горловины -- стеклопластик Адсорбент — активированный уголь	дней не менее мм шт. мм кг, не более кг, не более	180 60 6 42 18 48

гиены позволило довести технико-экономические показа­тели сосудов до уровня международных стандартов. Спе­циальное конструкторское бюро завода транспортного оборудования при участии автора провело поисковую ра­боту, в результате которой разработан серийный образец сосуда "Харьков-34Б", который уже поддерживал темпера­туру жидкого азота после одной заправки в течение 180...200 суток. Технические характеристики этого сосуда приведены в табл. 25, а его внешний вид на рис. 93.

Этот сосуд в настоящее время является основным се­рийным промышленным образцом, которым укомплекто­ваны племенные предприятия Украины. Он экспортирует­ся в ряд зарубежных стран и имеет большой спрос в сельском хозяйстве, медицине, биологической промыш­ленности и в других отраслях народного хозяйства.

Одновременно с разработкой конструкций криогенных сосудов для эксплуатации в условиях пунктов искусствен­ного осеменения нами создавалась модель портативного сосуда малой емкости для работы техников-осеменаторов при кольцевой -системе организации искусственного осе­менения животных, а также модель специализированного транспортного сосуда для перевозки спермы от централь­ного хранилища на пункты искусственного осеменения животных.

Совместно с СКТБ транспортного оборудования нами

создан сосуд "Х-5" емкостью 5,2 литра, поддерживающий

температуру жидкого азота в течение 20...25 суток (см. рис.

)• Создана модель транспортного сосуда "Харьков-35"

' Костью 35 литров с диаметром горловины 100 мм с 10

^анистрами для размещения спермы (рис. 94). Он имеет

Лее пР°чную конструкцию, рассчитанную на длительную

161

Таблица 26. Техническая характеристика некоторых отечественных и бежных марок сосудов Дьюара для хранения и перевозки спермы

сгр

Марка	Емкость (л)	Диаметр гор­ловины (мм)	Время полного испарения жидкого азота (сутки)	Материал, из которого изготовлен сосуд	Изготовитель (страна и город)
СДС-5 СДС-20	6,5 21,5	75 75	15 50	АМЦ	Украина, Коростель
СДС-30	33	75	ПО		"
СДС-50	52	75	100		"
Х-5	5	60	21		Харьков
Х-34Б	34	60	180		"
Х-34БО	34	60	360		"
Х-35	35	100	100		"
RCB-5A	5	50	20		France
RCB-35A	32,5	50	240		"
Apolo
SX-34	35	50	200		USA

транспортировку по дорогам сельской местности, поддер­живает температуру жидкого азота в течение 102 суток. Эти модели поставлены на серийное производство, ис­пользуются внутри страны, а также экспортируются во многие страны.

Наряду с разработкой конструкций сосудов для хране­ния и транспортировки спермы мы разработали модель широкогорлого сосуда для лабораторных работ. Этот сосуд модели "Харьков-31" представлен на рис. 95. Он входит в комплект оборудования линии криоконсервации спермы по Харьковской технологии. В дальнейшем на базе этой конструкции был создан сосуд КС-40, который выпускает Коростенский завод химического машиностроения. В табл. 26 приведены технические характеристики некоторых отече­ственных сосудов в сравнении с лучшими зарубежными аналогами.

Следует заметить, что данные табл. 26 не являются ко­нечными и что совершенствование сосудов продолжается. Так, мировой рекорд в этом поставила французская фирма "Эр Ликид". Изготовленный ею сосуд ДХ-36А емкостью 30 литров и диаметром горловины 50 мм поддерживает тем­пературу жидкого азота после одной заправки в течение 360 суток. Этот рекорд продержался очень недолго и был превышен при .более тщательной вакуумной откачке сосу­да "Харьков-34Б", который имеет диаметр горловины на 10 мм больший, а гидравлический объем на 2 литр меньший, чем сосуд ДХ-36А.

Одновременно с развитием производства транспортнь сосудов для хранения спермы в жидком азоте нами с вместно с ОКБ Тихорецкого завода химического машин

162

 

пения были разработаны

° конструкции и изго-Йл°влены образцы стационар-тх емкостей для длителъно-^ ^ранения спермы на пле-х предприятиях с оценки быков по ка-еству потомства. Создано „ва типа низкотемператур-датх хранилищ емкостью 800 и 630 литров соответственно с двух- и одноэтажным по­воротным загрузочным уст­ройством. Эти хранилища (рис. 96) имели вакуумно-порошковую термоизоляцию. В серийное производство было принято хранилище ХСЖА емкостью 630 литров, кото­рое поддерживало темпера­туру жидкого азота в течение 130 суток (рис. 97). Изго­товленные еще в 1964 году, они с успехом используются уже в течение 30 лет. На основе полученных данных по эксплуатации этих емкостей были созданы современные хранилища спермы типа ХБ-05 и ХБ-0,2, которые серийно производятся Коростенским заводом химического маши­ностроения (см. рис. 42).

Подводя итоги 35-летней работы отдела биологии раз­множения и искусственного осеменения сельскохозяй­ственных животных Института животноводства УААН по развитию смежных отраслей промышленности, обеспечи- , вающей крупномасштабную селекцию криогенной техни­кой и современной технологией можно сказать: благодаря этой деятельности Украина избежала иностранной зависи­мости в вопросах технологии искусственного осеменения и криогенной техники. Более того, стала традиционным экспортером этой техники и технологии криоконсервации спермы в зарубежные страны и систематическим постав­щиком инструментов, сред оборудования для искусствен­ного осеменения и услуг типа инжиниринг. В процессе Развития этой отрасли большую помощь оказали Физико-ехнический институт НАН Украины (академики К.Д. Си­тников, Б.ГЛазарев, зав. лабораторией А.И. Судовцов),

13*

163

Физико-технический институт низких температур (ака мик Б.И. Веркин, руководитель КБ Р.С. Михальченк V руководители и специалисты Харьковского авиазаво Н.Ф. Корнилов, Б.А.ХОХЛОВ и П.Я. Юнашев, а также'зав^3 да транспортного оборудования Б.М. Акимов, Г.А. Щеп°~ кин, Е.А. Куц, В.И. Морозов, В.В. Деменко, Тихорецког' завода химического машиностроения, Технологическог° института общего машиностроения, Харьковского поли° технического института и др. Большую систематическую помощь оказывал бывший директор Института животно водства Лесостепи и Полесья Украины академик И.А. Ла" ниленко, который проявил недюжинные способности и энергию, глубокое понимание насущных задач животно­водства страны и исключительные качества Человека и ученого.

СИСТЕМЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КРИОГЕННОЙ ТЕХНИКИ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Способ загрузки криогенных сосудов хладоагентами. В

практике искусственного осеменения крупного рогатого скота для длительного хранения спермы быков, как прави­ло, используется жидкий азот, который доливают в .сосуд по мере испарения, но с таким расчетом, чтобы каждый раз в сосуде его оставалось не меньше одной трети. По­вышение температуры при хранении замороженной спер­мы не должно превышать определенный уровень, после которого в сперме индуцируются процессы рекристаллиза­ции в сторону укрупнения кристаллов замороженной тек­стуры, что может приводить к разрушению биологических структур. Изучение этого вопроса показало, что резкое по­вышение температуры замороженной спермы быков от —196 до —79 °С может вызывать некоторое снижение актив­ности спермы, но если этот процесс осущест-

вляется в замедленном темпе, такие изменения заметить трудно. В на-

-tfoh   /                                  шем опыте при ком-

бинированной загрузке со-_, суда "Харьков-5" твер-24 дой углекислотой и жид­ким азотом график повы­шения температуры спер­мы соответствовал изоо-раженной на рис. 98 кр

OS   !2  18

Месяцы

 

164

- Подвергнутая такому температурному режиму сперма в011' ъ была использована для осеменения коров и телок. В бь1*" ояыте из 672 осемененных коров и телок после пер-^° осеменения оплодотворилось 417, или 61,9 %, то есть,

1годотворяемость была на уровне использования незамо-оП^.еНной спермы (Осташко, Лопатко, 1965; Осташко, 1967). Р результаты этих исследований дают основание вер-uvj-ься к изучению вопроса о целесообразности использо-*ния разработанного нами метода комбинированной за-Б узки сосудов Дьюара двумя хладоагентами, применение второго позволяет снизить энергозатраты, по крайней мере, на порядок. Теоретический расчет базируется на применении основного уравнения теплопередачи с окру­жающей среды к внутреннему сосуду Дьюара:

Q = F-bh,                         (4)

8

е Q — количество тепла в Ккал (килокалории), пере­дающееся за время т в часах через поверхность F в м , при толщине слоя изоляции 5 в метрах и коэффициенте ее тепло­проводности А, —тёг!~г , при разности температур между

окружающей средой и внутренним сосудом А/ в градусах Цельсия.

Применяя выражение (4) к одному и тому же сосуду Дьюара, загруженному тем или иным хладоагентом, при­нимая время т за один час, получаем: Q •- А/, где знак -обозначает пропорциональность.

Потеря хладоагента в единицу времени из сосуда за счет его самоиспарения

* = Якг,                                (5)

г

где /• — удельная теплота испарения хладоагента, Ккал/кг. Подставляя значение А/ из выражения (4), получаем:

А'                                           t(.\

g = — •                                     (6)

(7)

Время полного испарения хладоагента из сосуда

т = -^час,

g

где ^гидравлический объем сосуда, м , у — плотность хла-Доагента, кг/м3.

Подставляя в формулу (7) g из выражения (6),' получаем:

•=•

165

Применяя это отношение к одному и тому же с загруженному хяадоагентом 1 или 2, получаем:

= у Л А/Л

Обозначив индексом сом 2

(9)'

твердую углекислоту, а инде* жидкий азот, произведем подсчет, во сколько время полного испарения углекислоты из одного и того сосуда будет больше времени полного испарения жидког азота. Приняв плотность твердой углекислоты не 1,4 кг/л° как в монолите, а 1 кг/л, так как при загрузке сухой ле дробится и слегается неплотно, получим:                      д

т, = 1,0-137-216-Х, _?£А, т2 ~ 0,804 - 47,7 • 99 • А.2 ~ ' А/

Однако такую разницу можно получить только в иде­альном случае, когда коэффициент теплопроводности изо­ляции сосуда (А) не зависит от температуры хладоагента Поскольку используемые в практике животноводства сосу­ды Дьюара снабжены адсорбционным насосом, где в ка­честве адсорбента используется активированный уголь эффективность его работы обратнопропорциональна абсо­лютной температуре. В связи с этим в выражение (9) нами введен коэффициент (А^) /(А2), который по данным экспе­риментов равен 0,31.

Оказалось, что сосуд Х-34Б поддерживает температуру жидкого азота минимум 180 суток, температуру сухого льда — 560, а смесь углекислоты с жидким азотом — в течение 761 суток, т.е. больше двух лет. В этих случаях дозаправку со­судов хладоагентами можно проводить соответственно че­рез 120...140 дней, 370...400 и 500...600 дней. Следователь­но, транспортные расходы в последнем случае будут в 4 с лишним раза меньшими, чем в первом. Кроме того, гради­ент температуры при использовании жидкого азота рав­няется в среднем 216 °С, в то время как при использова­нии сухого льда он равен в среднем 100 °С, т.е. поддержа­ние температуры —80 °С требует в 2,16" раза меньше энергозатрат, чем температуры —196 °С.

При такой системе эксплуатации сосудов Дьюара их заправка хладоагентом и доставка в хозяйства может осу­ществляться один раз в полтора года вместо одного раза в три месяца, что имеет место в настоящее время при за" правке сосудов одним жидким азотом. Это позволяет со­кратить транспортные расходы в шесть раз и затраты на поддержание необходимой температуры в сосуде тоже в шесть раз. Однако для перехода на новый вид хладоагент

166

доработать конструкцию сосуда и технологию Xs узки твердой углекислотой и жидким азотом. Мыслит-3 это так. На племенных предприятиях сперма заморажи-СЯ тся и хранится в жидком азоте, как по Харьковской ва^нологии. В хозяйстве же сперму направляют в модерни-Т6оованных сосудах Дьюара, заправленных двумя хладоа-3 нтами — жидким азотом и твердой углекислотой. Для

ПреДеления остаточного количества хладоагента в сосуде "оследний периодически взвешивают. После окончания

рока испарения хладоагентов сосуд заменяют свежеза­правленным. Сперму помещают в канистре с центральной ориентацией. Заправка сосудов двумя хладоагентами осу­ществляется на племенном предприятии, которое и до­ставляет их в хозяйства.

Новая технология хранения биологических продуктов в замороженном состоянии может иметь общебиологическое значение, ее эффективность выражается в экономии энергии, горючесмазочных материалов, рабочей силы, транспортных средств, криогенной техники, а также де­фицитных хладоагентов. Возможность ее реализации опре­деляется наличием во многих областных и промышленных центрах Украины предприятий по производству сухого льда, мощности которых не загружены на протяжении зимних сезонов и могут в эти периоды без помех обеспе­чивать племенные предприятия страны.

Подводя итоги изложенным в этом издании научным и прикладным материалам, можно прийти к заключению: в настоящее время национальная наука -и практика уже рас­полагают современными биотехнологиями и техникой, способными в полной мере обеспечить животноводству Украины самый высокий уровень обслуживания при орга­низации воспроизводства как методом искусственного осеменения, так и методом искусственного оплодотворе­ния путем пересадки эмбрионов. Таким образом, в на­стоящее время уже имеются все возможности для исполь­зования методов биотехнологии репродукции животных в качестве инструмента для достижения заветной цели жи­вотновода — осуществления крупномасштабной селекции как государственного мероприятия по массовому улучше­нию скота.

167

ПРИЛОЖЕНИЕ

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ, КОТОРЫЕ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ В РЕПРОДУКТОЛОГИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Термин

Определение

Агглютинация спермиев

Аспермия Банк спермы

Беременность Бластоциста

Взятие спермы Выживаемость

спермиев

Ветеринарный тификат

сер-

Внутриматочное осеменение Гранулы спермы Гранулы облицован­ные Гаметы Доза спермы

Донор эмбрионов Замороженная спер-

Склеивание спермиев под воздействием агглюти­нинов или вследствие потери электрического за­ряда

Отсутствие спермиев в эякуляте Запасы замороженной спермы, размещенные в контейнерах, находящихся в специально оборудо­ванном помещении

Физиологическое состояние женского организма с момента оплодотворения до родов Стадия развития эмбриона,   характеризующаяся наличием бластоцеля—полости, заполненной жидкостью

Отбор эякулята соответствующим методом Время сохранения подвижности спермиев в про­цессе их инкубации при определенной температу­ре, выраженное в часах

Документ, удостоверяющий ветеринарно-санитарное состояние продуктов животноводства или живот­ных Введение спермы в полость матки

Форма фасовки спермы при замораживании Дозы спермы, заключенные в герметическую по­лимерную оболочку Женские и мужские половые клетки Количество обработанной спермы, расфасованной для одного осеменения Животное, от которого получают эмбрионы Разбавленная криозащитной средой сперма и охлажденная до сверхнизких температур с_цельк> сохранения ее основных биологических свойств

168

Термин

Определение

Зигота

Индекс искусствен­ного осеменения

Имплантация

Искусственная ваги­на Криопротектор

Контейнер для хра­нения спермы

Концентрация

спермиев

Морула

Манеж для взятия

спермы

Овогенез

Овуляция

Олигоспермия Оттаивание спермы

Оплодотворение

Оплодотворение

самки

Плод

Первичное осемене­ние Первое осеменение

Подвижность спермиев

Прямолинейно-поступательное дви­жение спермиев Показатель прижив-ляемости эмбрионов Разбавленная сперма

Разбав:

Режим Мы

итель спермы взятия спер-

Клетка, образующаяся в результате оплодотворе­ния, обладающая наследственностью мужской и женской особей

Показатель количества осеменений, затраченных на оплодотворение одной самки в среднем за определенный период времени Процесс прикрепления зародыша к слизистой матки

Прибор для взятия спермы у самцов, имитирую­щий характерные для влагалища и матки условия Компонент среды для замораживания спермы, обеспечивающий сохранение ее биологических свойств Сосуд Дыоара, специальной конструкции

Количество спермиев в единице объема спермы

Стадия развития эмбриона, характеризующаяся наличием 32...64 бластомеров внутри прозрачной оболочки

Специальное помещение, оборудованное для взя­тия спермы у самцов

Процесс образования и развития яйцеклеток Физиологический процесс выделения яйцеклеток из яичников

Резкое снижение концентрации спермиев в эяку­ляте

Нагревание спермы до температуры тела живот­ного с целью восстановления ее жизнедеятель­ности

Биологический процесс взаимной ассимиляции мужской и женской гамет с образованием зиготы Перенесение (трансплантация) зародыша в поло­вые органы самки

Организм на стадии развития от образования ор­ганов до рождения Первое в жизни осеменение самки

Первое после растеши или аборта осеменение сам­ки

Способность спермиев осуществлять разнообраз­ное движение, выраженная в баллах или в про­центах

Характерное для нормальных спермиев прогрес­сивное движение

Отношение числа прижившихся эмбрионов к числу пересаженных

Смешанная со специальными средами сперма с целью ее консервации и рационального дозирова­ния

Специальная среда для спермы, применяемая для консервации и увеличения количества спермодоз Частота взятия спермы у производителей в тече­ние определенного периода времени

169

Термин

Определение

Реципиент

Секрет придаточных

половых желез

Свежеполученная

сперма

Спер мопр иемник

Сперма

Спермий Спермипогенез

Санация спермы

Соломинка (пайетта) Сертификат на сперму Суперовуляция

Трансплантация эм­бриона

Трофобласт

Цервикальное введе­ние спермы Чучело для садки самца

Эмбрион

Эмбриональная смертность Эффект фортифика­ции клеток

Эякулят Эякуляция Эмбриобласт Яйцеклетка

целью определения беременности или патолог °

внутренних органов                                        и

Животное, которому пересаживают в матку

брион, т.е. оплодотворяют

Специфические выделения придаточных

желез

Сперма непосредственно после взятия

Сосуд для сбора эякулята во время взятия спермы Продукт половых желез самца, выделяемый процессе эякуляции Мужская половая клетка (гамета) Процесс образования спермиев в половых органах самца

Подавление развития микробов в сперме путем добавления в нее антибиотиков или бактериоста-тических препаратов

Тонкостенная трубка для фасовки, заморажива­ния, хранения и транспортирования спермодозы Документ, удостоверяющий основные показатели качества спермы и ее происхождение Выделение нескольких (не менее трех) яйцекле­ток из нескольких фолликулов у обработанной гормонами самки

Искусственное оплодотворение самки путем пере­садки в ее половые органы жизнеспособного эм­бриона

Наружный слой клеток бластоцисты, из которого образуются плодные оболочки Введение спермы в канал шейки матки

Приспособление, имитирующее подставное жи­вотное; используется во время взятия спермы для садки самца

Организм на ранней стадии развития, происхо­дящего в яйцевых оболочках или в матке Показатель гибели эмбрионов у оплодотворенных животных, выраженный в процентах Увеличение мощности поверхностных структур клетки за счет адсорбции липидов, обеспечи­вающее их изоляцию от контакта с агентами окружающей среды и упрочение цитоплазмати-ческой мембраны

Порция спермы, полученная от одной эякуляции Дискретный процесс выделения спермы у самца Внутренний зародышевый листок эмбриона Женская половая клетка (гамета)

170

СПИСОК АББРЕВИАТУР

гсжк -

ДНК

И.Е.    -

зп   -

иэпвн -

Ккал    —

коит —

л.г.   —

МНПА —

м.е.      —

МПА   -

МПБ   —

ОКК    -

ПВП    -

ПРЖ   —

пкв —

сдс -

СФСБ -

ТВ       _

УАР     -

УСМА      -

УСМА2 -

ФАЖ -

ФСГ    —

ФСБ  _

ФС      _

ФТ      _

ФЭЯ    _

ЦПМ   _

экз  _

Ангстрем. Внесистемная единица длины. 1А = 10 м = 10~*см - 1(Г7мм = ОД нм Гормон сыворотки жеребых кобыл Дезоксирибонуклеиновая кислота

Интернациональная единица действия биологически ак­тивных соединений. Равна 2 ... 2,5 м.е. (мышиных единиц) Зона пеллюцида

Импульсы электрического поля высокого напряжения Килокалории

Портативный комплект-микролаборатория для работы тех­ника-осеменатора в условиях скотного двора Лютеиннизирующий гормон

Международная научно-производственная ассоциация "Эмбрион"

Мышиная единица действия биологически активных соеди­нений. Равна приблизительно 0,5 И.Е. Мясо-пептонный агар Мясо-пептонный бульон Ооцит-кумулюсный комплекс Перивителлиновое пространство

Полуавтомат для расфасовки жидкости в полимерную трубку Дезинфектор для биологических сред Среда долгохранящаяся для консервации спермы произво­дителей по Харьковской технологии

Стабилизированный фосфатно-солевой буфер для вымыва­ния, культивирования и замораживания эмбрионов Трофобластические везикулы

Устройство для асептического внесения разбавителей в сперму Устройство для маркировки спермодоз горячим способом Устройство для садки быков малогабаритное амортизирующее Устройство для автоматической фасовки жидкости в элас­тичные ампулы

Гипофизарный фолликулостимулирующий гормон Фосфатно-солевой буфер — среда Дюльбекко Остальная сыворотка Фрагменты трофобласта Фрагменты эпителия яйцевода Цитоплазматическая мембрана Устройство для эквилибрации и замораживания

171

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Белоус A.M., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П. Молекулярные механиз­мы криоповреждений биомембран //Итоги науки и техники. — 1978 — № 9. — С. 80-113.

Бикше У.Я., Букинголщ Я.Н., Валтер Я.А., Осташко Ф.И., Сойфер Л.М., Шмидт В. С., Шнытка И.Я. Способ маркировки упаковок с живыми биоло­гическими суспензиями. Авторское свидетельство Na 889548 (51) М Кл В 65 В 61/26, СССР, 1980.

Волоскова А.И. Содержание липидов в сперме жеребца // Коневодство — 1938. — Na 11. — С. 37.

Вакуленко И. С. Исследование воспроизводительной способности и со­вершенствование технологии получения спермы у быков-производителей: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. —Харьков, 1970.

Гршценко В.И., Осташко Ф.И., Исаченко В.В., Сушко А.Б., Федотова И.А. Нитрификация и сверхбыстрое замораживание мышиных, крысиных и коровьих эмбрионов // Проблемы криобиологии. — 1992. — Na 1. — С. 35—39.

Довгопол В. Ф. Обработка эмбрионов коровы трипсином. — Личное со­общение. — 1988.

Дульцин М. Гемолиз // БМЭ, 1958. — Т. 6. — С. 746—756.

Дуиейко О.И. Исследование защитного действия криопротектантов в связи с длительным хранением спермы быков-производителей: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Харьков, 1972.

Зорт В.М., Скорняков Б. О. Вивчення впливу високого тиску на виживання спермцв при низьких температурах без утворення льоду // Молочно-м'ясне скотарство. — К., 1971. — Вип. 26. — С. 26—31.

Зорин В.М. Усовершенствование способа консервирования спермы бы­ков: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Харьков, 1974.

Зубецъ М.В., Буркат В.П. Про радикальний перегляд теорії селекції // Bісн. с.-г. науки. — 1987. — N6 7. — С. 80—82.

Исаченко В.В. Обоснование параметров режима осеменения и кон­струкции устройства для извлечения эмбрионов суперовулированных жи­вотных: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Харьков, 1988.

Исаченко КФ. Криоповреждения спермы быков при низкотемператур­ной консервации в облицованных гранулах: Автореф. дис. ... канд. оиод. наук. — Харьков, 1987.                                                                         

Капрелъянц Й.Т., Осташко Ф.И. Устройство для садки быков при. *» тии спермы. Авторское свидетельство Ne 1371699 Al A61 D 7/02,

Катков И.И., Осташко Ф.И. Роль механических напряжений при криоповреждениях мембран спермиев сельскохозяйственных животных и человека // Тез. II Всесоюзн. конф. по криобиологии и криомедицине. — Харьков, 1984. - Т. 2. - С. 229.

Kupeeea B.A. Изучение физиологических реакций спермиев на изменение технологии консервация спермы быков: Автореф. дис. ... канд. биол. яаук -Харьков, 1985.

КауФфолъд П., Тамм И., Шихов И.Я., Альм X., Эриг Ф., Фольге Р., Ром-ль п. Оценка качества эмбрионов крупного рогатого скота: Руководство ддя работы по пересадке эмбрионов. — М.: Агропромиздат, 1990. — 56с.

Киреева В.А., Осташко Ф.И., Бугров А.Д., Звозчик А.Д., Звозчик Н.Г. Способ увеличения генетического потенциала лучших быков-производителей на племпредприятиях // Информ. листок ЦНТИ № 170—84, серия 33 "Животноводство и ветеринария". Харьков, 1984.

Косяков П.Н. Антигенные вещества организма и их значение в биоло­гии и медицине.— М.: Медгиз, 1954 — 25 с.

Ленинджер А. Биохимия — Молекулярные основы структуры и функ­ции клетки. — М.: Мир, 1974. — 956 с.

Марющенко А.В. Влияние физических полей на клетки и среды для криоконсервации спермы быков-производителей: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Харьков, 1985. — 17 с.

Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственного осемене­ния животных. — М.: Сельхозгиз.. — 1962. — 605 с.

Милованов В.К., Голубь B.C., Жильцов Н.Э. Лизофосфатиды и их значе­ние в технологии хранения семени // Докл. ВАСХНИЛ. — 1975. — N61.— С. 24.

Милованов В.К., Кононов В.П., Азизова О.А. Физические свойства мем­бранных липидов и устойчивость живчиков при глубоком замораживании // Вестн. с.-х. наук. — 1984. — N6 2. — С. 9—10.

Милованов В.К., Селиванова О.А. Разбавители для спермы с.-х. живот­ных // Проблемы животноводства. — 1932. — Na 2. — С. 22—24.

Милованов В.К., Соколовская И.И. Теория холодового удара живчиков млекопитающих // Докл. ВАСХНИЛ. - 1959. — Na 8. — С. 12-14.

Осташко Ф.И. О природе холодового удара живчиков. Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных // Сб. работ НИИЖ Лесо­степи и Полесья УССР.— Харьков: Книжное изд-во, 1963.

Осташко Ф.И. Причины и механизм холодового удара клеток // Меж­дународный сельскохозяйственный журнал. — 1964. — № 3. — С. 18—19-

Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спер­мы производителей. — Киев: Урожай, 1968. — 254 с.

Осташко Ф.И. Разработка вопросов теории и практики длительного хранения спермы производителей: Дис. д-ра биол. наук. — Харьков, 1968. - 470 с.

Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спер­мы производителей.— Киев: Урожай, — 256 с.

Осташко Ф.И. Харьковская технология асептического взятия и крио­консервации спермы быков-производителей. — Харьков, 1990. — 47 с.

Осташко Ф.И. Организация искусственного осеменения коров и телок по Харьковской технологии.— Харьков, 1990.

Осташко Ф.И., Безуглый Н.Д. Устройство для замораживания зароды­шей. Авторское свидетельство СССР N 1659040 А1 Кл. 61 D 19/02, 1989.

Осташко Ф.И., Безуглый Н.Д,., Гордиенко Н.А.. Способ проведения микрохирургических операций с яйцеклетками и эмбрионами. Авторское свидетельство СССР N 1727822 А1 Кл. А 61 D1/04, С 12 N 5/00, С 12 Q

Осташко Ф.И., Бугров А.Д. Размораживание спермы быков в кипящей воде //Тезисы XXXIII ежегодной конференции европейской ассоциации по животноводству. 16-19 августа 1981. — Ленинград, 1982,

Осташко Ф.И., Бугров А.Д. Способ размораживания спермы. Авторское свидетельство СССР N Ш9532 Кл. А 01 № 1/00, 1983.

Осташко Ф.И., Бугров А.Д., Передера К.Б. Устройство для извлечения эмбрионов у животных. Авторское свидетельство СССР N 1205904 А Кл. А 61 D 7/02, 1984.

Остатка Ф.И., Гайворонский Г.С. Применение фотоэлектроколориметра для определения концентрации сперматозоидов // Молочное и скотоводство. — 1960. — № 2. — С. 10-12.

Осташко Ф.И., 1рищежо В.И., Иссненко В.В., Иссненко Е.Ф., Дахно Фк Сушко А.Б., Пальщиков Г.Л., Криоконсервация частиц трофобласта крупв го рогатого скота // Сельскохозяйственная биология. — 1992. — М -j Я" 148-152.                                                                                         ' ~~ с

Осташко Ф.Я., Грищенко В.И., Гень С.А., Катков И.И., Способ определения резистентносги эритроцитов. Авторское свидетельство СССР N li7R4in А Кл. А 61 В 10/00, 1983.                                                              "/«410

Осташко Ф.И., Губин Н.М., Канцедап В.И. Методика определения химического состава спермы производителей с помощью эмиссионного спектрального анализа: Методика исследований в животноводстве //Тез дот" — Харьков, 1966.                                                                            '

Осташко Ф.И., Добирав М.К. Антигенная структура и проницаемость цитоплазматической мембраны // Четвертый международный симпозиум по иммунологии репродукции. Варна, Болгария. 19—22 сентября 1978.

Осташко Ф.И., Дцбиров М.К. Способ предотвращения и подавления гемолитического процесса — заявлено в Госкомитет по делам изобретений и открытий, май, 1979.

Осташко Ф.И., Дцбиров М.К., Безуглыц Н.Д. Раствор для извлечения эмбрионов. Авторское свидетельство СССР N 1713529 А1 Кл А 01 If 67/00, 1989.                                                                               '

Осташко Ф.И., Добирав М.К., Иващепко В.Н. Устройство для получе­ния эмбрионов. Авторское свидетельство СССР N 1393415 А1 Кл А61 D 7/02 1985.

Осташко Ф.И., Дцбиров М.К., Хмельков В.Н., Безуглый Н.Д., Бандура АИ. Устройство для получения зародышей. Авторское свидетельство СССР N 1343586 А1 Кл. А 61 D 7/02, 1985.

Осташко Ф.И., Добирав М.К., Хмельков В.Н., Песоикий В.В. Устройство для пересадки эмбрионов. Авторское свидетельство СССР N 1359936 А Кл А 61 D 7/02, 1985.

Осташко Ф.И., Иващенко В.Н., Дцбиров М.К., Смирнова Т.С. Устрой­ство для извлечения эмбрионов. Авторское свидетельство СССР N 1680144 А1 Кл. А 61 D 19/00, А01 К 67/00, 1988.

Осташко Ф.И., Иващенко В.Н., Смирнова Т.О., Гуськов А.Г. Устройство для изготовления из рукавного термопластичного материала упаковок с жидким материалом. Авторское свидетельство СССР N 1703561 А1 Кл. В. 65 В 51/10, 9/10, 1990.

Осташко Ф.И., Исаченко Е.Ф. Контейнер для замораживания спермы, 1992. Заявка на Авторское свидетельство СССР N 4955093.

Осташко Ф.И., Исаченко Е.Ф., Звозчик Н.Г., Иванов B.C. Устройство для пневмотранспортировки биологического материала // Ветеринария. — 1988. - № 2. - С. 32-34.

Осташко Ф.И., Иссненко Е.Ф., Комлык С.Н., Иващенко В.Н., Сазонов В.К., Смирнова Т.С. Устройство для эквилибрации и замораживания спермы жи­вотных. Авторское свидетельство СССР N 1569005 А1 Кл. А 61 D 19/02, 1988.

Осташко Ф.И., Иссненко В.В., Тушнский Л.И., Шевчук М.С., ХамаПюв Р.И., Косое В. С. Устройство для извлечения эмбрионов. Авторское свидетельство СССР N 1423117 А1 Кл. А 61 D 7/02, 1986.

Осташко Ф.И., Катков И.И. Обработка импульсным электрическим полем высокой напряженности суспензии клеток сельскохозяйственных животных и человека и возможности ее практического применения I/ па-учн.-техн. бюл. НИИ животноводства Лесостепи и Полесья УССР. — Харьков, 1982. — Mb 33. — С. 78—83

Осташко Ф.И., Кирьянчук А.А., Передера К.Б., Недава Л.В. Устройство для извлечения эмбрионов. Авторское свидетельство УССР N 1530181 At Кл. А 61 D 7/02, 1989.

Осташко Ф.И., Кравченко Л.С., Воронцов В.В., Александров А.П., Мин­ский Е.Г. Устройство для определения оптимального времени осеменения и ранней диагностики стельности животных. Авторское свидетельство N 1516-89 А1 Кл. А 61 В 10/00, 1987.

Осташко Ф.И., Кузнецов Г.Н., Павленко М.П. Спермоприемник к искусственной вагине животных. Авторское свидетельство СССР N 1072861, S? А 61 D 7/02, 1982.

Осташко Ф.И., Кузнецов Г.Н., Павленко М.П. Устройство для искусственного осеменения животных. Авторское свидетельство СССР N $5428, Кл. А 61 D 7/02, 1977.

Осташко Ф.1., Допатко M.I., Коркишко А.Ф. Визначення рН в малих об'емах сперми //Тваринництво Украши. — 1966. — Ml! 2. —С.

Осташко Ф.И., Магда В.И. Определение осмотического давления в малых объемах жидкостей // Лабораторное дело. — 1964. — Nb 12. —С.

Осташко Ф.И., Малая Л. Т., Шуляк Л.Н. Способ ранней диагностики тельности крупного рогатого скота. Авторское свидетельство СССР N 1791972 А1 Кл. A OIK 67/02, G 01 N 33/53, 1990 г.

Осташко Ф.И., Мирось В. В., Исаченко В.В. Способ осеменения суперовулированных коров и телок. Авторское свидетельство СССР N 1604306 А1 Кл. 01 К 67/02, 1987.

Осташко Ф.И., Осташко Е.Ф. Устройство для хранения биологиче­ского материала. Авторское свидетельство СССР N 1146035, Кл. А 61 D 7/02, 1982.

Осташко Ф.И., Павленко М.П. Способ консервирования спермы жи­вотных. Авторское свидетельство СССР N 523693, Кл. А 61 D 7/02, 1976.

Осташко Ф.И., Павленко М.П., Павленко Л.Н., Кузнецов Г.Н. Устрой­ство для микроскопии спермы и эмбрионов в эластичных капсулах. Автор­ское свидетельство СССР N 1543598 А1 Кл. А 61 D 19/02, G 02 В 21/34,

Осташко Ф.И., Передера К.Б. Устройство для извлечения зародышей у животных. Авторское свидетельство СССР Т 167431 А1 Кл. А 61 D 19/02, 1989.

Осташко Ф.И., Передера К.Б., Исаченко В.В. Комплект для извлечений и консервации зародышей. Авторское свидетельство СССР N 1681850 А1 Кл. А 61 D 19/02, 1989.

Осташко Ф.И., Передера К.Б., Исаченко В.В., Безуглый Н.Д. Контейнер для эмбриона. Авторское свидетельство СССР N 1616649 А1 Кл. А 61 D 19/02, 1988.

Осташко Ф.И., Передера К.Б., Почка П.А., Недава Л.В. Устройство для извлечения эмбрионов у животных. Авторское свидетельство СССР N 1530180 А2 Кл. А 61 D 7/02, 1988.

Осташко Ф.И., Помитун И.А., Дцбиров М.К.. Способ подготовки бара­нов-пробников. Авторское свидетельство СССР N 1713577 А1 Кл. А 61 В 1/02, 1990.

Осташко Ф.И., Северин Н.Ф., Величко ИМ., Горенко А.Ф., Марющенко А.В., Столяров В.Д. Способ приготовления среды для разбавления спермы производителей. Авторское свидетельство СССР N 1235022, 1984.

Осташко Ф.И., Тюпина Л.И., Шинкаренко В.А. Количество активных спермиев в дозе и оплодотворяемость коров // Молочное и мясное ското­водство. — 1971. — № 8. — С.

Осташко Ф.И., Чирков В.А. Способ искусственного осеменения жи­вотных. Авторское свидетельство СССР N 286141, Кл. А 61 D 7/02, 1970.

Осташко Ф.1., Чумаков М.Я. Вивчення біофізичних властивостей сперми методом електромагштно! спектроскоп!! в д!апазот радючастог. Розведення i утримання сщьськогосподарських тварин. — Ки'ш: Урожай, 1965. - Вип. 5.

Осташко Ф.И., Чумаков Н.Я. Диэлектрическая структура и иммуноло­гические свойства цитоплазматической мембраны спермиев: Доклад на международном симпозиуме по иммунологии сперматозоидов и оплодо-тв°рения. 27—29 сентября, Варна (Болгария), 1967 // Тр. международ, симп. - София: Изд-во БАН, 1969.

175

Осташко Ф.И., Шикаренко В.А. Способ искусственного осеменен животных. Авторское свидетельство СССР N 354855, Кл. А 61 D 7/02, 1970

Осташко Ф.И., Шинкаренко В.А., Федотов А.Г. Устройство для искусственного осеменения животных. Авторское свидетельство N 553972 iu Кл. 61 D 7/02, СССР, 1972.                                                               ' П"

Пасечник В.И. Вязкоупругие свойства моделей биологических Мембран и процессы механорецепции: Автореф. дис. ...'д-ра физ. наук. — М • Mrv 1983.-46 с.                                                                                 " У'

Пасечник В.И. Электрострикционные измерения вязкоупругих свойств бислойных липидных мембран //Итоги науки и техники. Биофизика мем бран, — М.: ВИНИТИ, 1982. - Т. 2. - С. 267-307.

Пакенас П. И. Бюллетень научно-технической информации Литовского НИИ Животноводства. Байсогала, 1975. — N 2(36).

Плахотин М.В., Шитов С. Т. Способы обезроживания крупного рогато­го скота и предупреждения роста рогов у телят //Тр. Московской Ветеринарной Академии, 1962. - Т. 43. - С. 98-101.

Пушкарь Н.С., Исаченко Е.Ф., Осташко Ф.И. Устройство для консер­вирования спермы производителей. Авторское свидетельство СССР N 1393415 А1 Кл. А 61 D 7/02, 1985.

Рис Э., Стернберг М. От клеток к атомам: Иллюстрированное введение в биологию. — М.: Мир, 1988. — 144 с.

Робертис Е., Новинский В., Саэс Ф. Общая цитология. — М.: Мир, 1962. — 360 с.

Робертис Э., Новинский В., Саэс Ф. Биология клетки. — М., 1973 — 182с.

Семенченко Н.А. Зависимость оплодотворения телок от возраста их осеменения // Вісн. с.-г. науки. — 1978. — N 10. — С 111—112.

Сидашова С.А. Рационально використання замороженої сперми бугаїв-плідників: Автореф. дис. канд. с.-г. наук. — Харюв, 1992. — 16 с.

Смирнов И.В. К теории глубокого охлаждения спермы //Животновод­ство. — 1974. - N 11. - С. 65—70.

Солсбери Г., Вандемарк Н.. Теория и практика искусственного осеме­нения коров в США. — М.: Колос, 1966.

Стеккениус В. Изучение молекулярной структуры водно-липидных си­стем и моделей клеточной мебраны в электронном микроскопе // Ультрас­труктура и функция клетки.— М.: Мир, 1965". — С. 200—211.

Финеан Дж., Колиэн Р., Мичем Р. Мембраны и их функции в клетке. — М.: Мир, 1977.

Фрей-Висслинг А. Сравнительная органеллография цитоплазмы. — М.: ИН, 1976.

Шредер В.Н. О природе зарядов спермиев млекопитающих, изученных методом катафореза // Биология. — 1936. — 5, N 4. — С. 690—718.

Шредер В.Н. Физиология и биохимия возникновения и регуляции по­ла потомства. М.: Наука, 1965. — С. 138.

Adam М., Hamelin A., Berge P., Goffaux M. Possible application of the technique of inelastik diffusion of light to the study of bull sperm viability // Annals. Biol. Anim. Biochim. Biophis. — 1969. — 9. — P. 651—655.

Adler H. C. Deep freezing of bovine semen in ceBophane straws and storage in liquid air // Aisberetning, Den, kgl. Vet. — og Landbohojskoles Sterilitetsforskh. — 1960. — 243 p.

Amann R.P., Seidel G.E. Prospect for sexing Mammalian sperm. Boulder: Colorado Associated University Press, 1982.

Almquist J. Dairy Cattle // Perry E. The artificial insemination of Farm Animals: New Jersey: Rut. Univers. Press, 1968.

Almquist J.O., Thacker D.L. Fertility of bull semen diluted with Boueo Homogenized milk and Boiled skimmilk // J. Animal Sci. — 1952. — N U-P. 787.                                                                                                      ,

Bayon D., Med R.A., Galicia C. Ovarian cysts induced by plant oestrogens //

Br. Vet. J. — 1983. — 139, N 1. — P. 38. 176

Bhattacharya B.C. Pre-determination of sex in animal reproduction // VII-a. A.I., Krakov, 1976, IV, 876-879.

Bhattacharya B.C., Shorn P., Gunter A.N., Evans B.M. Successful separation Of X and Y spermatozoa in human and bufl semen // Int. J. Fertfl. — 1977. — N 22. I P. 30-35.

Brackett B.C., Oh Y.K., Evans J.F., Donawick W.J. In vitro fertilization of cow ova // Theriogenology. — 1978. — N 9. — P. 89.

Boccart C., Mermillod P., Delecoeviellerie C., Dessey F. Bovine oviduct cell monolayers for supporting the blastocyst formation of bovine embryos // Theriogenology. — 1991. — N 35. — P. 35-187.

Roland M.P., Crosby T.F., Gordon I.. Whin pregnancy in cattle established by non-surgical egg transfer // Brit. Vet. J. — 1981. — 131. — P. 738—740.

Boland M.P., Kennedy L., Crosby T.F., Gordon I. Superovulation in the cow using PMSG or HAP // Theriogenology. — 1981. — N 15. — P.110.

Bogart R., Mayer D. The effects of egg yolk on the various physical and chemical factors detrimental to spermatozoon viability // J. Animal Sci. — 1950.

- 9, N 2, — P.143—152.

Bratton R.W., Foote R.H., Cruthers J.C. Preliminary fertility results with frosen bovin spermatozoa // J. Dairy Sci. — 1955. — N 38. — P.40—46.

Cassou R. La methode des paillettes en plastique adaptee a la generalisation de la congelation // V-ICAR a. A.I., Italia, Trento, 1964, IV. — P.540—546.

Chatztdakis I., Katraakili K., Krambovitis E. Development of enzyme immunoassay kits for steroiod hormones // The IMBB report. — Heraklion, Greece. — 1990. — P. 62.

Curtis J.L., FJsden R.P., Seidel G.E. Non-sugrical transfer of bovine embryos // Theriogenologe. — 1981. — N 15. — P.124.

Callagan B.D., King G.J. Determination of the fertilization rate of A.I. sires// Theriogenology. — 1980. — N 14. — P. 403—410.

Danielli F., Davson H. // J. Cell. Сотр. Phisiol. — 1935. — N 5. — P. 4.

Darrin-Bennet A., Poulos A., White I.G. A re-exsamination of the role of phospholipids as energy substantes during incubation of ram spermatozoa // J. Reprod. Fertfl. — 1973. — N 34. — P. 543—546.

Darrin-Bennet A., Poulos A., White J.G. The phospholipids and phospholipid-bound fatty acids and aldehydes of dog and fowl spermatozoa // J. Repr. Pert. — 1974. — N 41. — P.471—474.

Dovgopol V.F., Ostashko F.I., bachenko V.V. New preparation for prolongation of pituitary gonadotrophins effect // XII-ICAR, Hague, Netheriand. — 1992. — N 1 — P.199-201.

Duijn C. Van Jr. Kinetics of fertility of semen // V-ICAR a. A.I., Trento, 1964, IV. — P.313—322.

Bartlett E., Larson L., Parker G., Howard'H. Specific pathogen free (SPF) Frosen bovine semen: a goal? // Proc. sixth Techn. Conferenc. on A. I. A. R., NAAB, Columbia, 1976. — P.I 1—12.

Dunn И.О., Hafs C. Extenders and technique for freezing bovine spermatozoa // J. Dairy Sci. — 1935. — N 36. — P. 577.

Ellington J.E., Carney E. W., Farrel P.B., Simkin M.E., Foote R.H. Bovine 1—2—cell development using a simple medium in three oviduct epithelial cell co-culture systems // Biol. Rejrod. - 1990. — N 43. — P.97—104.

Ellington J.E., Farrel AB.. Foote R.H. Comparison of six-day bovine embryo development in uterine tube (oviduct) epithelial cell co-culture versus in vitro development in the cow // Thetiogenology. — 1990. — N 34 — P. 837—844.

Ellington J.E., Farrel P.B., Simkin M.E., Foote R.H. Goldman E.E., Me Grath F.B. Development and survival after transfer of cow embryos cultured from 1—2 cell to morolae or blastocyst in rabbit oviducts or in a simple medium with bovine oviduct epithelial cells // J. Reprod. Fertfl. — 1990b. — N 89. — P.293— 299.

Elsden R.P., Nelson L.D., Seidel G.E. Superovulation cows with follicule stimulating hormone and pregnant mare serum gonadotrophin // Theriogenology.

- 1978. — 9, N 1. — P.17—26.

U

177

Eyestone W.H., First N.L. Co-culture of early cattle embryos to the blastocyst stage with oviductal tissue or in continioned medium // J. Rep rod Fertil. — 1989. — N 86. — P. 715-720.

Foote R.H., Dunn И.О. Buffers, extenders and methods freesingsemen mimeo Routine Lab. Procedure // Cornell Univ. — 1955. — 11 p. Foulkes J.// J. Reprod. Pert. — 1977. — 49, N 2. — P. 277. Foukes J., Stewart D.// J. Reprod. Pert. — 1977. — 51, N 12. - P. 175. Fukui Y. Effects of sera and hormones on development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro and co-cultured with bovine oviduct epithelial cells // J. Anim. Sci. - 1989. - N 67. - P. 1318-1323.

Hafs H.D., Elliott F.I. The effect of methods of adding egg yolk and monosacharides on the survival of frozen bull spermatozoa // J. Dairy Sci. —. 1981. - N 53. - P. 1693—1696.

Haslor J.F., Baven R.A. Nelson L.D., Seidel G.E. Serum progesterone concentrations in cows receiving embrio transfers // J. Reprod. Pert. — 1980. — N 58. — P. 71—77.

Hahn J., Hahn R. Experiences with non-surgical transfer techniques // L.EA. Commision of the European "Egg Transfer in Cattle". — Luxemburg 1976. - P. 199—204.

Hiroshi M., Nishikawa Y. // J. Zool. Sci. — 1972. — 433, N 8. — P. 413—423. Isachenko V.V., Qstashko F.I., Isachenko E.F. Vitrification and uitra—rapid freezing of rat embryos // Theriogenology. — 1992. — 37. — P. 227.

Isachenko V.V., Ostashko F.I., Grishchenko V.I., Isachenko E.F. Survival of trofoblastic fragments and vesicles after vitrification, ulta—rapid freezering and storage at 4 °C // Cryobiology. — 1993. — N 30. — P. 432—437.

Isachenko V.V., Ostashko F.I., Grishchenko V.I., Isachenko E.F. Effect of heat—inactivated and non—head—inaktivated estrous cow sera on naturatipn of bovine oocytes // Materials of 13th Joint Meeting of British Endocrine Societies. — Bournemouth, U.K. — P 212. Abstr.

Isachenko V.V., Ostashko F.I., Grishchenko V.I., Isachenko E.F., SUshko O.B., Soler C. Improvement of attachment rate of bovine embryos after transfer with trofoblastic fragments // Proceeding of the First European Conference on: "Progress in Embrio Tehnology and Genetic Engineering in cattle and sheep Breeding". — Krakow, 1994. — P. 207—208.

Iritani A., Niwa K. Capacitation of bull spermatozoa in vitro of cattle follicular cocytes matured in culture // J. Reprod. Fertil. — 1977. — N 50. — P. 119.

Jondet R. Contribution a I'amelioration de la technologic du sperme be taureas // Universite de Rennes U. E. R. de Sc. Biologiqes (pour obtenir le grande de Docteur es Sc.). — Rennes, 1980.

Jondet Я Methode simplitifiee de congelation du sperme de taureau conditionne en pailettes de matiere plastique // C.R. Acad. Agric. — 1964 a. — 27 Mai. — P. 811— 820.

Jondet R. Quatre annees de congelation rapide du sperme de taureau // VI— ICAR a. A.I. - Paris. - 1968. - N 11. - P.1057-1059.

Johnson L.A. Gender preselection in domestic animals using flow cytometrically sorted sperm // J. Anim. Sci. — N 70/2. — P. 8—18.

Kagy B.W. Sire housing—outside lots // Proc. 6 Techn. Conferenc. on A. I. a Reprod. NAAB. - Columbia, 1976. - P. 106—107.

Kasai M., Hamagnchi Y., Miyake Т., Sakurai Т., Machida Y. High survival of rabbit morulae after vitrification in an ethflene glicol—based solution by a simple method // Biol. Reprod. — 1992. - N 46. — P. 1042-1046.

Kelly J., Hurst V. Evaluation of frozen bovin semen packaged in glass and plastic ampules for 3 methods of storage and shipping // Amer. J. Vet. Res. — 1964. — 25, N 108. — P. 1446—1450.

Kichev J. Protein—glycolipoprotein complexes in diluted semen (a new physical—chemical theory for deep freesing semen) VIII—ICAR a A.I. — Krakow, 1976. - 4. - P. 815.

178

Lacalandra G.M., Dell Aquila M.E., Pusco S., Sciorsci R.L., Perrons P., Minoia P. II In vitro fertility test of bull semen // 12th—ICAR, Hague, Netherlands vol. 2, 1992, P. 656-658.

Libbus B.L., Johnson L.A. The creeping vole, Microtus oregoni: karyotipe and sex—chromosome differences between two geografical population // Cytogenet. Cenet., 1988, 47.— P. 181-184.

Marquant В., Le Guienne B, Humbtot P., Gallon N., Gerard O., Thibier M. In vitro fertilization as a toll to evaluate fertility in the bovine // 12—thICAR, Hague, Netherlands. — 1992. — 2. — P. 662—664.

Massip A., Van Der Zwalmen P.. Ectors F. Pregnancies folloving transfer of cattle embryos preserved by vitrification // Cryoletters. — 1986. — N 7. — P. 270-273.

Miller DM., Johnson W.J., Cates W.E., Mapletoft R.T. Superovulation studies in heifers to determine fertilisation rates of bulls high level of certain sperm defects // Teriogenology. — 1981. — N 15. — P. 112.

Morales J.R., Cancio O.D. Resultados de 20 anos de insemination artificial bovina en Cuba (1962—1982) // ACPA (Asociacion Cubana de Produccion Animal). — 1984. — 4. — P. 51—57.

Moruzzi J.F. Selecting a mammalian species for the separation of X and Y— chromoosome—bearing spermatozoa // J. Reprod. Fertil. — 1979. — N 57. — P.

319.

Munoz C.E., Tejon Tejon D. // Catalogo de razas Autoctonas Espanolas I— especies ovina у caprina, Ministerio de agricultura. — Madrid, 1980. — P. 174.

Nagase H., Graham E.F. Pelleted semen // V—ICAR a. A.I.—Trento, 1964.

- 4. - P. 387-319.

Nagase H., Graham E.F., Niwa T. Pelleted semen // V—ICAR a. A.I., Trento, 1964.— 4. — P. 404—409.

Nagase H., Niwa T. Studies on deep freezing technique for bull semen // J. Anim. Reprod. — 1963. — N 9. — P. 73.

Nagase H., Niwa T. Deep freezing bull semen in concentrated pellet form I, II, III // V—ICAR a. A.I., Italia, Trento, 1964. — 4. — P. 498—503.

Nagase H., Niwa Т., Yamashita S., Irie S. Deep freezing bull semen in concentrated form. Fertility // V—ICAR a A.I.—Trento, 1964. — 4. — P. 503— 506.

Nagase H., Yamashita S., Irie S. Protective effects of sugars against freezing ingury to bull spermatozoa // VI—ICAR a. A.I. — Paris, 1968. — 11. — P. 1111-1113.

Neil A., Masters C. Metabolism of fatty acids by bovine spermatozoa // Biochem. J. — 1972. — N 127. — P. 375.

Nibart M., Kohen G., Esposito L, Baudo P., Thuard J., Desmettre P., Thibier M. Rapid bovine embryo sexing by DNA probe: field results // Proc. XII—ICAR, Hague. — Netherland, 1992. — 2. — P. 727.

O'Dell W.T., Almaquist J.O. Freezing bovine semen. I. Techniques for freezing bovine spermatozoa in milk diluent // J. Dairy Sci.—1957. — 40, N 12.

- P. 1534—1541.

Ostashko F.I. Aparatura pentru congelarea spermei // An. Rumino—Soviet. Agricult.—zootechn. — 1962. — N 6. — P. 132—137.

Qstashko F.I. Deep semen freezing // V—ICAR a. A.I., Italia.—Trento, 1964. - 4. - P. 139-143.

Ostashko F.I. Zagadnienia teorii i praktiki konserwacji nasienia zwierzat w oiskich temperaturach // Zeszyty problemowe postepow rolniczych. — 1971. — N 124. — P. 405—417.

Ostashko F.I., Dibirov M.K. E structure у pcrmiabilidad de la membrana citoplasmatica // 9-ICAR a. A.I. — Madrid, 1980. — 5. — P. 106—109.

Qstashko F.I., Bezngfy N.D., Pesotsky V.V., Gordienko N.A., Volkova E.G. The Kharkov Technology of Cattle Embryo Cryopreservation // Cryobiology. — 1988. - 25, N 6. — P. 563-568.

Ostashko F.I., Isachenko V.V., Isachenko E.F., Grishchenko V.I., Soler C. u«rarapid freezing of rat and bovine embryos without "classical" equilibration //

U*                                                                                            179

Proceedings of the First European Conference on "Progress in embryo tehnology and genetic engineering in cattle and sheep breeding". — Krakow, 1994. —p 246—247.

Parrish J.S., Parrish J.K., First N.L. Effekt of swim-up separation and heparin pretreatment of frozen-thawed spermatozoa on in vitro fertilization of bovine oocytes // Biol. Reprod. — 1984. — 30 (Suppl.l). — P. 112. Phillips P.H. // J. Biol.Chem. — 1939. — 130. — P. 415. Phillips P.H., Lardy H.A. A yolk buffer pabulum for the preservation of bull semen// J. Dairy Sci. - 1940. - N 23. - P. 399-401.

Polge C., Rowson L. Fertilizing capacity of bull spermatozoa after freezing at—79 °C // Nature (London). — 1952. — 169. — P. 626—627.

Polge C., Smith A., Parkes A.S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehidratation at low temperatures // Nature (London). — 1949. — 164. — p 666.

Pollard J. W., Plants C., King W.A., Hansen P.J., Betteridge K.J., Suarez S.S. Fertilizing capacity of bovine sperm may be maintained by binding to oviductal epithelial cells // Biol. Reprod. — 1991. —N 44. — P. 102—107.

Kail W.F., Fahy G.M. Ice free cryopreservation of mouse embryos at — 196 °C by vitrification// Nature (London). — 1985. — 313. — P. 573—575.

Roberts E., Nowiinski W., Saez F. Jeneral Cytology. — Phil. — Lond., I960. Schnaider H.S., Castleberry R.S., Grinffin J.L. Commercial aspekts of bovine embryo transfer// Theriogenology. — 1980. — N 13(1). — P. 73—85.

Schams D., Menzer Ch., Schallenberger E., Hoffman В., Hahn J., Hahn R. Some studies on pregnant mare serum gonadotrophin (PMSG) and on endocrine responses after application for superovulation in cattle // EES-seminar "Control of Reproduction in the cow".— Galway, 1978. — P. 122—123.

Seidel G.L., Ebden R.P., Nelson L.D., Bowen R.A. Superovulation of cattle with pregnant mare's serum gonadotrophin and follicule stimulating hormon // EES-seminar "Control of Reproduction in the cow". — Galway, 1978. — P. 159-168.

Seidel G.E., Larson L.L., Foote R.H. Effect of age and gonadotrophin treatment on superovulation in the calf// J. Anim. Sci. — 1971. — N 33. — P. 617.

Seidel G.E., Larson L.L., Spilman C.H., Hahn S., Foote R.H. Transfer of superovulated calf ova // J. Anim. Sci. — 1970. — N 31. — P. 230. Semex Canada. Intern. Newletter. — 1985. — 4, N 2. — P. 10. Simmet L. Ein vollautomatisches verfahren zur konfektionierung von bullensperma in kunststoffrohrchen nach der Landshuter methode // VII-ICAR a. A.I. Munchen, 1972. - 11. - P. 1357—1362.

Sreenan J.M., Beehan D., Mulvehill F. Egg transfer in the cow: factors affecting pregnancy and twinning rates following vilateral transfers // J. Reprod. Pert. — 1975. — N 44. — P. 77—85.

Sullivan J.J., Mixner J.P. Effects of storage temperature and length of storage time upon the post-thawing motflity and metabolic activity of frozen bull semen // J. Dairy Sci.— 1963.— N 46. - P. 850-853.

Thibault C. La culture in vitro de I'oeuf de vache // Ann. Biol. Anim. Biochem. Biophis. — 1966. — N 15. - P. 159-164.

Thibier M. Conditions d'aplication du sexage d'embryons en ferme // Seminare UNCEIA. — Paris, 1986.

Thibodeaux J.K., Goodeaux L.L., Raoussel J.D., Menezp Y., Amborski G.F., Moreau J.D., Godke R.A. Effect of stage of the bovine estrous cycle on in vitro characteristics of uterine and oviductal epithelial cells // Hum. Reprod. (Ox).— 1991. —N6.- P. 751—760.

Van der Mei J. Method of and apparatus for the purposes of the P'regnancy and estrus diagnosis // oral information. — 1993.

Wachtel S., Nakamura D., Wachtel G., Felton W., Kent M., Jaswaney V. Sex selection with monoclonal H—Y antibody // Fertility and Sterility — 1988. — 50, N 2. — P. 355—360.

Watson P. // J. Repr. Pert. — 1975. — 42, N 1. — P. 105—111.

Whittingham D.J., Leibo S.P., Masur P. Survival of mouse embryos frozen to _ 196... —269 °C // Science. — 1972. — 178— P. 411—414.

Willett E.L., Ohms J.I. Influnce of seminal plasma and naturity of bovine spermatozoa upon their fieezabflity // J. Dairy Sci.— 1958.— N 41. — P. 90—95.

Wrignt R.W., Bondioli K.R. Aspects of in vitro fertilization and embryo culture in domestic animal // J. Anim. Sci. — 1981. — N 53. — P. 707.

AM K.P., Yadav B.R., Rorie R.W., Plants L., Betterige K.J., King W.A. Development and viability of bovine embryos derived from ocytes matured and fertilized in vitro and co-cultured with bovine oviductal epithelial cells // J. Reprod. Fertn. - 1992. — N 94. — P. 33—43.

180

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРЕДИСЛОВИЕ..

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 6

НЕКОТОРЫЕ ВОПРОСЫ ТЕОРИИ..................................... 15

ТЕХНОЛОГИЯ РАБОТЫ ПЛЕМЕННЫХ ПРЕДПРИЯТИЙ... 35

Общие вопросы....................................................................... 35

Комплектование племенных предприятий быками-произ

водителями.............................................................................. 38

Ветеринарное обеспечение племенных предприятий............ 41

Некоторые особенности кормления быков-производителей. 46

Содержание производителей и уход за ними......................... 49

Подготовка производителей к использованию....................... 51

Подготовка помещений перед взятием спермы..................... 52

Подготовка инструментов и материалов к работе со спермой..... 55

Взятие спермы у быков........................................................... 57

Первичная оценка качества спермы....................................... 58

Технология разбавления спермы............................................. 63

Расфасовка и герметизация спермы........................................ 74

Работы по Харьковской технологии................................ 74

Работы при консервации спермы в пайеттах.................. 78

Работы при замораживании спермы в ампулах............... 78

Работы при замораживании спермы в открытых гранулах......... 78

Маркировка спермодоз........................................................... 80

Глубокое замораживание спермы........................................... 84

Биологический и санитарный контроль качества заморо­женной спермы.................................................. 88

Длительное хранение спермы производителей...................... 93

ИСКУССТВЕННОЕ ОСЕМЕНЕНИЕ..................................... 95

Организация работы в хозяйствах........................................... 95

Работа со спермой в хозяйствах.............................................. 101

Выборка животных для осеменения....................................... 104

Методы и техника искусственного осеменения..................... 109

Осеменение коров маноцервнкальным способом........... 110

Осеменение коров и телок ректоцервикальным спосо­бом............................................................................... 113

Осеменение коров и телок визоцервикальным способом.... 115

Организация   искусственного осеменения в полевых условиях............................................................... 117

Организация осеменения животных в индивидуальных и фермерских хозяйствах..................................... 119

ИСКУССТВЕННОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ЖИВОТНЫХ

МЕТОДОМ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЗАРОДЫШЕЙ               121

Вопросы организации ............................................................. 121

Отбор доноров ......................................................................... 126

Особенности кормления и содержания коров-доноров и

телок-реципиентов ........................................................... 128

Методы вызывания суперовуляции ........................................ 129

Осеменение доноров ............................................................... 130

Вымывание эмбрионов из матки донора ................................ 132

Поиск и оценка качества -эмбрионов ...................................... 134

Краткосрочное хранение эмбрионов ...................................... 137

Микрохирургическое разделение эмбрионов ......................... 138

Глубокое замораживание и длительное хранение эмбрионов 139

Замораживание эмбрионов по медленному режиму ....... 139

Криоконсервация эмбрионов путем прямого погружения их в жидкий азот ................................................ 142

Оплодотворение ооцитов in vitro ............................................ 143

Метод и техника предварительного отбора гамет по полу ..... 147

Отбор реципиентов и пересадка эмбрионов ........................... 149

КРИОГЕННЫЕ МЕТОДЫ И ТЕХНИКА, ПРИМЕНЯЕ-

МЫЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ ................................................. ЬЗ

Средства получения холода ..................................................... 153

Лед ........ ........................................................................... 153

Холодильные машины ..................................................... 154

Сухой лед .......................................................................... 155

Ожижеииые газы .............................................................. 156

Развитие дыоаростроепия в Украине .................. , ................... 158

Системы использования криогенной техники в биотехно-

логии ................................................................................. 164

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ, КОТОРЫЕ ИСПОЛЬ­ЗУЮТСЯ В РЕПРОДУКТОЛОГИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ .................................................... К'8

СПИСОК АББРЕВИАТУР

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

---

Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 519; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!