ГЛУБОКОЕ ЗАМОРАЖИВАНИЕ СПЕРМЫ 9 страница

Активность, балл		Концентрация, млрд/мл
8		1,4	1,45	1,5	1,55	1,6	1,65	1,7	1,75	1,8	1.S5	1,9	1,95	2,0
Объем эякуля та, мл	Коли­чество среды №1	Количество среды №2, мл
1	1	26	27	28	29	30	31	32	33	34	35	36	37	38
2	2	52	54	56	58	60	62	64	66	68	70	72	74	76
3	3	78	81	84	87	90	93	96	99	102	105	108	111	114
4	4	104	108	112	116	120	124	128	132	136	140	144	148	152
5	5	130	135	140	145	150	155	160	165	170	175	180	185	190
6	6	156	162	168	174	180	186	192	198	204	210	216	222	228
7	7	182	189	196	203	210	217	224	231	238	245	252	259	266
8	8	208	216	224	232	240	248	256	264	272	280	288	296	304
9	9	234	243	252	261	270	279	288	297	306	315	324	333	342
10	10	260	270	280	290	300	310	320	330	340	350	360	370	380
11	11	286	297	308	319	330	341	352	363	374	385	396	407	418
12	12	312	324	336	. 348	360	372	384	396	408	420	432	444	456
13	13	338	351	364	377	390	403	416	429	442	455	468	481	494
14	14	364	378	392	406	420	434	448	462	476	490	504	518	532
15	15	390	405	420	435	450	465	480	495	510	525	540	555	570
16	16	416	432	448	464	480	496	512	528	544	560	576	592	608
17	17	442	459	476	493	510	527	544	561	578	595	612	629	646
18	18	468	486	504	522	540	558	576	594	612	630	648	666	684
19	19	494	513	532	551	570	589	608	627	646	665	684	703	722
20	20	520	540	560	580	600	620	640	660	680	700	720	740	760

Примжание. При активности после размораживания, равной 40% в грануле будет не менее 5 млн спермиев с прямолинейно поступательным движением, при 50% • 6,2 млн; при 60% — 7,5 млн

 

отношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре (18...20 °С) в течение 5...6 минут, до окончания оценки эякулята.

Затем дополнительно ее разбавляют средой № 2, имеющей комнатную температуру, до необходимой кон­центрации спермиев в единице объема и немедленно рас­фасовывают. При этом концентрация желтка снижается до 0,5...2 %, что не сказывается отрицательно на криорези-стентности фортифицированных спермиев.

Разбавление спермы при замораживании по другим технологиям описано в разделе "Расфасовка и герметиза­ция спермы".

РАСФАСОВКА И ГЕРМЕТИЗАЦИЯ СПЕРМЫ Работы по Харьковской технологии

Для расфасовки и герметизации спермы в пленочную упаковку по Харьковской технологии используют разрабо­танную нами полимерную трубку с наружным диаметром З...3,8 мм, толщиной стенки 100...120 микрометров, кото­рую стерилизуют ультрафиолетовыми лучами с помощью помещенной над ней на высоте 20 см лампы ПРК-2 в те­чение 25 минут.

Стерильная трубка выпускается заводами в виде бухт, содержащих 250 и 800 метров. Бухты должны быть запая­ны в полиэтиленовый мешок и упакованы в жесткую тару. Намотанная на боббину бухты, трубка должна иметь сво­бодную проходимость воздуха или жидкости. Для повыше­ния прочности трубка в лаборатории МНПА "Эмбрион" обрабатывается физическим полем по специальной техно­логии. Трубка, полученная непосредственно с завода, эти­ми качествами не обладает. Поэтому снабжение племен­ных предприятий трубкой осуществляет ассоциация.

Бухту после предварительного облучения ультрафиоле­товыми лучами помещают на вертушку аппарата ПРЖ-2 для расфасовки и маркировки спермодоз (рис. 26).

ПРЖ-2 (рис. 27, 28) (Осташко и др., 1990) содержит привод 1, механизм протягивания трубки 2, сварочный механизм, механизм маркировки 3, соединительную муфту 4, распределительный вал 5 с закрепленными на нем ку­лачками 6 и 8 и отсекатель 9. Сварочный механизм вклю­чает две губки с прокладками. На верхней сварочной губке 10 укреплены нагревательный элемент в виде плоской ни­ти 11 и кассета 12 для защитной фторопластовой пленки 13. Последняя охватывает нить 11 и имеет возможность перемещения в направлении, поперечном относительно продольного закругленного выступа 14, выполненного в средней части нити П. Боковые кромки 15 нити закругле­ны. Чтобы не было неровностей пленки 13 на нагрева­тельном элементе, она фиксируется на верхней губке 10 скобой 16. Прокладка 17 верхней губки 10 выполнена из жесткого термостойкого материала, например из асбоце­мента, а прокладка 18 нижней губки 19 — из упругого тер­мостойкого материала, например из металлизированной резины — для предохранения губок от нагрева и создания жесткой опоры под нагревательный элемент, а также для возможности утопания продольного выступа 14 нагрева­тельного элемента. Сварочные губки 10 и 19 крепятся на кронштейнах 20. Упаковки 21 образуются из наполненного спермой рукава 22.

Устройство работает следующим образом.

Наполненный спермой рукав трубки 22 помещают между губками механизма 2 протягивания рукава, затем включают привод 1, передающий вращающий момент че­рез соединительную муфту 4 на распределительный вал 5 и кулачки 6 и 8. Механизм 2 протягивания рукава под дей­ствием торцевого кулачка 6, вращающегося на распредели­тельном валу 5, подает рукав 22 на длину упаковки 21 к сварочному механизму. Перед подачей рукава механизм 3 производит маркировку упаковки 21. Под действием пру­жины, стягивающей кронштейны 20, сварочные губки 10 и 19 сжимаются, вытесняя сперму за нагревательный эле­мент по обе стороны от продольного закругленного высту­па 14 нагревательного элемента. По мере сжатия свароч­ных губок выступ 14 нагревательного элемента утопает в упругой прокладке /<" сварочной губки 19. После полного сжатия губок на нагреватель­ный элемент подается напряжение, происхо­дит сварка упаковки и одновременное ослаб­ление шва упаковки по выступу 14 нагреватель­ного элемента (за счет большей концентрации электричества по вы­ступу нагревательного элемента). Чтобы не

происходило ослабления шва по краям (кромкам) нагрева­тельного элемента, кромки 15 нити 11 округлены.

По окончании сварки прекращается подача напряже­ния на нагревательный элемент, кулачок 8 начинает раз­водить сварочные губки 10 и 19 и в этот момент отсекатель 9 отделяет готовую упаковку 21 по ослабленному месту сварки от рукава 22. При этом на кромке отсеченной упа­ковки 21 и на кромке рукава 22 образуются два равноцен­ных сварочных шва с достаточным запасом ширины про­вариваемого участка.

Для исключения налипания термопластичного мате­риала упаковочного рукава на нагревательный элемент он защищен фторопластовой пленкой 13, размещенной в кас­сете 12, расположенной на верхней сварочной губке 10. Пленка из кассеты 12 протягивается вниз, охватывает на­гревательный элемент и крепится скобой 16. Прокладки 17 и 18 обеспечивают параллельность сварочных губок, а сле­довательно, качество и надежность сварки.

Верхняя сварочная губка снабжена кассетой с подвиж­ной фторопластовой пленкой, что позволяет экономно ее использовать при замене подгоревших участков. Для этого необходимо снять скобу 16, фиксирующую пленку на губке 10, переместить прогоревший участок с нагревательного элемента и снова зафиксировать ее на губке скобой.

Во время работы трубку (рукав) протягивают по на­правляющему желобу к автомату, муфту спермоприемника соединяют с трубкой и после хорошего перемешивания выдавливают в нее разбавленный эякулят. Для исключения обратного попадания спермы в спермоприемник запол­ненную трубку перекручивают в месте соединения с муф­той и зажимают большим и указательным пальцами. За-

76

полненную спермой трубку подводят к маркировочному и сварочному узлам аппарата, который автоматически разде­ляет ее на отдельные спермодозЫ объемом 0,2...0,25 мл с одновременной герметизацией каждой дозы и маркиров­кой холодным способом (рис. 29). Расфасованные спермо-дозы переносят в холодильник с температурой 3...4 °С.

В процессе отладки или регулировки полуавтомата ПРЖ-2, обязательным технологическим приемом должна быть контрольная проверка на герметичность спермодоз, расфасованных каждым полуавтоматом (не менее 500 доз). При этом можно фасовать вместо спермы адекватную смесь первой и второй среды.

Изображенное на рис. 30 устройство для контроля гер­метичности эластичных упаковок со спермой (Осташко и др., 1991), включает: основание 1 с индикаторным покры­тием 2 и регулируемыми по высоте ограничителями 3, а также подвижно закрепленный нагружатель 4 с прижим­ными замками 5.

Устройство работает следующим образом: с помощью ограничителя между основанием и нагружателем выстав­ляется зазор, равный 2,6...2,9 мм, что обеспечивает воз­можность приложения равного на все спермодозы давле­ния — 3...5 кг. Далее спермодозы размещаются в один слой на индикаторном покрытии основания, а к нагружа-телю с помощью прижимных замков прикладывается уси­лие. После экспозиции нагрузки 5—10 сек., в течение ко­торой оболочки спермодоз находятся в деформированном состоянии, а нагружатель упирается в ограничители, визу­ально определяются разгерметизированные спермодозы. Негерметичными считаются те упаковки, под которыми после экспозиции в нагруженном состоянии в течение 5... 10 сек. на индикаторном покрытии появляются следы просачивания содержимого или образуется большой пузы­рек воздуха в спермодозе.

Спермодозы, прошедшие контроль на герметичность, подвергаются криоконсервации. После оттаивания все они должны также сохранять герметичность оболочки.

При выявлении разгерметизированных спермодоз пос­ле оттаивания зазор уменьшают на 0,1...0,2 мм, а при на­личии сохранивших герметичность, но с деформацией оболочки в процессе контроля, зазор увеличивается на 0,1...0,2 мм.

Работы при консервации спермы в пайеттах

При консервировании спермы по французской или ландсхутской технологиям в пайеттах или минитюбах эякуляты, как и при Харьковской технологии, разбавляют

77

в спермоприемнике средой № 1 и № 2. Спермоприемник с разбавленной спермой подсоединяют к соответствую­щему автомату для фасовки и герметизации спермы в по­лимерные соломинки и фасуют в соответствии с требова­ниями технологии. При этом используются специальные устройства для автоматической или ручной фасовки. Рас­фасованные и загерметизированные пайетты со спермой передают для замораживания.

Работы при замораживании спермы в ампулах

При консервировании спермы в полимерных ампулах ее переливают в специальный флакон емкостью 250 мл, который вставляют в гнездо аппарата ФАЖ для фасовки и герметизации жидкости в эластичные ампулы, регулируют дозу и фасуют с одновременной запайкой. В случае ис­пользования для герметизации спермы стеклянных ампул по американской технологии ее разливают отдельно на фасующем аппарате и герметизируют на газовом пламени. Ампулы фиксируют в специальных держателях, в которых они замораживаются и хранятся до использования.

Замораживание спермы в открытых гранулах

При замораживании спермы в открытых гранулах эяку­лят аналогичным образом разбавляют в спермоприемнике средой № 1 сразу до нужной концентрации спермиев в мл. При этом в первую среду обязательно вводят согласно ин­струкции антибиотики. Спермоприемники с разбавленной спермой подвешивают на специальном штативе и поме­щают в холодильник при температуре 4...5 градусов. После 4...6 часовой эквилибрации сперму через подсоединенную к муфте спермоприемника пипетку с зажимом накапывают в лунки блока отформованного сухого льда или — фторо­пластовую пластину, охлажденную до температуры —79...—80 °С. При этом сперму хорошо размешивают путем непрерыв­ной деформации стенки спермоприемника рукой. По ис­течении 10 минут гранулы погружают в хладоагент.

Таким образом харьковская технология наилучшим об­разом обеспечивает процессы асептического взятия, оцен­ки, разбавления и эквилибрации спермы независимо от дальнейшей технологии ее фасовки и криоконсервации и отвечает требованиям унификации. При этом все процес­сы осуществляются в закрытой системе непосредственно в спермоприемнике, исключая необходимость использова­ния какой-либо посуды.

78

Следует подчеркнуть, однако, что предъявляемые к сперме требования стандартизации могут быть выполнены лишь в тех случаях, если каждая спермодоза имеет инди­видуальную герметическую оболочку и четкую идентифи­кацию. Поэтому во всех случаях следует стремиться ис­пользовать только технологии, предполагающие гермети­зацию спермодоз.

Между тем, несмотря на достигнутые успехи в области криобиологии гамет и зигот, даже при самых удачных тех­нологиях криоконсервации 30...50 % генетического мате­риала повреждается. Эти потери особенно чувствительны в случаях накопления запасов спермы и эмбрионов от вы­дающихся животных — рекордистов породы и улучшателеи потомства. Очень большие потери материала имеют место при криоконсервации фрагментов эмбрионов или отдель­ных бластомеров, необходимых при проведении работ по клеточной инженерии или при получении трансгенных генотипов.

В связи с этим исследования в области совершенство­вания методов криоконсервации биологических материа­лов не потеряли своей актуальности. Еще в шестидесятые годы нами (Осташко, 1968) описаны криопротективные свойства сыворотки крови млекопитающих (овцы и коро­вы). Установлено, что 20 % концентрация инактивирован-ной сыворотки телки или овцы, добавленная в сперму бы­ка, обеспечивала сохранение 30 % спермиев после замора­живания в жидком азоте, а применение сыворотки в ком­бинации с глицерином давало симультанный эффект. При дальнейшем изучении этого вопроса нами (Генсицкий, Осташко, Исаченко) открыт новый тип криопротекторов протеоновой природы, выделенный из тканей пойкило-термных организмов, использование которого позволило получать активность криоконсервированной спермы быков и хряков не менее высокую, чем при применении глице­рина или других криопротекторов этого типа. Исключи­тельную важность представляют эти данные уже потому, что механизм протективного действия этих соединений принципиально отличается от механизма криопротекции всех других известных до сего времени криопротекторов, а это является серьезным аргументом для создания симуль­танных криопротекторов, способных не только уточнить теорию современной криобиологии, но и существенно усовершенствовать технологию глубокого замораживания и длительного хранения генетических материалов, а также увеличить возможности использования для консервации этих материалов методом лиофилизации.

 

МАРКИРОВКА СПЕРМОДОЗ

В процессе создания и совершенствования Харьков­ской технологии криоконсервации спермы разработаны способы индентификации спермодоз, обеспечивающие необходимый уровень учета и контроля при крупномас­штабной генетической селекции в скотоводстве.

Нами (Осташко и др., 1980) разработан термический способ маркировки упаковок с живыми биологическими суспензиями и устройство для его осуществления. Способ обеспечивает достаточно прочное удерживание красителя на поверхности полимерной упаковки независимо от тем­пературы и наиболее четкое изображение. Недостатком является возможное термическое повреждение биологиче­ского материала. Поэтому при данном способе информа­цию наносят на поверхность полимерной трубки до ее сварки и разделения на отдельные гранулы-спермодозы. При этом участок трубки в зоне маркировки непосред­ственно перед нанесением информации приподнимают и маркируют пустую трубку через теплоизолирующую пленку.

На рис. 31 изображен общий вид устройства для мар­кировки спермодоз в блоке с ПРЖ, а на рис. 32 — прин­цип неповреждающего нанесения печати горячим спосо­бом. Осуществляют его следующим образом. Рукав 1, за­полненный живой биологической суспензией, подается к маркировочному устройству в приблизительно горизон­тальном положении. В такт подачи участок трубки в зоне маркировки располагается над толкателем 2, опираясь на него, а сверху — промежуточная теплоизолирующая плен­ка 3, например полиэтилентерафталатная (ПЭТФ) с кра-

---

Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 164; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!