ГЛУБОКОЕ ЗАМОРАЖИВАНИЕ СПЕРМЫ 3 страница

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 14Следующая ⇒

А₀— активность нативной; А_е— активность после пробоя; А_з— активность после замораживания; С_і, пл — концентрация (%) соответствующего липида (кислоты) в плазме. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1.

Достоверность корреляции: * — 0,05 <Р<0,1; ** - Р<0,05; *** — Р<0,01; **** — Р<0,001.

таблицы, активность свежей спермы практически не зависит от состава липидов. В то же время обнаружено, что возрастание содержания холестерина и доли насыщенных жирных кислот в нативных спермиях повышает их устойчивость к замораживанию и действию ИЭПВН (Р<0.001). Между содержанием лизоформ и устойчивостью мембран наоборот — существует достоверная отрицательная связь (Р<0,001). Известно, что возрастание содержания холестерина повышает прочность мембран клеток (Пасечник, 1982), устойчивость к электрическому пробою (Катков. 1983) и температурному шоку (Darrin-Bennet с соавт., 1974). Рядом авторов замечено, что увеличение отношения холестерин/фосфолипиды ведет к возрастанию оплодотворяющей способности спермиев (Волоскова, 1938, Narsapurkar, Hukeri, 1978). Известно, что холестерин в определенных условиях ингибирует действие перекисного окисления фосфолипаз (Владимиров, 1983). Кроме того, он сглаживает фазовый переход, препятствует кластеризации и фазовому разделению липидов ( Белоус, Бон-даренко, 1983). Лизоформы же дестабилизируют мембраны (Пасечник, 1983; Чизмаджев с соавт., 1983; Милованов с соавт., 1975; White et all., 1973). Возрастание доли ненасыщенных кислот увеличивает жесткость мембран, снижает уровень перекисного окисления, повышает механическую

ттектромеханическую прочность мембран (Пасечник, o«V Чизмаджев, 1983; Осташко, Катков, 1982; Darrin-п net et all., 1974). Таким образом, желток модифицирует

боану в направлении, которое приводит к повышению ** ПРОЧНОСТИ и стабильности. После обработки желтком 66 оастает уровень холестерина, а степень ненасыщен-БОСТИ и количество лизоформ — снижается.

В дальнейшем многими авторами было создано больное количество разбавителей для спермы производителей азличных видов животных, составным элементом кото-оых является желток куриных яиц. В настоящее время желтоксодержащие разбавители спермы производителей стали основой производственной технологии искусственного осеменения.

Однако, как упомянутые выше авторы, так и ряд других .относят защитное действие желтка только к спермиям и только к повреждениям, связанным с резким падением температуры. Защитные же свойства при воздействии на различные клетки (форменные элементы крови, одноклеточные организмы, яйцеклетки, эмбрионы, клетки костного мозга, внутренних органов и пр.) в литературе не освещены, так же, как и защитные свойства желтка при воздействии на клетку различных других повреждающих факторов (механических, электромеханических, иммунных, радиационных, ферментных и др.). В связи с этим не было и достаточного теоретического объяснения механизма защитного действия желтка, который объяснялся снижением точки плавления плазмалогена спермиев за счет его разбавления более легкоплавким лецитином желтка, якобы проникающим внутрь клетки (Милованов, Соколовская, 1959). Поэтому J.A. Foulkes (1977), исследуя этот вопрос, заключил, что желток способствует стабилизации мембраны или уравновешиванию коллоидного давления окружающей среды.

На основании выполненных нами работ (Осташко, 1963, 1964, 1968, 1978) защитный механизм яичного желтка при воздействии температурных, иммунных, осмотических, механических и других факторов объясняется образованием на поверхности плазматической мембраны клеток дополнительных структур за счет адсорбции содержащихся в нем липидов или липопротеинов. В нашей работе устатке, 1963) установлено, что обработка клеток (спермиев ПоВрИтроЦит,ов) желтком также хорошо защищает их от ок ^СДений при резком падении осмотического давления печив аЮЩСЙ среды' как и от холодового удара. Это обес-ается тем, что содержащийся в желтке лецитин, имея сродство с липопротеидным покровом клеток, наслаивает ся на их поверхности и образует липидную фазу. Кро\» того, при наслоении лецитина значительно увеличивается толщина клеточной оболочки. Поэтому для проявления холодового удара у обработанных желтком клеток необходимо создать в несколько раз больший, чем у необрабо' танных, осмотический градиент на границе "оболочка клетки — окружающая среда".

Этот вывод подтверждается теоретическими исследованиями механической устойчивости мембранной оболочки" Формула Лапласа для тонких сферических оболочек связывает перепад давлений на мембране Д-Р, тангенциальные составляющие напряжений в мембране <rTg, толщину оболочки А и ее радиус кривизны R следующим образом:

2σ_τgh

∆Р = -------------------------------. (1)

Наличие критического объема клетки, т.е. такого его значения, при котором дальнейшее растяжение невозможно и мембрана разрывается, говорит о том, что существует критическое значение тангенциальных составляющих напряжения σ^кр. Из формулы (1) следует, что:

_τg

2∆Р _мах R

σ^кр = -------------------

_τg h

где ∆Р _мах — максимальный перепад давлений на мембране. Поскольку мембрана, как фортифицированная, так и незащищенная дополнительным лшгидным слоем, разрывается при одинаковых критических значениях тангенциальных напряжений, с увеличением толщины оболочки клетка сможет выдерживать больший перепад давлений на мембране.

Вышеизложенное численно справедливо лишь при такой же упругости утолщающего слоя, как и у собственно цитоплазматической мембраны. Поэтому под толщиной Л в формулах (1), (2) следует понимать механический эквивалент толщины, который может и не соответствовать толщине как линейной характеристике.

В 1966 году нами проведены эксперименты (Осташко, 1967) по гемолизу эритроцитов барана, обработанных водно-солевым экстрактом желтка куриного яйца, в которых компонентами реакции являлись:

а) 2,5 % взвесь эритроцитов баранов в физиологическом растворе хлористого натрия;

б) фабричный гемолизин (гемолитическая иммуносЫ-воротка против эритроцитов баранов);

Таблица 4. Увеличение объема (толщины) "липидной" оболочки на поверх-мембраны спермия в зависимости от концентрации желтка в окружающей среде

Концентраты желтка в разбавителе, %	Для разбавленной спермы
	ингакгной		после температурного шока
	объем(мкл)	толщина(А)	обьем(мкл)	толщина(А)
5 10 20 40	0,75 0,98 1,48 2,04	40 60 140 230	0,18 0,5 0,97 1,2	25 42 90 101

в) фабричный комплемент (сыворотка крови морской свинки) в соответствующих титрам количествах.

Реакция протекала in vitro. Было установлено, что обработанные желтком эритроциты приобретают устойчивость к действию специфической гемолитической сыворотки и комплемента, которая сохраняется даже после неоднократного их отмывания физиологическими растворами. Последнее свидетельствует о том, что компоненты желтка каким-то образом прикрепляются к поверхности клетки и защищают ее от действия гемолитика, что свидетельствует о проявлении эффекта фортификации.

Выдвинутое нами теоретическое положение о механизме защитного действия липоидных соединений (Осташко, 1963) в дальнейшем было подтверждено в работах, выполненных совместно с аспирантами Н.Я. Чумаковым (1965) и О.И. Душейко (1972), в которых при использовании метода электромагнитной спектроскопии в диапазоне р-дисперсии на специально сконструированном спектроскопе было показано, что толщина липоидной компоненты цитоплазма-тической мембраны равна 37 ангстремам и что обработка спермиев быка содержащими липиды компонентами желтка ведет к увеличению толщины липоидного слоя цито-плазматической мембраны в 2...3 раза пропорционально концентрации желтка (табл. 4).

Позже этот факт подтвердили P. Watson (1975) и Г.К. Ки-чев (1976). Прочность удержания липидных компонентов на поверхности спермиев установлена в нашей работе ^исташко, Павленко, 1976). Из нее следует, что даже 6-кратное отмывание спермиев не лишает сообщаемой им УСТОЙЧИВОСТИ к температурному шоку. Англичанин JA Foulkes док также подтвердил данные наших исследований. Он прикв"' ЧТ° Меченные по с'4 липиды из яичного желтка на^>5Пляк>тся к поверхности спермиев и удерживаются Дадсс после 20-кратного отмывания. В дальнейшем

нами было установлено, что добавление в систему гемоди тической реакции 3...4-кратного избытка комплемента С конце концов вызывает гемолиз фортифицированных троцитов.

Механизм защитного действия липидных соединений вероятно, заключается в следующем: в специфической иммунной гемолитической реакции комплекс антиген—, антитело фиксирует комплемент, обладающий способностью ферментировать сенсибилизированные липоидные структуры плазматической мембраны эритроцитов. Увеличение мощности липоидных структур не ведет к прекращению реакции, но истощает действующую силу комплемента. Однако если добавлять в систему новые порции комплемента, реакция будет продолжаться вплоть до разрушения собственно мембранных липидов и наступления гемолиза. В этом заключается так называемый антикомплементарный эффект лецитина.

Аналогичный защитный механизм имеет место при фортификации эритроцитов холестерином, что обеспечивает нейтрализацию гемолитического действия сапонина (Дульцин, 1958). Надо полагать, что таким образом можно нейтрализовать действие и ряда других гемолитиков, если подобрать соответствующие фортификанты.

В дальнейших исследованиях, проведенных совместно с аспирантом М.К. Дибировым (1978), ставились задачи выяснить:

— сохраняется ли защитное действие липидов яичного желтка при протекании реакции гемолиза in vivo;

— распространяется ли их защитное действие на другие иммунные реакции;

— влияет ли обработка клеток лигшдами на проницаемость их плазматической мембраны;

— распространяется ли их защитное действие на другие виды клеток.

В качестве источника липидов использовался водно-солевой или эфирный экстракт желтка куриных яиц и очищенный лецитин. Материалом служили сыворотки различных видов животных и человека, эритроциты человека, барана и кролика, обработанные лигшдами с последующим отмыванием и интактные, сперма различных видов, а также резус-негативная гемолитическая материнская сыворотка. Острые опыты проведены на интактных овцах породы прекос и кроликах. В них применены классические методики реакции гемолиза, связывания комплемента и агглютинации с использованием кровяных сывороток и фабричных компонентов — гемолитической сыворотки

Таблица 5. Защитное действие желтка In vitro при интрявенозном введении

Животные	Количество животных в опыте	Из них
		получивших желток и гемолитик		поучивших гемолитик и физиологический раствор
		всего	проявивших гемолитический синдром	всего	проявивших гемолитический синдром
Бараны Кролики	9 15	6 10	— —	3 5	3 5

против эритроцитов кролика, полученной путем гипериммунизации морских свинок и комплемента.

В остром опыте использовали три группы баранов раз-дачного возраста. Животным первой и второй групп был введен внутривенно водно-солевой экстракт яичного желтка, а животным третьей — физиологический раствор хлористого натрия в том же объеме. Спустя 10.. .15 минут животным второй и третьей групп была введена внутривенно специфическая гемолитическая сыворотка и комплемент (титр гемолизина был 1:600 и 1:2000, комплемента — 0,28). Все компоненты готовились асептически на 0,85 % растворе хлористого натрия с добавлением 165 тыс.ед. пенициллина на 1 мл. Животным первой группы было введено внутривенно соответствующее количество физиологического раствора хлористого натрия (контроль).

Животные первой группы не проявили заметных клинических признаков реакции организма на введенные препараты. Второй — проявили реакцию, выражающуюся в кратковременном повышении температуры тела до 41 °С в течение 4.. .5 часов. Животные третьей группы проявили клинику острой гемолитической болезни, сопровождавшейся длительной лихорадкой, гемоглобинурией и падением концентрации эритроцитов до 2..3 млн в 1 мм . В большинстве случаев исход был летальным, отдельные животные выжили, но симптомы болезни у них наблюдались в течение 10 суток. Опыты на баранах и кроликах повторены трижды (табл. 5).

Таким образом, у животных второй группы гемолитическая реакция не проявилась благодаря фортификации их эритроцитов. Обращает на себя внимание тот факт, что гемолитическая реакция у этих животных не наступила во-ооще (наблюдения велись в течение 12 месяцев), хотя, на-аГаТЬ' """Р комплсмента в их крови восстановился. ОПЬ1тах экспериментально установлено неизвестное явление фортификации плазматической мембраны клеток лецитином (холинфосфоглицерид) и эфирным или водно-солевым экстрактом желтка птичьих яиц, выражающееся в защите эритроцитов от разрушительного действия специфических цитолитических антител и комплемента, проявляющееся как in vitro, так и in vivo. Следует предупредить, что при проведении подобных експеримен-тов на животных во избежание развития эмболии предназначенные для внутривенного введения препараты должны быть тщательно гомогенизированы, освобождены от желточных шариков и жировых капелек и приготовлены с соблюдением правил асептики и антисептики. В следующем эксперименте исследовались протективные свойства изучаемых липидов в реакции агглютинации. Схема опытов и результаты изложены в табл. 6, из которой видно, что после фортификации эритроцитов способность склеиваться при взаимодействии со специфической или неспецифическими сыворотками не подавляется. Опыты были повторены с использованием спермиев быка, барана и хряка с аналогичными результатами. Обработка желтком спермиев не подавляла их способности агглютинировать при взаимодействии с иммунными сыворотками крови.

Например, при смешивании спермы быка с нативной кровяной сывороткой спермин склеиваются по всей длине, образуя энергично движущиеся, на первый взгляд, гигантские спермин или склеиваются только головками, образуя частокол подвижных хвостов.

В следующем эксперименте ставилась цель выяснить, как влияет фортификация плазматической мембраны клеток на ее проницаемость. Для этого изучали изменение объема эритроцитов барана и спермиев быка в зависимости от осмомолярности окружающей среды. В результате проведенных исследований установлено, что фортификация клеток липидами яичного желтка или лецитином не ведет к заметному изменению проницаемости их цитоплазматической мембраны.

Таблица 6. Исследования защитного свойства желтка в реакции изоагглюти-дции и гетероагглютинации

Эритроциты (2,5 % взвесь)	Сыворотка крови
	человека по группам				лошади	коровы	барана	кролика
	1	II	111	IV
Барана + 20 % желтка Человека по группам крови + 20% желтка I II III IV Барана Человека по группам крови I II III IV	++++* — — — — ++++ — — — —-	++++ — —- ++++ ++++ ++++ — — ++++ ++++	++++ — ++++ — ++++ ++++ — ++++ — ++++	++++ — ++++ ++++ — ++++ — ++++ ++++ —	++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++	++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++	— * ++++ ++++ ++++ ++++ — ++++ ++++ ++++ ++++	++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++

* ++++ -агглютинация эритроцитов

— - отсутствие агглютинации эритроцитов

Полученные в описанных экспериментах факты позволили предположить, что при взаимодействии с липид-ными соединениями на поверхности клетки липоидная фаза образует не сплошной слой, а покрывает только ли-пофильные участки цитоплазматической мембраны, делая их более прочными и недоступными для участия в иммунобиологических реакциях. Этот факт указывает на липо-филъную природу компоненты мембранного антигена клетки, ответственной за протекание цитолитической реакции. При этом остаются свободными от липоидного покрова гидрофильные участки поверхности клеточной мембраны, включающие, по всей вероятности, компоненту мукополисахаридной или белковой природы, ответственную за возникновение реакции агглютинации. Все это позволило предположить, что антигенная структура цитоплазматической мембраны имеет мозаичное строение в соответствии с описанной ранее гипотезой (Robertis, Novinski, Saez, I960). Это подтверждает тот факт, что после обработки спермиев и эритроцитов желтком интенсивность их обменных процессов с окружающей средой существенно не снижается, т.е. поры остаются открытыми, что также подтверждено данными гемато- и сперматокрита, Об этом же свидетельствует факт сохранения проницаемости цитоплазматической мембраны спермиев и эмбрионов к глицерину, диметилсульфоксиду, пропандиолу и др. Эти результаты хорошо укладываются в рамки гипотезы мозаического характера строения цитоплазматической мембраны и дают основание предположить, что поры мембраны как раз и расположены на гидрофильных ее участках. Такая точка зрения хорошо согласуется также с теоретическими построениями А.Фрей-Висслинга (1976). Дцесь возможен вариант, когда гидрофобные участки цитоплазматической мембраны (ЦПМ) соединяются с гидрофобными "хвостами" молекул полярных липидов, а гид-роц:>илъные участки ЦПМ — с полярными "головками" этих молекул. В данном случае поры располагаются на стыках участков и сохраняется мозаический характер строения ЦПМ. При наличии в среде и полярных и нейтральных липидов могут иметь место оба варианта взаимодействия. В связи с этим появилась возможность уточнить механизм защитного действия желтка при температурном шоке клеток: обработка клеток желтком делает цитоплаз-матическую мембрану механически более прочной и менее поддающейся деформации при воздействии резких осмотических перепадов, вызванных уравновешиванием температурных градиентов, имеющих место при температурном шоке.

Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 136; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 234 5 6 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!