ГЛУБОКОЕ ЗАМОРАЖИВАНИЕ СПЕРМЫ 2 страница

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 14Следующая ⇒

Как уже отмечалось, для организации крупномасштабной селекции начал использоваться метод овотрансплан-тации, который представляет собой искусственное перенесение плода в организм самки. Это повлекло за собой необходимость разработки отечественной технологии и комплекса расходуемых материалов .для его осуществления.

Технология работы современного предприятия по искусственному оплодотворению маток (овотрансплантации) должна обеспечивать:

— получение максимального количества полноценных эмбрионов от каждого донора;

— сохранение высокой приживляемости в организме самки свежих и замороженных эмбрионов независимо от сроков их хранения;

высокий уровень приживляемости половинок свежих и деконсервированных эмбрионов;

— санитарный уровень законсервированного генетического материала; способы осеменения доноров и пересадки зародышей должны гарантировать предотвращение

распространения заразных и гинекологических заболевании,

— технология должна быть простой и удобной для эксплуатации в условиях сельскохозяйственных предприятий и скотных дворов.

Применение метода искусственного оплодотворения маток позволяет решать ряд селекционных задач, а именно:

— ускорение получения и увеличение количества бычков от выдайощихся коров;

— сокращение интервала между генерациями, при этом необходимо следить, чтобы оценка донора была достаточно строгой и ограничивать рост имбридинга;

— упрощение перемещения на значительные расстояния больших массивов скота за счет криоконсервации эмбрионов;

— решение ветеринарных аспектов: при определенной обработке через эмбрионы не передается ряд инфекционных и вирусных заболеваний (лейкоз, ринотрахеит, бруцеллез и др.);

— получение потомства от особей, неспособных к воспроизводству;

— получение монозиготных животных и клонов при пересадке отдельных бластомеров;

— контролирование пола потомства;

— развитие технологии искусственного создания и размножения высокопродуктивных генотипов.

К сожалению, известные в мире технологии пересадки эмбрионов еще не в состоянии полностью удовлетворить перечисленные выше требования, что является одним из стимулов интенсивных исследований в этом направлении во многих странах.

Творческими коллективами институтов — членов Международной научно-производственной ассоциации "Эмбрион" проведены теоретические, опытно-конструкторские и научно-производственные исследования, позволившие раскрыть ряд новых факторов, играющих важную роль в механизмах повреждения мембранного аппарата клеток, наложить их на технологию охлаждения, замораживания и микрохирургии эмбрионов и создать новую технологию искусственного оплодотворения самок.

Применение новой технологии позволяет увеличить извлечение эмбрионов на 23—28 %, выход стерильных смывов из матки доноров до 95 %, повысить приживляе-мость охлажденных и замороженных эмбрионов крупного рогатого скота до 68 %, а овец до 75 %.

Создан комплект модернизированной технологической линии, получивший название "Харьковская технология овотрансплантации" (рис. 3). Это не только освобождает Украину от иностранной зависимости в данном вопросе, но даже дает возможность сделать новую технологию предметом экспорта.

Разрабатывается технология доращивания яйцеклеток коров и их оплодотворения in vitro, позволяющая получать эмбрионы из боенского материала и пересаживать их реципиентам для получения идентичных телят. Дальнейшее развитие этого направления позволит создать технологию размножения животных in vitro из

дезинтегрированных эмбрионов. Фактически появляется возможность вести селекцию без каких-либо ограничений, связанных с нехват-кои генетического материала.

в перспективе стоит вопрос конструирования генотипов путем клеточной и генной инженерии. Однако для развития этого направления исследования необходимо создать биотехнологическое предприятие по производству биологически активных сред, препаратов, а также по развитию гибридомных технологий получения моноклоналъ-ных и поликлоналъных антител для иммуноферментного анализа гормонов, интерферонов, ферментов и других соединений.

На базе разработанных технологий искусственного оплодотворения и осеменения животных создана Международная научно-производственная ассоциация "Эмбрион", членами которой являются племенные предприятия 16 областей России и 14 областей Украины. Принимают участие в ее деятельности специалисты Монголии, Греции, Испании, Мали, Нидерландов, Швейцарии, Германии и других стран. Кроме 37 племенных объединений в ее состав входят 11 научно-исследовательских учреждений, 5 заводов, 5 вузов, ряд конструкторских бюро и хозяйств. Она разрабатывает и производит 23 позиции изделий для искусственного осеменения и искусственного оплодотворения самок, снабжает ими племенные предприятия и центры.

Научно-производственная ассоциация "Эмбрион" имеет свою, финансируемую ГКНТ Украины, государственную научную программу до репродуктологии "Разработать и внедрить в практику современную теорию и конкурентоспособные системы и технологии создания и размножения высокопродуктивных генотипов сельскохозяйственных животных", координируемую сеть исполнителей, она стала центром в области воспроизведения сельскохозяйственных животных

В данном издании излагаются новые комплексные технологии работы племенных предприятий (рис. 1), искусственного осеменения (рис. 2) и искусственного оплодотворения животных методом овотрансплантации (рис. 3).

НЕКОТОРЫЕ ВОПРОСЫ ТЕОРИИ

Харьковские технологии работы со спермой и эмбрионами представляют собой органически взаимосвязанную совокупность методов, материалов и технических средств, объединенных поточной замкнутой системой процессов асептического взятия, оценки, замораживания и использования гамет и зигот с герметизацией спермодоз в виде облицованных в полимерную оболочку замаркированных гранул, а эмбрионов — в специальные плоские оптически прозрачные пайетты.

Они включают новые достижения в вопросах комплектования, выращивания, кормления, содержания и эксплуатации самцов и самок; взятия, оценки, разбавления, упаковки, криоконсервации, биологического и санитарного контроля гамет и зигот, асептического осеменения или оплодотворения маток, а также определения оптимального времени осеменения и диагностики ранней беременности животных.

Созданию новых технологий предшествовали теоретические разработки, что позволило выявить причины и механизм криоповреждений клеток в процессе возникновения температурных градиентов и фазовых переходов в системе "клетка—среда", уточнить механизмы криопротекции мембранного аппарата клеток, разработать оригинальные способы обработки гамет и зигот и создать режимы замораживания. При этом нами установлено новое явление, которому мы дали название «Эффект фортификации»* биологических структур плазматической мембраны клеток ли-пидными соединениями" (Осташко, 1980; 1982; 1984). (Термин "Эффект фортификации" был введен в биологию Ф И Осташко 18 июня 1980 года на IХ Интернациональном конгрессе по вочпроизведению и искусственному осеменению животных в Мадриде).

Материалы по созданной нами теории фортификации мембранного аппарата клеток липидными соединениями до настоящего времени нигде в полном объеме не публиковались, поэтому целесообразно изложить их в данном издании, в котором описано ряд технологий, разработанных на ее основе.

В процессе взаимодействия с окружающей средой клетки или одноклеточные организмы могут подвергаться экстремальным воздействиям, приводящим к повреждению или полному их разрушению. Особенно большое разрушительное действие на клетки оказывают проникающая радиация, цитолитические иммунные тела, токсины и ферменты, резкие температурные, осмотические и гидростатические перепады, фазовые переходы и прочее.

В зависимости от того, где происходит разрушение клеток — форменных элементов крови, костного мозга, яйцеклеток, спермы, микробов, — внутри живого организма или in vitro при их консервации и хранении для клинических или народнохозяйственных целей — мы имеем дело с определенными заболеваниями человека, животного или с потерей биологического цитоматериала.

Например, при изосерологическом конфликте по резус-фактору у новорожденных вследствие разрушения эритроцитов имеет место гемолитическая болезнь, действие змеиного яда также характеризуется гемолитическим симптомом, являющимся следствием ферментативного разрушения клеток. Резкие осмотические колебания в процессе консервирования клеток вызывают повреждения механического характера, внезапное охлаждение — температурный шок и т.д.

Во всех перечисленных случаях (и в ряде других) гибель клеток происходит вследствие разрушения или повреждения прежде всего цитоплазматической мембраны. Следовательно, если увеличить мощность (толщину) или механическую прочность этой мембраны, можно повысить устойчивость клеток к воздействию повреждающих агентов. С другой стороны, местом приложения действия специфических цитолитических иммунтел, ферментов или токсинов также является плазматическая мембрана клеток, поэтому при ее фортификации можно изолировать чувствительные к этим ядам элементы клетки, устранить возможность контакта с ними или нейтрализовать их и таким образом предотвратить развитие специфической цитолити-ческой реакции или ферментативного процесса.

По данным Е. Робертис, В. Новинского и Ф. Саэса (1962); В. Стеккениуса (1965); А. Ленинджера (1974); А. Фрей-Висслинга (1976); Дж. Финеана с соавторами (1977) и шюгих других, цитоплазматическая мембрана большинства клеток животных содержит от 40 до 70 % липоидов я 30...60 % соединений и комплексов протеиновой и глякоидной природы. Липоиды представлены главным образом полярными соединениями — холестерином, фосфа-тйдКлэтаноламином, фосфатидилхолином (лецитин) сфинго-миэлином и другими нейтральными липидами и сложными гликолипидными и гликолипопротеидными комплексами. Известно, что все эти соединения активно взаимодействуют с разнообразными веществами липоидной природы, образуя в водно-солевых средах сложные структуры. Это позволило нам предположить, что при наличии в водно-солевых средах полярных липидных соединений последние, благодаря гидрофобным, полярным и кулонов-ским взаимодействиям, могут наслаиваться на липофилъ-ные и гидрофильные участки поверхности плазматической мембраны клетки, сообщая им устойчивость к вредным окружающим факторам или изолируя их от контакта с последними.

Например, В.К. Милованов и О.А. Селиванова (1932), а затем P. Phillips (1939) установили, что добавление в сперму быка желтка куриного яйца способствует повышению устойчивости спермиев к температурному шоку.

Изучая этот вопрос, В.К. Милованов пришел к заключению, что действующим началом яичного желтка являются фосфолипиды (в частности, лецитин) и липопротеиды. Эти же авторы доказали, что защитные фосфолипиды могут быть выделены и из других сырьевых источников: бобов сои, мозговой ткани, яичников, семенников (Милованов, 1962). Нами обнаружены антишоковые свойства у сока плодов^ облепихи. М. Hiroshi, Y. Nisikawa (1972) считают, что действующим началом желтка являются нейтральные липиды типа липовителлинов.

При изучении механизма защитного действия липидов В.К.Милованов (1962) предположил, что желток "разжижает" плазмалоген спермиев и предохраняет его от затвердевания при понижении температуры; при этом автор считал, что плазмалоген является важным источником энергии. Однако исследования, проведенные рядом авторов (Darrm-Bennet, 1974; Neil, Masters, 1972), показали, что Дипидный компонент спермиев практически не используется клетками как энергетический источник даже при дефиците других энергетических метаболитов. В новом варианте В.К. Милованов с соавторами (1984) предполагает, что желток понижает температуру фазового перехода мембран спермиев. Вместе с тем, не исключая влияния желтка на температуру фазовых переходов в мембранах спермиев отметим, что жирнокислотный состав липидов нативных спермиев характеризуется большим количеством полиненасыщенных кислот (Darrin-Bennet et all., 1974) и в этом плане мало отличается от липидов желтка.

С целью выяснения молекулярных механизмов протек-тивного действия желтка нами (Осташко, Катков, 1985) был изучен липидный состав мембран спермиев производителей до и после обработки куриным желтком. В опытах сперму разбавляли лактозо—глицерин—желточной средой № 1 согласно Харьковской технологии. Клетки отмывали от внеклеточного липида, затем лизировали, отделяли мембраны и экстрагировали из них липиды. После экстракции определяли липидный спектр и жирнокислотный состав липидов мембран. Разделение липидов проводили методом тонкослойной хроматографии, количественное определение липидов — с помощью качественных цветных реакций, процентный состав — по данным колориметрических измерений и денситометрирования хроматограмм. Процентный состав жирных кислот определяли с помощью газожидкостной хроматографии. В таблицах 1 и 2 приведены липидный состав и жирнокислотный спектр нативных и обработанных желтком спермиев. Как видно из таблиц, в количественном отношении (в пересчете на 1 миллиард клеток) в опыте достоверно повышается содержание холестерина и лецитина в мембранах и несколько снижено количество сфингомиелина и холинплазмалогена. Общее содержание липидов после воздействия желтка несколько повышено (за счет внедрения холестерина), однако количество фосфолигшдов в пересчете на одну клетку практически не меняется (Р>0,1). В то же время обработка желтком весьма значительно меняет качественный состав мембраны. В ней возрастает доля лецитина и холестерина, удельный вес остальных липидов (особенно сфингомиелина)- снижается (Р>0,01). Что касается жирнокис-лотного состава, то в результате обработки желтком в мембранах возрастает процент тугоплавких короткоцепочных кислот 16:0, 18:0, 18:1, а доля длинноцепочных полиненасыщенных (в основном 22:4) уменьшается. Коэффициент ненасыщенности в результате этого также снижается (Р<0,01). Это позволило предположить, что фазовые переходы в мембранах спермиев при замораживании не являются ведущей причиной криоповреждения. В противноу случае обработка желтком должна была бы снизить крио-резистентность клеток. Чтобы понять, в чем состоит основной молекулярный механизм фортификационного действия обработки желтком, нами была изучена связь между л^пщным составом и устойчивостью спермиев к замора-^^а^ию_и действию импульса электрического поля высо-сения ИЭПВН.

Таблица 1. Липидный состав (абсолютный и относительный) мембран на-

Липиды	Контроль		Спермии, обработанные желтком		Р
	мкМоль 10⁹клеток	%	мкМоль 10⁹клеток	%
JlФ СМ ХП ФХ ФС ЭАП ФЭА КЛ ХС НЛ ∑Л ∑ФЛ	0,07+0,01 0,24+0,02 0,59±0,03 0,39±0,03 0,0710,01 0,32+0,02 0,20+0,02 0,050,01 0,85+0,06 0,490,03 3,27+0,09 1,93Ю,09	2,2 7,4 18,0 12,0 2,1 9,7 6Д 1,6 25,9 15,0 100,0	0,06Ю,02 0,20+0,04 0,44+0,05 0,6710,06 0,05+0,02 0,34Ю,02 0,23+0,03 0,0510,02 1,15±0,08 0,47±0,05 3,6610,10 2,04+0,10	1,6 5,6 11,9 18,3 1,4 9,4 6,3 1,3 31,4 12,8 100,0	0,05<Р<0,0 *<0,001 <0,0001 *<0,01
Обозначения: Л — липиды; ФЛ — фосфолипиды; ЛФ — лизоформы; СМ — сфинго-миелин' ХП — холишиазмалоген; ФХ — фосфотидилхолин (лецитин); ФС — фосфо-гидилсерин' ЭАП — этаноламинплазмалоген; ФЭА — фосфотидилэтаноламин :кефалин); КЛ — кардиолишш; ХС — холестерин; НЛ — нейтральные липиды (90 диглипериды).

Таблица 2. Жирнокислотный спектр (%) мембран нативных и обработанных желтком клеток

(С, = 20 %, я = 6).

А	Контроль	Спермин, обработанные желтком	Р
14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 20:4 22:6 Альд Др К_ненас.	2,3 9,5 7,4 5,3 4,7 4,0 51,2 13,9 1,1 3,1	4,6 10,2 9,9 5,4 4,0 3,5 41,8 12,7 1,6 2,2	* 0,05 <Р< 0,1 <0,05 * <0,05 **** <0,01

Обозначения:. А — число атомов углерода; : — число двойных связей; Альд—альдегид плазмалогенов; К_ненас.– коэффициент ненасыщенносги:

% полиненас.

К_ненас. = -------------------------------------------- ;

% нас.

Др — неидентифшщрованы (< 1 %).

Достоверность оттний: * — 0,05 <Р< 0,1; ** — P≤O.05; *** — P≤O.01; **** — P≤O.OOl.

В табл. 3 приведена зависимость между липидным составом (а) и жирнокислотным спектром (б), с одной стороны, и активностью свежей, замороженно-оттаянной и обработанной ИЭПВН спермы – с другой. Как видно из

Таблица 3. Коэффициенты корреляции между липидным составом (а) или нокнслотным спектром (<> и физиологическими показателями спермы

Показатель Липиды	А₀	А_з	А_е	С_і, пл
а) ЛФ	—0,31	—0,76	—0,75	0,51**
СМ	0,15	+0,38	+0,35	0,35*
ХП	—0,10	—0,26	0,05	0,42
ФХ	0,26	-0,18	-0,16	0,46**
ФС	0,25	-0,13	—0,21	0,21*
ЭАП	0,20	—0,22	—0,18	—0,05
ФЭА	—0,20	—0,26	—0,05	0,26
кл	0,18	-0,29	—0,21	0,18
хс	—0,05	0,80»***	0 84****	0,52**
нл	0,05	—0,08	—0,12	—0,20
б) 14:0	0,22	0,45**	0,26	0,10
16:0	—0,18	0,47**	0,48	0,40**
18:0	0,19	0,49**	0,55	0,42**
18:1	0,17	+0,30	—0,25	0,35*
18:2	—0,15	—0,28	0,39	—0,08
20:4	0,10	0,44**	-0,35	0,36*
22:6	—0,26	—0,42**	—0,61	0,12
Альд	0,10	0,41**	0,40	0,07
Ар	—0,28	—0,12	-0,10	0,18
К_ненас.	—0,05	0,65****	_0,71****	0,59***

Обозначения:

Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 198; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 123 4 5 6 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!