ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 22Следующая ⇒

Иммунологические методы исследования получили в последние годы широкое распространение в клинической практике. Иммунная система, как известно, обеспечивает распознавание и элиминацию генетически чужеродных структур, являясь, таким образом, важнейшим фактором, регулирующим постоянство внутренней среды организма. Нарушения функции иммунной системы могут приводить к ослаблению защиты организма от чужеродных агентов (вирусов, бактерий, клеток опухолей и т. д.) и развитию иммунодефицитных состояний. С другой стороны, дисбаланс между отдельными звеньями иммунной системы (например, между Т- и B-системами иммунитета) может явиться причиной развития аутоиммунных, аллергических заболеваний и так называемых болезней иммунных комплексов. Наконец, состояние иммунной системы имеет прямое отношение к реакции отторжения ауто- и аллотрансплантатов органов и тканей.

Факторы неспецифической гуморальной защиты обеспечивают так называемый острофазный ответ организма при действии внешних (вирусная или бактериальная инфекция, операции, ожоги и т. д.) или внутренних (инфаркт ткани, злокачественные новообразования, аутоиммунные процессы, образование иммунных комплексов) причин. Острофазный ответ организма способствует прямому уничтожению чужеродных агентов, а также активации процессов воспаления и специфической иммунной защиты и сопровождается существенными сдвигами всех метаболических процессов и функционального состояния эндокринной, нервной систем, системы терморегуляции и т. д.

К числу острофазных белков, ответственных за реализацию неспецифической гуморальной защиты, относят: 1) систему комплемента; 2) С-реактивный белок; 3) фибриноген; 4) a₁-антитрипсин; 5) a₁-кислый гликопротеид; 6) гаптоглобин; 7) a₁-химотрипсин; 8) сывороточный белок амилоидов А и Р; 9) интерфероны; 10) лизоцим. Важнейшими из них являются система комплемента и С-реактивный белок.

С-реактивный белок (СРБ) — это один из ведущих компонентов острофазной реакции. Основная биологическая функция этого белка состоит в связывании с фосфохолиновыми соединениями, широко представленными на мембранах бактерий, а также с некоторыми белками, освобождающимися в любой поврежденной ткани.

Методы исследования. Наиболее простым и распространенным способом определения С-реактивного белка (СРБ) является метод кольцепреципитации в капиллярах. Метод основан на выявлении хлопьевидного преципитата при взаимодействии исследуемой сыворотки крови (или другой биологической жидкости) со специфической иммунной антисывороткой, содержащей антитела к СРБ. Характер и интенсивность реакции оценивается через 24 ч от начала исследования по высоте столбика преципитата (в мм) в капилляре, в котором перемешаны исследуемая сыворотка и антисыворотка. Каждый 1 мм столбика преципитата оценивается как «+».

В норме С-реактивный белок в сыворотке крови отсутствует. Только при использовании метода радиоиммунного анализа в сыворотке здорового человека можно выявить до 8 мг/л СРБ. Его появление (или повышение) в крови неспецифично и наблюдается при любых острых инфекционных, воспалительных и дегенеративных процессах. Концентрация СРБ в сыворотке крови хорошо коррелирует с активностью воспалительного процесса и степенью деструкции тканей.

Комплементпредставляет собой систему из девяти плазменных белков (С₁–С₉), играющих существенную роль в развитии иммунных и воспалительных реакций. В норме эти вещества присутствуют в крови в неактивном состоянии — в виде так называемых энмогенов. Их последовательная активация происходит под действием иммунных комплексов антиген-антитело («классический путь» активации), а также некоторых продуктов жизнедеятельности бактерий, грибов, паразитов, вирусов, лимфобластов, агрегирующих белки и иммуноглобулины с участием пропердина («альтернативный путь»).

Реакция связывания комплемента. Общую активность системы комплемента определяют в так называемой гемолитической системе по реакции связывания комплемента. Гемолитическая система представляет собой смесь эритроцитов барана и стандартной специфической антисыворотки, содержащей антитела к этим эритроцитам, но искусственно лишенной собственного комплемента. В такой системе гемолиза эритроцитов не происходит в связи с отсутствием важного звена процесса связывания антител с антигеном — комплемента, разрушенного предварительным нагреванием. Если в такую систему добавить исследуемую сыворотку больного, содержащую комплемент, образуется иммунный комплекс, и происходит склеивание и гемолиз эритроцитов. Чем больше концентрация комплемента в исследуемой сыворотке, тем более выражен гемолиз эритроцитов.

В норме уровень комплемента сыворотки крови составляет 20–40 гемолитических единиц. При острых инфекционных и воспалительных заболеваниях наблюдается, как правило, увеличение активности комплемента, при хронических — ее снижение.

Низкие значения гемолитической активности могут отражать врожденную или приобретенную недостаточность отдельных компонентов системы комплемента. Следует отметить, что дефекты данной системы рассматриваются как самые частые наследственные аномалии белков человека.

Гуморальный специфический иммунитет.Гуморальный специфический иммунитет осуществляется благодаря образованию антител плазматическими клетками в ответ на антигенную стимуляцию В-лимфоцитов. Антитела представляют собой иммуноглобулины, относящиеся к гамма-фракции сывороточных белков. Из 5 изученных в настоящее время классов иммуноглобулинов наибольшее практическое значение имеют три класса: IgG, IgM и IgA. На их долю приходится, соответственно, 85%, 10% и 5% всех сывороточных иммуноглобулинов.

Методы исследования. Исследование специфического гуморального иммунитета включает: 1) определение содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов; 2) специфических антител; 3) циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и 4) некоторых антигенов.

Определение иммуноглобулинов. Определение иммуноглобулинов — один из наиболее распространенных методов исследования гуморального иммунитета. Для количественной оценки иммуноглобулинов сыворотки крови чаще всего используют 1) радиальную иммунодиффузию; 2) иммуноэлектрофорез и 3) иммунофлюоресценция.

Метод радиальной иммунодиффузии. Принцип наиболее простого и распространенного метода радиальной иммунодиффузии заключается в оценке диаметра колец преципитации, возникающих при взаимодействии в геле антигена (в данном случае иммуноглобулина исследуемой сыворотки) и антитела (антител к иммуноглобулинам человека, содержащимся в стандартных антисыворотках). Для количественного определения IgE, присутствующего в сыворотке крови в низких концентрациях, применяют более точные методы радиоиммунного или иммуноферментного анализа. Нормальное содержание иммуноглобулинов IgG, IgA и IgM представлено в табл. 4. Имеется зависимость концентрации иммуноглобулинов от пола, возраста и некоторых условий внешней среды. Метод иммуноэлектрофореза используется в основном для определения моноклональных иммуноглобулинов, например, парапротеинов при миеломной болезни или макроглобулинемии Вальденстрема. Метод представляет собой сочетание электрофоретического разделения белков сыворотки крови (или других биологических сред) и последующей радиальной иммунодиффузии с образованием преципитатов.

Ревматоидный фактор. Ревматоидный фактор (РФ) — это аутоантитела к Fс-фрагменту иммуноглобулина класса IgG. Сам ревматоидный фактор чаще представлен иммуноглобулином IgМ, хотя доказано существование РФ, относящихся к классу G или А. Наибольшее распространение получили два метода определения РФ: 1) реакция агглютинации эритроцитов барана (реакция Ваалера-Роуза) и 2) латекс-тест. Оба метода основаны на способности РФ агглютинировать эритроциты барана или преципитировать мелкие (0,8 мкм) синтетические латексные частицы, на которых предварительно адсорбирован IgG. С этой целью эритроциты барана или латексные частицы вначале обрабатывают гамма-глобулином, содержащим IgG, а затем добавляют исследуемую сыворотку. Реакция Ваалера-Роуза считается положительной при разведении исследуемой сыворотки 1:40, а латекс-тест — 1:20 и выше.

Для более точного определения РФ используют также метод непрямой иммунофлюоресценции и радиоиммунный анализ. Положительный ревматоидный фактор наиболее часто обнаруживают при ревматоидном артрите (от 60 до 80%), причем латекс-тест оказывается более чувствительным, чем реакция агглютинации эритроцитов барана. Величина титра разведения сыворотки обычно хорошо коррелирует с активностью патологического процесса. В то же время отсутствие ревматоидного фактора не исключает наличие ревматоидного артрита (так называемые серонегативные формы заболевания).

Циркулирующие иммунные комплексы. В последние годы большое диагностическое значение придают определению в сыворотке крови циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Они представляют собой растворимые комплексы “антиген-антитело”, которые в норме фагоцитируются макрофагами и разрушаются. Для определения ЦИК используют метод осаждения (преципитации) ЦИК раствором полиэтиленгликоля. После инкубации и центрифугирования выпавшие в осадок ЦИК растворяют раствором едкого натра и определяют их содержание в растворе на спектрофотометре, выражая количество иммунных комплексов в единицах оптической плотности. Определение ЦИК в сыворотке крови возможно также с помощью метода иммунофлюоресценции. Увеличение концентрации ЦИК может иметь два важных в практическом отношении следствия. Во-первых, ЦИК могут приводить к повреждению мембран и способствовать развитию иммунопатологического процесса в органах. Особенно часто это наблюдается при снижении функциональной активности тканевых макрофагов. Во-вторых, ЦИК обладают способностью активировать систему комплемента, хемотаксическим действием по отношению к лимфоцитам и нейтрофилам, активируют систему свертывания крови, кининовую систему, выделение гранулоцитами и макрофагами биологически активных веществ и т. д. Эти эффекты ЦИК сопровождаются развитием воспаления тканей. Повышение концентрации ЦИК обнаруживают при многих заболеваниях, в основе которых лежат нарушения клеточного иммунитета, в первую очередь, при различных аутоиммунных заболеваниях.

Определение антистрептолизина-О. Антистрептолизин-О представляет собой антитела к антигену стрептококка — стрептолизину-О. Последний, как известно, обладает свойством гемолизировать эритроциты. Сыворотка, содержащая антитела к стрептолизину-О, инактивирует это свойство благодаря образованию иммунных комплексов антиген-антитело. К исследуемой сыворотке различных разведений добавляют антиген — стрептолизин-О, а затем эритроциты. Если сыворотка содержит в достаточном количестве соответствующие антитела, которые связывают стрептолизин-О, гемолиза эритроцитов не происходит. Если же антител мало или они отсутствуют, стрептолизин-О проявляет свои гемолизирующие свойства.

Определение антигенов. Реакции гуморального иммунитета в последние годы все чаще используют для определения опухолевых, вирусных, бактериальных и прочих антигенов, что нередко имеет решающее значение в диагностике. Наиболее информативны методы иммунологического определения следующих антигенов:

1. антигенов вирусных гепатитов (HBsAg, HbeAg, HbcAg);

2. a-фетопротеина;

3. ракового эмбрионального антигена (РЭА);

4. других опухолевых антигенов;

5. антигенов вирусов, бактерий, грибов, микоплазмы и т. п.;

6. антигена IgE.

Кроме того, современные методы клинической иммунологии позволяют обнаруживать в биологических средах ничтожно малые количества некоторых органических и неорганических веществ (гормонов, ферментов, витаминов, биологически активных веществ, антител к определенным тканям и органам, лекарств и т. п.), которые не выявляются классическими биохимическими и иммунологическими методами. Наиболее чувствительными являются радиоиммунный и иммуноферментный методы исследования.

Радиоиммунный метод, являющийся наиболее информативным, основан на исследовании характера взаимодействия антитела с антигеном с образованием иммунного комплекса, в один из компонентов которого (антиген или антитело) введена радиоактивная метка. Наибольшее распространение получил метод конкуренции за специфические антитела меченного радиоактивным изотопом антигена и такого же антигена, но свободного от радиоактивной метки, количество которого необходимо определить в исследуемой биологической среде.

Иммуноферментный метод также основан на учете реакции антиген-антитело, причем в качестве метки, позволяющей обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например, пероксидазу.

Следует добавить, что в последние годы для количественного радиоиммунного и иммуноферментного определения различных антигенов и антител в биологических средах все чаще используют так называемые моноклональные антитела. Последние получают не путем иммунизации животных, а искусственно, путем синтеза так называемым моноклоном, т. е. культурой клеток, происходящих из одного сенсибилизированного лимфоцита. Моноклональные антитела отличаются от обычных антител, полученных с помощью классической иммунизации животных, очень высокой специфичностью и реагируют только на определенный антиген.

К числу наиболее чувствительных и высокоспецифичных иммунологических методов обнаружения антигенов относится метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет обнаруживать в исследуемом материале присутствие нескольких молекул искомого антигена или единичных возбудителей.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ

Основным показателем углеводного обмена является уровень глюкозы в крови. Поскольку глюкоза равномерно распределяется между плазмой и форменными элементами, ее количество можно определить как в цельной крови, так и в плазме, и в сыворотке крови.

Для определения глюкозы крови используют 3 группы методов:

1.Ферментативные, из которых наибольшее распространение получил глюкозооксидазный метод. Глюкозооксидаза (глюкозодегидрогеназа) катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха с образованием перекиси водорода, количество которой определяют по интенсивности реакции окисления ортотолидина в присутствии пероксидазы. Реакция протекает с образованием синего окрашенного соединения. Расчет концентрации глюкозы в крови проводят фотометрически, сравнивая интенсивность окраски с калибровочным графиком.

2.Редуктометрический метод, основанный на способности глюкозы восстанавливать соли меди или нитробензола.

3. Метод, основанный на цветной реакции с продуктами, образующимися при нагревании углеводов с толуидином.

В клинической практике глюкозу чаще всего определяют в крови, взятой из пальца, поскольку для проведения исследования требуется обычно не более 0,1 мл крови. В последние годы все чаще используют автоматические анализаторы, для которых материалом исследования служит кровь, взятая из вены.

Широкое распространение получили индивидуальные системы контроля уровня глюкозы крови для домашнего использования больными сахарным диабетом (глюкометры). Пробу крови для теста берут с помощью специального автоматического устройства, позволяющего сделать прокол кожи пальца стерильным ланцетом. Капля крови наносится на тест-полоску, предварительно введенную в держатель глюкометра. Через 45 с прибор подает серию звуковых сигналов и выводит на экран результат определения глюкозы крови.

Нормальные величины глюкозы крови, взятой натощак, составляют 3,5–5,7 ммоль/л, или 60–100 мг/дл (для лиц в возрасте до 50 лет) и 4,4–6,2 ммоль/л, или 80–110 мг/дл (для лиц старше 50 лет). Повышение концентрации глюкозы выше 6,2 ммоль/л называют гипергликемией, а уменьшение ниже 3,3 ммоль/л — гипогликемией.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ

Липиды представляют собой большой класс соединений, нерастворимых в воде и экстрагируемых из животных и растительных тканей при помощи органических растворителей. Важнейшей биологической функцией липидов является участие их в образовании мембран и других клеточных структур. Энергообеспечение организма на 40% осуществляется за счет расщепления липидов. Липиды являются источником биосинтеза многих гормонов, имеющих стероидную структуру, и других биологически активных веществ (простагландины). К числу липидов относится большая группа разнообразных жирорастворимых соединений, в том числе жирорастворимые витамины А, D, Е, К.

Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 451; Мы поможем в написании вашей работы!
Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 678 9 10 11 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!