Работа дыхательной цепи митохондрий в условиях нормоксии
Министерство образования и науки РФ
ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет
им. Н.И. Лобачевского»
Институт Биологии и Биомедицины
Кафедра нейротехнологий
Работа выполнена на базе отдела молекулярно-клеточных технологий ГБОУ ВПО НижГМА
ИЗМЕНЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИЙ ПРИ СТРЕССЕ
Курсовая работа
студента гр. 371314-7
очной формы обучения
Пчелина Павла Владимировича
Научный руководитель:
д.б.н., доц. ВедуноваМария Валерьевна
Нижний Новгород
2016 г
Оглавление
Введение. 3
1. Функциональная роль и структурная организация митохондрий. 5
2. Работа дыхательной цепи митохондрий в условиях нормоксии. 9
3. Структурные и функциональные изменения митохондрий в условиях гипоксии. 15
4. Антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) 22
Заключение. 25
Цитированная литература. 26
Введение
Не вызывает сомнений, что действие различных стрессорных факторов приводит к изменению метаболизма клеток и, как следствие, к гибели клетки, а в ряде случаев и целого организма. Одно из воздействий стресса на клетку касается жизненно важных органелл – митохондрий, ответственных за обеспечение организма энергией. Такие стрессовые факторы, как гипоксия, утрата факторов роста, повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и оксидативный стресс, способны оказывать на митохондрии действие, в результате которого они становятся активными продуцентами реактивных форм кислорода (РФК) и начинают высвобождать апоптогенные белки, что в результате приводит к нарушению окислительного фосфорилирования, а значит и нарушению синтеза аденозинтрифосфата (АТФ). Таким образом, поврежденные митохондрии представляют значительную опасность для клетки и могут привести к активации программы ее гибели (апоптоза)(Menna-Barreto, Castro, 2014).
|
|
|
Исследования в этой области являются актуальными и представляют большой интерес, поскольку нарушение окислительного фосфорилирования и повреждение митохондрий наблюдается прицелом ряде патологий, таких, как нейродегенеративные заболевания, инфаркт и инсульт. Изучение изменений митохондриальных процессов, происходящих вследствие такого фактора стресса, как гипоксия, позволит сделать новый шаг на пути поиска эффективных методов борьбы с этими заболеваниями. Особый интерес в отношении превентивного использованиядля предотвращения негативных последствий, вызванных гипоксией, представляет нейротрофический фактор головного мозга (BDNF). Исследование его гипоксической активности также является актуальным на сегодняшний день (Сахарнова, 2014).
|
|
|
Целью настоящей работы являетсяпроведение анализа современной литературы для изучения влияния гипоксии на биоэнергетические процессы, происходящие в митохондриях, в частности, на окислительное фосфорилирование.
Для выполнения данной цели были поставлены следующие задачи:
· рассмотрение структурной организации и метаболизма митохондрий в норме и в условиях стресса;
· изучение антигипоксической активности нейротрофического фактора головного мозга (BDNF).
§
Функциональная роль и структурная организация митохондрий
Митохондрии достаточно велики для того, чтобы их можно было увидеть в световой микроскоп. Впервые их обнаружили в XIX веке. Однако прогресс в понимании их функции зависел от методов выделения митохондрий, разработанных в 1948 году. По техническим причинам многие биохимические исследования проводили на митохондриях, выделенных из печени; каждая клетка печени содержит 1000 – 2000 митохондрий, которые в общей сложности занимают одну пятую клеточного объёма(Альбертс и др., 2013).
Митохондрия является органеллой, окруженной двумя высокоспециализированными мембранами и ответственной за обеспечение организма энергией. Она вовлечена в процессы роста, дифференцировки, поддержания кальциевого гомеостаза иокислительно-восстановительного баланса клетки. Особое строение митохондрии, а именно, наличие внешней и внутренней мембран, межмембранного пространства и матрикса обеспечивает оптимальную среду для многих других реакций распада и синтеза, таких, как β-окисление, биосинтез гема, синтез стероидных гормонов, глюконеогенез, а также для метаболизма аминокислот (Menna-Barreto, Castro, 2014).
|
|
|
Несмотря на то, что митохондрии обычно изображают как жесткие, вытянутые цилиндры, на деле эти органеллы весьма подвижны и пластичны, постоянно меняют свою форму. Форма митохондрии и ее расположение в клетке тесно связаны с явлениями разделения и слияния, дисбаланс между этими явлениями может привести к нарушению морфологии и жизнеспособности органеллы. Процессы разделения требуются как для биогенеза органелл, так и для ликвидации старых или поврежденных митохондрий с помощью аутофагии (митоптоза), что позволяет осуществлять распад и переработку содержимого этих органелл.Митохондриальное разделение обеспечивает динаминоподобныйбелок Drp1 (dynamin-1-like protein), концентрирующийся по поверхности митохондрий. Слияние – это двухступенчатый процесс соединения внешней и внутренней мембран, производимый посредством разобщенных событий в клетке. У млекопитающих слияние внешних мембран митохондрий контролируется особой ГТФ-азой (гуанозинтрифосфат) – митофьюзином (mitofusin, Mfn 1 and 2), в то время как слияние внутренних мембран находится под контролем динаминоподобного белка OPA1 (Opticatrophy 1), который в том числе отвечает и за поддержание структуры крист(Альбертс и др., 2013, Menna-Barreto, Castro, 2014, Westermann, 2012).
|
|
|
Также следует отметить, что процессы разделения и слияния позволяют митохондриям активно подстраиваться под нужды клетки. Слияние внутренних мембран и матриксов митохондрий позволяет максимизировать синтез АТФтам, где это необходимо. Процесс слияния митохондрий так же является ответом клетки на действие факторов стресса: он позволяет оптимизировать выработку и потребление клеткой энергии в периоды перенесения оной неблагоприятных условий.Согласно митохондриальной теории старения, неизбежные побочные продукты дыхания, активные формы кислорода(reactiveoxygenspecies, ROS), индуцируют образование мутаций и повреждений в митохондриальной ДНК. Накопление таких мутаций на протяжении жизни организма приводит в итоге к нарушению биоэнергетических способностей митохондрий, что ведет за собой развитие патологий и смерть. Однако, по данным Б.Вестерманна (2012), было показано, что в результате слияния митохондрий с мутантными ДНК и ДНК дикого типа происходит восстановление дыхательной активности посредством комплементации, что обеспечивает механизм защиты против старения (Westermann, 2012).
С другой стороны, процесс фрагментации присущ «отдыхающим» клеткам и может быть назван морфологическим состоянием компартмента митохондрий «по умолчанию», когда клетке не требуется активное дыхание. Помимо этого, расщепление митохондрий способствует протеканию митоптоза, что в свою очередь позволяет клетке избавляться от митохондрий с необратимыми повреждениями.Это является не менее важным для клетки, поскольку из-за воздействия активных форм кислорода на митохондриальную ДНК и нарушения синтеза АТФактивируются программы клеточной гибели. Одним из важных этапов инициации апоптозаявляется пермеабилизация (изменение проницаемости) внешней мембраны митохондрии, что приводит к выделению проапоптотических белков. Во время стресса происходит стимуляция как процесса апоптоза, так и процесса митоптоза, который в случае ранней активации обеспечивает выживание клетки посредством устранения поврежденных митохондрий. Однако с увеличением степени повреждений апоптоз начинает превалировать над митоптозом, что в конечном итоге приводит к смерти клетки (Menna-Barreto, Castro, 2014, Westermann, 2012).
Уникальные ориентацию и распределение митохондрийв разных типах клеток определяет их связь с цитоскелетом. В результате разделения образуются митохондриальные единицы, подходящие для перемещения вдоль цитоскелета по клетке.В некоторых клетках слияние митохондрий обеспечивает образование протяженных сетей, которые, как предполагается, функционируют как внутриклеточные передатчики энергии. Согласно этой гипотезе, таких цепи дыхательных комплексов генерируют мембранный потенциал в области клетки с высокой концентрацией кислорода. Этот потенциал передается по митохондриальнымфиламентам в отдаленные отделы клетки, где он может быть использован на синтез АТФ и генерацию энергии в зонах с низким содержанием кислорода. В других клетках митохондрии фиксированы в определенном положении и синтезируют АТФ в той части клетки, где они особенно активно расходуются, например, они могут быть плотно обернуты вокруг жгутика сперматозоида(Альбертси др., 2013, Westermann, 2012).
Вместе мембраны митохондрии создают два отдельных друг от друга компартмента: внутренний матрикс и значительное более узкое межмембранное пространство. Каждая из мембран и окруженные ими пространства содержат разные наборы белков.Белки-предшественники митохондрий синтезируются в цитозоле свободными рибосомами и импортируются внутрь органеллы посредством транслоказвнешней (TOM – TranslocaseoftheOuterMembrane) и внутренней (TIM – TranslocaseoftheInnerMembrane) мембран. Особые шапероны и сигнальные пептиды направляют белки-предшественники в соответствующие компартменты. TOM ответственна за первичное узнавание белков-предшественников, TIM, в свою очередь, принимает участие в переносе легко расщепляемых препептидов в матрикс (Альбертс и др., 2013,Menna-Barreto, Castro, 2014).
Внешняя мембрана содержит множество молекул поринов, транспортных белков, образующих в липидном бислое широкие водные каналы. Таким образом, эта мембрана похожа на сито и проницаема для всех молекул массой до 5000 дальтон, включая небольшие белки. Такие молекулы могут проникать в межмембранное пространство, но большинство их них не способно пройти через непроницаемую внутреннюю мембрану.
Внутренняя мембрана высоко специализирована. Ее липидному бислою свойственно высокое содержание «двойных» фосфолипидов кардиолипинов, которые содержат четыре жирные кислоты, а не две, и усиливают непроницаемость мембраны по отношению к ионам. Эта мембрана несет также различные транспортные белки, которые делают её селективно проницаемой для тех малых молекул, которые метаболизируются располагающимися в матриксемитохондриальными ферментами. В число ферментов матрикса входят ферменты метаболизма пирувата и жирных кислот с образованием ацетил-КоА (ацетил-коэнзим А) и ферменты окисления ацетил-КоА в цикле лимонной кислоты. Ферменты дыхательной цепи встроены во внутреннюю митохондриальную мембрану и играют ключевую роль в процессе окислительного фосфорилирования. Внутренняя мембрана обычно сильно изогнута и образует множество выступающих в матрикс складок, известных как кристы. Кристы значительно увеличивают площадь внутренней мембраны (Альбертс и др., 2013).
Работа дыхательной цепи митохондрий в условиях нормоксии
В качестве топлива митохондрии способны использовать пируват, получаемый из глюкозы и других сахаров, и жирные кислоты, получаемые из жиров (рис. 1.). Необходимые молекулы транспортируются через внутреннюю митохондриальную мембрану и превращаются ферментами митохондриального матрикса в ключевой интермедиат метаболизма – ацетил-КоА. Ацетильные группы ацетил-КоАокисляются в матриксе в цикле лимонной кислоты, где углеродные атомы ацетил-КоА превращаются в CO2, который клетка выделяет в качестве побочного продукта. Самой важной функцией окисления является получение высокоэнергетических электронов в составе активированных молекул-переносчиков NADH и FADH2.Эти высокоэнергетические электроны переносятся далее во внутреннюю митохондриальную мембрану, где они входят в электрон-транспортную цепь. Потеря электроновNADH и FADH2также регенерирует NAD+и FAD, которые необходимы для непрерывного окислительного метаболизма.
Рис. 1. Общая схема энергетического метаболизма митохондрий (Альбертс и др., 2013)
Несмотря на то, что цикл лимонной кислоты считается частью аэробного метаболизма, в нем не используется кислород. Молекулярный кислород (О2) напрямую поглощается только в финальных катаболических реакциях, протекающих во внутренней митохондриальной мембране. Почти вся энергия, доступная из сжигания углеводов, жиров и других пищевых молекул на ранних стадиях их окисления, сначала запасается в форме высокоэнергетических электронов, отрываемых от субстратов NAD+и FAD . Эти электроны, переносимые NADH и FADH2, затем присоединяются к О2посредством дыхательной цепи во внутренней мембране митохондрии, которая использует большое количество высвобожденной энергии для синтеза АТФ из АДФ+Pi. Отсюда термин окислительноефосфорилирование используется только для описания заключительных реакций(Альбертс и др., 2013).
Рис. 2. Начальный этап транспорта электронов (Альбертс и др., 2013)
Дыхательная цепь переноса электронов (ЭТЦ, электрон-транспортная цепь) состоит из пяти белковых комплексов, локализованных во внутренней митохондриальной мембране.Процесс электронного транспорта начинается с удаления гидрид-иона с NADH(с образованием NAD+) (рис. 2) и превращения его в протон и два электрона (H-=H+ + 2e-).Два электрона передаются на первый из более чем пятнадцати различных переносчиков дыхательной цепи. Сначала энергия электронов очень велика, но она постепенно теряется по мере транспорта по цепи. В основном, электроны переходят с одного иона металла на другой, каждый из которых крепко связан с белковой молекулой, изменяющей сродство электрона к металлу. Большинство участвующих в процессе белков объединено в три крупных ферментных комплекса дыхательной цепи, каждый из которых содержит трансмембранные белки, крепко удерживающие комплекс во внутренней мембране митохондрии. Каждый следующий комплекс имеет большее сродство к электрону, чем предыдущий, и электроны последовательно передаются от одного комплекса на другой до тех пор, пока не окажутся на кислороде, сродство которого к электронам наиболее велико.I, IIIи IVкомплексы также перекачивают протоны через внутреннюю мембрану, устанавливая электрохимический протонный градиент, в форме которого запасается энергия, впоследствии используемая комплексом V (АТФ-синтазой) для синтеза АТФ(Альбертс и др., 2013, Markhametal., 2014).
В отношении дыхательной цепи, комплекс I (NADH-дегидрогеназа/ убихинон или коэнзимQ10)главным образом контролирует синтез АТФ, катализируя окисление NADH с переносом двух электронов через флавинмононуклеотид и цепь железосерных кластеров на убихинон (с восстановлением оного до убихинола). Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа) также является точкой поступления электронов в ЭТЦ, осуществляя окисление сукцината до фумарата с восстановлением FADдо FADH2 и убихинона до убихинола, однако этот комплекс не создает протонный градиент. Комплекс III (цитохром c-оксидоредуктаза) производит перенос электронов с убиквинола на цитохромc.Наконец комплекс VI (цитохромоксидаза) осуществляет перенос электронов с цитохромасна конечный акцептор – молекулярный кислород (Crofts, 2004, Horsefieldetal., 2004, Yoshikawaetal., 2006, Markhametal., 2014).
Перенос электронов сопряжен с ориентированным захватом и высвобождением протонов и аллостерическими изменениями энергопреобразующих белковых насосов. В конечном результате протоны перекачиваются через внутреннюю мембрану – из матрикса в межмебранное пространство – за счет энергетически выгодного потока электронов. Движение протонов приводит к двум важным последствиям. Во-первых, оно создает градиент pHчерез внутреннюю мембрану митохондрии (pHв матриксе больше, чем в цитозоле, где он обычно около 7 и равен значению pH в межмебранном пространстве из-за высокой проницаемости внешней мембраны). Во-вторых, оно создает градиент электрического напряжения (мембранный потенциал) через внутреннюю мембрану митохондрии (которая внутри отрицательна, а снаружи положительна в результате суммарного выходного потока положительных ионов). Градиент pH «тянет» протоны обратно в матрикс, что усиливает влияние мембранного потенциала, способствующего вхождению положительных ионов в матрикс и выходу из него отрицательных. Вместе градиент pH и мембранный потенциал составляют электрохимический протонный градиент, который в свою очередь создает протондвижущую силу. Электроны в конце пути акцептируются молекулярным кислородом, который вследствие этого переводится в H2O2. Энергетически выгодная реакция H2 + 1/2O2 = H2Oпротекает в несколько маленьких стадий, поэтому большая часть высвобождаемой энергии может быть запасена и не выделяется в окружающую среду в форме тепла (Альбертс и др., 2013).
Рис. 3. Строение АТФ-синтазы (Альбертс и др., 2013)
АТФ-синтаза,представленная на рисунке 3, также называемая F0F1-АТФазой, является мультисубъединичным белком, работающим путем роторного канала. Большая часть фермента, состоящая из шести субъединиц, выступает вматрикс митохондрии. Работа фермента основана на преобразовании энергии движения протонов по градиенту в механическую энергию трения белков, которая в дальнейшем преобразуется в энергию химической связи. Так АТФ-синтазаспособна синтезировать более 100 молекул АТФ в секунду. КомплексVсоздает гидрофильный проход через внутреннюю мембрану митохондрий, позволяющий протонам двигаться по электрохимическому градиенту. По мере прохождения протонов через АТФ-синтазу, они используются в качестве движущей силы для протекания энергетически невыгодной реакции синтеза АТФ из АДФ и Pi (Альбертс и др., 2013).
Таким образом, несмотря на то, что в дыхательной цепи энергия собирается посредством отличного от других катаболических реакций механизма, принцип остается тем же. Атомы водорода разделяются на протоны и электроны. Электроны транспортируются по нескольким переносчикам во внутренней мембране митохондрий. Через несколько стадий протоны и электроны временно вновь соединяются. Электрохимический градиент протонов служит движущей силой не только для синтеза АТФ, но и для сопряженного транспорта через мембрану. В конце электрон-транспортной цепи протоны используются для нейтрализации отрицательных зарядов, появляющихся в результате добавления электронов к молекуле кислорода. И так, помимо своей основной функции, ЭТЦ играет ключевую роль в поддержании мембранного потенциала, контролирует внутриклеточный гомеостаз Ca2+, инициацию апоптоза и регуляцию выработки ROS, включая супероксидный анион (O2-), пероксид водорода (H2O2), гидроксильный радикал и синглетный кислород (Альбертс и др., 2013, Chengetal., 2010, Markhametal., 2014).
Рис. 4. Работа митохондриальной дыхательной цепи, условиянормоксии(Лукьянова, 2013)
ЦТК – цикл трикарбоновых кислот
МФК I, II, III, VI – митохондриальные ферментные комплексы I, II, III и VI соответственно
HADH – НАД-зависимые субстраты
Как показано на рисунке 4, в условиях нормоксииработа дыхательной цепи чаще всего зависит от окисления НАД-зависимых субстратов, которые являются основным поставщиком восстановительных эквивалентов для дыхательной цепи через МФК I (митохондриальный ферментный комплекс I). Вклад этого пути в интактных клетках, оцениваемый по потреблению кислорода, может составлять до 55–65 %. Тем не менее 25–30 % митохондриального дыхания в этих условиях связано с МФК II (митохондриальный ферментный комплекс II) и окислением сукцината, содержание которого в матриксе митохондрий невелико (0,2–0,4 ммоль/л) (Лукьянова, 2013, Kushniretal., 2001).
Дата добавления: 2018-05-12; просмотров: 510; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!