Фракционирование белков различной природы по растворимости
Цель работы: провести экстракцию и последующий анализ белков растительного и животного происхождения по растворимости.
Продолжительность выполнения:4 ч.
Приборы и материалы:реактивы: мука пшеничная, гороховая; молочный продукт; гомогенизированная мышечная ткань; 10% и насыщенный растворы сульфата аммония, сухой сульфат аммония (мелко размолотый); 0,2; 1; 10% растворы гидроксида натрия; 0,1 н, 3% растворы уксусной кислоты; биуретовый реактив; 10 % и насыщенный растворы хлорида натрия; сухой хлорид натрия (мелко размолотый); 70% раствор этилового спирта; посуда и приборы: капельницы; стеклянные воронки; фарфоровые ступки и пестики; фильтровальная бумага; марля; технические весы с разновесами; термостат; плоскодонные колбы объемом
100 мл; пробирки; пипетки; водяные бани.
Белковыми веществами называются высокомолекулярные органические соединения, молекулы которых состоят из остатков 20 различных α-аминокислот. Белки играют огромную роль в деятельности живых организмов, в том числе и человека. Наиболее важными функциями белков являются:
– структурная функция (соединительные ткани, мышцы, волосы и т.д.);
- каталитическая функция (белки входят в состав ферментов);
- транспортная функция(перенос кислорода гемоглобином крови);
- защитная функция (антитела, фибриноген крови);
- сократительная функция (миозин мышечной ткани);
- гормональная (гормоны человека);
|
|
|
- резервная (ферритин селезенки).
Резервная или питательная функция белков заключается в том, что белки используются организмом человека для синтеза белков и биологически активных соединений на основе белка, которые регулируют процессы обмена в организме человека.
Белки состоят из остатков α-аминокислот, соединенных пептидной связью (-СО – NН-), которая образуется за счет карбоксильной группы первой аминокислоты и α-аминогруппы второй аминокислоты.
Существует несколько видов классификации белков.
Классификация по степени растворимости белка.
Водорастворимые белки имеют небольшую молекулярную массу, их представляют альбумины яйца.
Солерастворимые белки растворяются в 10% растворе хлорида натрия, их представляют глобулины: белок молока казеин, белок крови и глобулин.
Щелочерастворимые белки растворяются в 0,2% растворе гидроксида натрия, их представляют глютелины: белок клейковины пшеницы.
Спирторастворимые белки растворяются в 60-80% спирте, их представляют проламины: белки злаковых культур.
Классификация по строению пептидной цепочки: различают спиралевидную форму в виде α-спирали и складчатую структуру в виде β-спирали.
Классификация по ориентации белковой молекулы в пространстве:
|
|
|
1) первичная структура представляет собой соединение аминокислот в простейшую линейную цепь за счет только пептидных связей;
2) вторичная структура представляет собой пространственное расположение полипептидой цепи в виде ά-спирали или
β-складчатой структуры. Структура удерживается за счет возникновения водородных связей между соседними пептидными связями;
3) третичная структура представляет собой специфическое укладывание ά-спирали в виде глобул. Структура удерживается за счет возникновения связей между боковыми радикалами аминокислот;
4) четвертичная структура представляет собой соединение нескольких глобул, находящихся в состоянии третичной структуры, в одну укрупненную структуру, обладающую новыми свойствами, не характерными для отдельных глобул. Глобулы удерживаются за счет возникновения водородных связей.
Поддержание характерной пространственной третичной структуры белковой молекулы осуществляется за счет взаимодействия боковых радикалов аминокислот между собой с образованием связей: водородных, дисульфидных, электростатических, гидрофобных.
Гидролиз белков осуществляют протеолитические ферменты. Большое разнообразие протеолитических ферментов связано со специфичностью их воздействия на белок. Место приложения или действия протеолитического фермента связано со структурой радикалов, находящихся рядом с пептидной связью. Пепсин расщепляет связь между фенилаланином и тирозином, глутаминовой кислотой и цистином (метионином, глицином), между валином и лейцином. Трипсинрасщепляет связь между аргинином (лизином) и другими аминокислотами. Химотрипсин – между ароматическими аминокислотами (триптофан, тирозин, фенилаланин) и метионином. Аминопептидазы действуют со стороны N-концевой аминокислоты, карбоксипептидазы со стороны С-концевой аминокислоты. Эндопептидазы разрушают белок внутри молекулы, экзопептидазы – действуют с конца молекулы. Для полного гидролиза белковой молекулы необходим набор большого количества различных протеолитических ферментов. Биологическая ценность белков определяется сбалансированностью аминокислотного состава по содержанию незаменимых аминокислот. В эту группу входят аминокислоты, которые не синтезируются в организме человека. К незаменимым аминокислотам относят: валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, лизин, треонин, метионин, триптофан. Аминокислоты аргинин и гистидин относятся к частично заменимым, так как они медленно синтезируются организмом человека. Отсутствие в пище одной или нескольких незаменимых аминокислот приводит к нарушению деятельности центральной нервной системы, остановке роста и развития организма, к неполному усвоению других аминокислот.
|
|
|
|
|
|
Превращение белков в технологических процессах.
Денатурация – сложный процесс, при котором под влиянием внешних факторов происходит изменение нативной пространственной структуры белковой макромолекулы. Такими внешними факторами являются температура, механическое воздействие, химические реагенты. Первичная структура и химический состав белка при этом не изменяются. При денатурации изменяются физические свойства белка: снижается растворимость, способность к гидратации, теряется его биологическая активность. Меняется форма белковой молекулы, происходит агрегирование. В тоже время увеличивается активность некоторых химических групп, облегчается воздействие на белок протеолитических ферментов.
В пищевой технологии особое практическое значение имеет тепловая денатурация белка. Степень тепловой денатурации зависит от температуры, продолжительности нагрева, влажности. Сушка зерна, бланширование растительного сырья, выпечка хлеба, варка мяса, рыбы, кипячение молока сопровождается тепловой денатурацией белка.
Данный вид превращений относится к полезным, так как он ускоряет переваривание белков в желудочно-кишечном тракте человека и обуславливает потребительские свойства пищевых продуктов (текстуру, внешний вид, органолептические свойства).
В связи с тем, что степень денатурации белка может быть различной, то и усвояемость полимеров может не только улучшаться, но и ухудшаться.
Термическая обработка белоксодержащей пищи при
100-1200C и более приводит не к денатурации, а к разрушению (деструкции) макромолекул белка с отщеплением функциональных групп, расщеплением пептидных связей и образованием сероводорода, аммиака, углекислого газа и ряда более сложных соединений небелковой природы. Среди продуктов термического распада белка встречаются соединения, придающие им мутагенные свойства. Термически индуцированные мутагены образуются в белоксодержащей пище в процессе ее обжаривания в масле, выпечки, копчения в дыму и сушки. Мутагены содержатся в бульонах, жареной говядине, свинине, птице, яйцах, копченой и вяленой рыбе. Некоторые из них вызывают наследственные изменения в ДНК, и их воздействие на здоровье человека может быть от незначительного до летального.
Некоторые особенности имеет денатурация белков в растворах.
Если мы имеем дело с белковыми растворами (производство напитков, молока), то денатурация начинается с дегидратации белковой молекулы и перехода ее в состояние суспензоида, т. е. происходит превращение гидрофильного золя в гидрофобный. Денатурированные белки удерживаются в суспендированном состоянии благодаря собственным электрическим зарядам, которые не позволяют сближаться отдельным молекулам белка. Денатурация растворов внешне характеризуется появлением мути. Когда силы молекулярного притяжения преодолевают силы электростатического отталкивания мицелл, дегидратированные мицеллы
слипаются и образуют крупные хлопья, наступает вторая стадия – собственно коагуляция. Денатурация в растворах имеет обратимый характер, может происходить при любом значении pH. Коагуляция – необратимый процесс, легче всего протекает вблизи изоэлектрической точки.
Денатурацию белков в растворах вызывает нагревание, действие кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, органических растворителей и т. д. Коагуляция белка является важным процессом, способствующим повышению стойкости напитков. Наиболее интенсивно она идет на стадии кипячения сусла, тепловой обработки вина, на стадии разваривания в производстве спирта.
При производстве кисломолочной продукции наблюдается кислотная коагуляция казеиновых фракций белков молока. Эти же белки свертываются под действием сычужного фермента, используемого при производстве творога и сыров.
Гидролиз белков под действием ферментов. Важное значение в технологии имеет расщепление белков под действием соответствующих ферментов на пептиды и, в конечном счёте, на аминокислоты.
При замесе теста в нем ограниченно идет протеолиз белка под действием протеаз муки. С одной стороны, этот процесс оказывает большое влияние на разжижение теста, расслабление его структуры и, в конечном итоге, на форму и расплываемость готового хлебного изделия. С другой стороны, протеолиз дает в тесте некоторое количество аминокислот, которые играют важную роль в образовании цвета корочки хлеба.
Процесс гидролиза белка происходит при созревании мяса, сыра, положительно влияя на его вкус, запах, усваиваемость организмом.
Гниение белка. Под действием гнилостных бактерий распад белка идет значительно глубже, аминокислоты разрушаются до аммиака, азота и белковых ядов – индола, скатола, меркаптана. Этот процесс называется гниением белков.
Гнилостные бактерии бывают аэробные и анаэробные. Последние встречаются в мясных и рыбных консервах с нарушенным режимом стерилизации. Примером может служить палочка бутулинус, выделяющая сильнейший токсин (микробный яд).
При наличии в молоке гнилостных бактерий и микрококков происходит распад белков молока и появляется неприятный горький привкус.
Превращения аминокислот характеризуются рядом реакций.
Реакция меланоидинообразования. При температуре от 40-600C до 1000C со значительной скоростью протекает взаимодействие белков или продуктов их гидролиза (полипептидов, аминокислот) с восстанавливающими сахарами, сопровождающееся образованием карбонильных соединений и темноокрашенных продуктов – меланоидинов.Эта реакция является причиной не только потемнения пищевых продуктов, появления приятного, свойственного им запаха и вкуса, но и уменьшения в них сухого вещества и потерь незаменимых аминокислот (лизина, треонина). Реакция меланоидинообразования является причиной получения окрашенной корки хлеба при выпечке, цвета топленого молока, цвета темного солода при сушке и т. д.
Образование меланинов. При окислении аминокислоты тирозина кислородом воздуха под действием фермента полифенолоксидазы образуются темноокрашенные соединения меланины. Темный цвет ржаного хлеба, потемнение макарон в процессе сушки, потемнение разрезанных овощей и фруктов (картофель, яблоко) связаны именно с этим процессом. Механизм реакции до конца не изучен, известны лишь первые этапы синтеза меланинов. Свободные аминокислоты, образовавшиеся при гидролизе белка, могут подвергаться самостоятельному распаду.
Дезаминирование и декарбоксилирование аминокислот.
В зависимости от условий прохождения эти реакции могут привести к образованию из аминокислот большого количества безазотистых соединений. Эти процессы идут при производстве напитков, сыров и способствуют образованию специфического аромата и вкуса. Так, в результате восстановительного дезаминирования аминокислот образуются жирные кислоты.
Биологическая ценность белков рассчитывается по аминокислотному скору (а.с.). Аминокислотный скор выражается в процентах, представляющих отношение содержания незаменимой аминокислоты в исследуемом белке продукта к ее количеству в эталонном белке. Аминокислотный состав эталонного белка сбалансирован и идеально соответствует потребностям человека в каждой незаменимой аминокислоте. Аминокислота, скор которой имеет самое низкое значение, называется первой лимитирующей аминокислотой. Например, в белке пшеницы, лимитирующей является аминокислота лизин, в кукурузе – метионин, в картофеле и бобовых культурах лимитирующими являются метионин и цистин – это серосодержащие аминокислоты. Животные и растительные белки отличаются по биологической ценности. Аминокислотный состав животных белков близок к аминокислотному составу белков человека, поэтому животные белки являются полноценными. Белки растительные содержат пониженное содержание лизина, триптофана, треонина, метионина, цистина. Биологическая ценность белков определяется степенью их усвоения в организме человека. Животные белки имеют белее высокую степень усвояемости, чем растительные. Из животных белков в кишечнике всасывается 90% аминокислот, а из раститель-ных – 60-80%. В порядке убывания скорости усвоения белков продукты располагаются в следующей последовательности:
рыба > молочные продукты > мясо > хлеб > крупы.
Одной из причин низкой усвояемости растительных белков является их взаимодействие с полисахаридами, которые затрудняют доступ пищеварительных ферментов к полипептидам.
При недостатке в пище углеводов и липидов требования к белку несколько изменяются. Наряду с биологической ролью белок начинает выполнять энергетическую функцию. При усвоении 1 г белка выделяется 4 ккал энергии. При избыточном потреблении белка возникает опасность синтеза липидов и ожирения организма. Суточная потребность взрослого человека в белках составляет 5 г на 1 кг массы тела или 70-100 г в сутки. На долю белков животного происхождения должно приходиться 55% и растительного происхождения 45% от суточного рациона человека.
Задание 1.Выделить водорастворимые белки пшеницы.
Пшеничную муку в количестве 2 г разтереть в фарфоровой ступке с 10 мл дистиллированной воды. Полученной смеси дать отстояться 2-3 мин, затем отфильтровать. Остаток муки промыть два раза небольшими порциями дистиллированной воды и оставить для последующего извлечения глобулинов пшеницы. Полученный фильтрат использовать при исследовании растворимости альбуминовых белков. К фильтрату альбуминовой фракции белков добавить сухой тонко измельченный порошок сульфата аммония при небольшом нагревании (не выше 40°С) до полного насыщения (до прекращения растворения сульфата аммония). Выпавший осадок, представляющий собой альбуминовую фракцию белков пшеницы, отфильтровать. Осадок на фильтре растворить в 1 мл дистиллированной воды. В полученном растворе доказать наличие белков, добавив в него 1 мл биуретового реактива.
Задание 2.Выделить солерастворимые белки пшеницы.
Промытый водой остаток муки (после извлечения альбуминовой фракции белков) разтереть в ступке с 10 мл 10% раствора хлорида натрия, дать отстояться 2-3 мин и отфильтровать. Остаток муки промыть два раза небольшими порциями свежего раствора хлорида натрия и оставить для следующих опытов. Полученный фильтрат использовать при исследовании растворимости глобулиновых белков пшеницы. Для этого добавить к фильтрату равный объем насыщенного раствора хлорида натрия, достигнув тем самым полунасыщения. Выпавший осадок, представляющий собой глобулиновую фракцию белков пшеницы, отфильтровать. Осадок растворить на фильтре в 1 мл 10% раствора хлорида натрия.
Провести реакцию с биуретовым реактивом.
Задание 3.Выделить белки пшеницы, растворимые в щелочах.
Остаток муки после удаления альбуминовой и глобулиновой фракции белков разтереть в фарфоровой ступке с 10 мл 0,2% раствором гидроксида натрия, дать отстояться 2-3 мин и отфильтровать. К фильтрату добавить по каплям 0,1 н раствор уксусной кислоты. Выпавший осадок представляет собой глютенин – глютелин пшеницы. Полученный глютенин растереть в ступке 1 г пшеничной муки и 5 мл 70% этилового спирта. Полученной суспензии дать отстояться и отфильтровать. К 3 мл фильтрата добавить по каплям дистиллированную воду до выпадения осадка. Полученный осадок представляет собой глиадин – проламин пшеницы.
Задание 4.Выделить водорастворимые белки мышечной ткани.
В плоскодонную колбу объемом 100 мл поместить 2 г гомогенизированной мышечной ткани, залить 12 мл дистиллированной воды и экстрагировать в термостате при температуре 300°С в течение 15 мин (при постоянном перемешивании).
При этом в раствор переходят альбуминовые фракции белков мышечной ткани (миоген, миоальбумин, миоглобин, глобулин).
Водорастворимой фракции белков мышечной ткани дать отстояться 2-3 мин, осадок отфильтровать через два слоя марли, положенной на воронку. Фильтрат использовать для исследования растворимости альбуминов.
Промытый водой осадок мышечной ткани оставить для выделения глобулинов. Фильтрат, содержащий альбуминовые белки, разделить на две порции. К первой порции фильтрата (около 1 мл) добавить 1 мл биуретового реактива. Ко второй порции (приблизительно 3 мл) добавить мелко измельченный порошок сульфата аммония при нагревании до насыщения. Выпавшие при этом альбуминовые белки отфильтровать. Полученный осадок использовать для исследования растворимости альбуминов.
Задание 5.Выделить солерастворимые белки мышечной ткани.
Оставшуюся на марле кашицу из мышечной ткани (после извлечения водораствормых белков) отжать, перенести в фарфоровую ступку и разтереть с 10 мл 10% раствора сульфата аммония для извлечения глобулиновой фракции белков. Полученному экстракту дать отстояться и отфильтровать. Оставшийся осадок, содержащий белки стромы, используют для выделения белков мышечной ткани, растворимых в щелочах.
Полученный фильтрат, содержащий глобулиновую фракцию белков мяса, разделить на две части. К одной части (около 2 мл) добавить равный объем насыщенного раствора сульфата аммония для достижения полунасыщения. Выпавшие глобулины отфильтровать через фильтровальную бумагу и проверить их растворимость. К фильтрату добавить биуретовый реактив, доказав тем самым, что в растворе не осталось белков.
Для осаждения миозина ко второй части фильтрата (около
5 мл), содержащего глобулины мышечной ткани, добавить сухой порошок хлорида натрия при небольшом нагревании до полного насыщения. Образовавшийся осадок, который представляет собой фибриллярный белок – миозин, спустя 5 мин отделить на центрифуге.
Надосадочную жидкость декантировать, оставшийся на дне миозин растворить в дистиллированной воде и провести качественную реакцию на наличие белков с биуретовым реактивом.
Задание 6.Выделить белки мышечной ткани, растворимые в щелочах.
Оставшийся после экстракции водо- и солерастворимых белков осадок перенести в плоскодонную колбу, залить 5 мл раствора 10% гидроксида натрия и поместить на 20 мин на кипящую водяную баню. Полученный раствор охладить и отфильтровать. К 3 мл фильтрата добавить по каплям раствор 0,1 н уксусной кислоты для нейтрализации щелочи.
Выпавший осадок, который представляет собой белки стромы, спустя 5 мин отфильтровать. К фильтрату добавьте 1 мл биуретового реактива, объяснить полученный результате.
Экспериментальные данные занести в таблицу 9.
Таблица 9
Результаты качественного анализа фракционного состава
исследуемого белка
| Исходный материал | Растворитель | Название растворимого белка | Из какого растворителя высаливается | Реакция на белок |
Контрольные вопросы
1. Как можно классифицировать белки?
2. Каково химическое строение белков?
3. Как образуется первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура белков?
4. Какова роль белка для организма человека?
5. Назовите функции отдельных аминокислот в организме человека.
6. Расскажите об основных технологических свойствах белков (гидратация, денатурация, пенообразование).
7. Какое значение имеют процессы гидролиза белков и меланоидинообразования в пищевой технологии?
8. Что такое ферменты, приведите их классификацию?
Лабораторная работа №11
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 1053; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!