Техника генно-инженерного эксперимента (стадии)
1. Получение ДНК чужеродного фрагмента, который необходимо включить (вклеить) в клетку хозяина. Например, получение ДНК человеческого инсулина.
Рис.2.
2. Получение плазмиды из клетки донора
Есть клетка-реципиет (напр. Е. coli) из которой мы получаем плазмиды - это элементарная концевая молекула ДНК в 100-1000 раз меньше хромосомы,существует в бактериальных клетках или клетках прокариот, плазмиды несутограниченное количество генов (не более 30).
Рис.3.
3. Конструирование рекомбинантной плазмиды (вектора)
Вектор – рекомбинат (подготовленная для генно-инженерных манипуляцийплазмида или в виде фага или в виде изолированной ДНК или вируса) иличасть рекомбинантной ДНК, которая обеспечивает проникновение идальнейшую репликацию этой ДНК в клетке хозяина. Вектор получают с помощью рестриктазы (разрывает фосфодиэфирные связи встрого определенном месте последовательности оснований нуклнеотиднойцепи).
Вероятность передачимолекулы плазмидной ДНК при коньюгации 1 на 1000 или 1 на 10000. Еслиесть вектор на основе фага или вируса, то он будет более агрессивен ивероятность повышается в 100 – 1000 раз. От вирусной или фаговойинформации трудно освободиться.В генной инженерии включение нового гена происходит с помощьюфермента рестриктазы.
Рис.4.
Рестриктаз в клетке может быть очень много. Рестриктазы разрушаютфосфодиэфирные связи между нуклеотидами в строго определенном месте,т.е. они обладают строгой специфичностью, действуя на определеннуюпоследовательность нуклеотидов в цепи. После разрыва связей образуются«липкие концы» и в разрывы включаютсч гены с помощью ферментов ДНК-лигаз, которые соединяют нуклеотиды между собой.Есог 1- рестриктаза действует в строго определенной последовательностина одну нить ДНК. Другая рестриктаза расщепляет вторую нить ДНК надругом участке. Рестриктазы расщепляют ковалентные фосфодиэфирныесвязи между нуклеотидами. После расщепления связей образуются «липкиеконцы» и в место разрыва можно включить ген, который «сшивается с ДНК спомощью ДНК-лигаз.
|
|
|
Генному инженеру необходимо для получения рекомбинанта использоватьEcor I, т.к. деятельность BSUR I менее выгодно (шестичастотнаяпоследовательность встречается через каждые 44096 раз; четырех частотнаяпоследовательность встречается через каждые 250 раз; при более частойпоследовательности можно изрезать нужный ген ).
Введение фрагмента ДНК (гена человеческого инсулина в плазмиду клеткиреципиента (E.coli): 2 липких конца одного биообъкета и 2 липких концадругого комплементарно воссоединились. Ген инсулина является чужеродным,поэтому может иметь место такое явление как отжиг.
|
|
|
Рис.5.
Отжиг – это процесс смещения двух фрагментов ДНК, когдавосстанавливаются только водородные связи и фосфодиэфирные связи необразуются.
Для восстановления фосфодиэфирных связей используют ДНК-лигазы – этоферменты, которые восстанавливают ковалентные фосфодиэфирные связи итаким образом концы однотяжевой линейной молекулы ДНК соединяются скольцевой молекулой ДНК- плазмидой. Плазмида – это вектор. Так лигандысшивают, склеивают молекулы ДНК. На этом этапе плазмида называетсявектором или транскриптом.
4. Включение вектора в клетку-реципиент (Е.coli)
Условием включения вектора в клетку реципиента является то, что цитоплазматическая мембрана ее должна близко подходить к клеточной стенке,когда вектор входит внутрь клетки через окошечки.
5. Отбор гибридных клонов
Рис. 6. Получение гибридных клонов
Посев идет на питательную среду, содержащую, как пример,бензилпенициллин, при этом вырастают клоны клетки Е.coli с маркером вгибридной плазмиде.
У эукариот при образовании молекулы м РНК имеет место процесссплайсинга (от английского splicing- созревание, сращивание). Ген у эукариотпредставляется не непрерывный, а мозаичной структуры, содержащей наряду скодирующими, несущими информацию (так называемые экзоны), такженекодирующие, не несущие информацию (интроны) последовательности.Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза катализирует транскрипцию какэкзонов, так и интронов. В процессе сплайсинга интроны с помощьюферментов вырезаются, а экзоны после удаления интронов сращиваются. Приэтом образуется функционирующая м РНК.
|
|
|
У прокариот процесс образования м РНК идет проще. При помощи РНК-полимеразы идет транскрипция соответствующего гена. Процесс сплайсинга упрокариот отсутствует. Образующаяся в процессе транскрипции молекула мРНК уже способна к функционированию.
Рис.7. Матричный синтез у прокариот и эукариот
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 1625; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!