Какие исследования возможны на проточном цитометре?
1) Апоптоз и некроз. Клетки, как и люди, покидают этот мир разными способами.
Апопто́з — это «программируемая» гибель, ее фрагменты быстро и аккуратно фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции. При некрозе содержимое погибшей клетки «вываливается» в окружающие ткани, что приводит к воспалительным процессам и другим нежелательным последствиям.
Для слайда:
1) Детекция апоптоза в нейтрофилах человека.
Апоптоз затрагивает не только внутренности клетки, но и ее поверхность. В ходе апоптоза фосфолипид фосфатидилсерин , в норме находящийся на внутренней поверхности клеточной мембраны, мигрирует на ее наружную поверхность удалось захватить. Неспецифическое связывание бактерии с поверхностью фагоцита (без захвата) отсекается при помощи окрашивания трипановым синим.
Нейтрофилы обработали реагентом, стимулирующим апоптоз, а далее окрасили последовательно ДНК-связывающим красителем, не способным проникать через мембрану живой клетки, и флуоресцентно-меченым белком аннексином, связывающимся с фосфатидилсерином на внешней мембране: схематично процесс показан слева. Справа изображена двумерная диаграмма с флуоресценцией аннексина и PI по осям, где мы видим три разные популяции: V — живые клетки; Ap — клетки на ранней стадии апоптоза (появление фосфатидилсерина во внешнем липидном слое); Ap/N — на поздней стадии апоптоза и во время некроза (нарушена асимметрия липидов и целостность поверхностной мембраны клеток).
|
|
|
2) Определение трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) (рис. 9).
Один из первейших признаков апоптоза —нарушение работы митохондрий, которые выбрасывают в цитоплазму проапоптотические факторы (такие как цитохром c) и меняют свой трансмембранный потенциал (ΔΨm). Это изменение можно зафиксировать при помощи флуоресцентных катионных красителей, что и используется как индикатор апоптоза. Это важный параметр клеточного «здоровья», поскольку митохондрии являются «энергетическими станциями» клетки — если у них что-то не в порядке, то и на всей клетке это непременно отразится. Изменение трансмембранного потенциала также является ранним маркером апоптотических процессов.
1) «Перепись населения» среди клеток крови
Это активно применяют в клинических исследованиях для выявления хронических инфекционных и аутоиммунных заболеваний, диагностики первичных иммунодефицитов, а также оценки эффективности проводимого лечения.
На рисунке изображена схема эксперимента по анализу дифференцировки тимоцитов мыши и приведены первичные данные с проточного цитометра по оценке популяций и апоптоза. Все Т-клетки берут начало от гемопоэтических стволовых клеток красного костного мозга, которые мигрируют в тимус и дифференцируются в незрелые тимоциты. За их дифференцировкой можно следить по экспрессии поверхностных маркеров . Несмотря на кажущуюся сложность рисунка, на этом примере явственно прослеживается основная логика постановки любого многопараметрического измерения.
|
|
|
2) Хромосомный анализ
Хромосомы окрашены красителями— Hoechst 33258 связывается с AT-богатыми областями, а хромомицин А3 указывает на GC-богатые участки. Правда, существует сложность: на цитометре невозможно разделение 9–12 хромосом.
3) Пролиферация и клеточный цикл
Для изучения динамики пролиферации клетки предварительно обрабатывают флуоресцентным красителем, который связывается с белками цитоплазмы. После каждого последующего митоза его содержание в дочерней клетке становится вдвое меньше, чем в родительской. Как следствие, в два раза снижается интенсивность флуоресценции клеток
4) Проницаемость мембраны
клетки необходимо окрасить на поверхностные маркеры, фиксировать, пермеабилизировать (изменить проницаемость клеточной мембраны, чтобы доставить первичные антитела внутрь клетки), заблокировать неспецифическое связывание и далее провести окрашивание флуоресцентно меченными вторичными антителами к целевому белку.
|
|
|
5) Внутриклеточные медиаторы и белки
Интеркалирующие красители проникают внутрь клетки только в случае, если целостность мембраны нарушена (например, это характерно для поздних стадий апоптоза и некроза), и связываются с ДНК. Мембрана живых клеток непроницаема для этих красок, поэтому они связываются только с белками на поверхности, и сигнал при измерении на цитометре получается слабый. Мембрана некротических клеток проницаема, поэтому Zombie связывается и с внутриклеточными белками, что делает флуоресценцию гораздо ярче.
6) Измерение рН
7) Фагоцитоз
бактерии необходимо флуоресцентно пометить (например, при помощи FITC), после чего инкубировать их с фагоцитами. Клетки, захватившие меченые бактерии, будут светиться и по результатам проточной цитометрии. Чем ярче светится фагоцит, тем больше бактерий ему
8) Анализ трансгенных популяций
9) Измерение РНК
Визуализирующая проточная цитометрия: технология Amnis FlowSight от Merсk
Классическая проточная цитометрия имеет один существенный недостаток — при появлении в исследовании редких событий, как правило, невозможно установить, что это: мусор (останки погибших клеток) или редкая уникальная субпопуляция. У исследователя нет возможности визуализировать эти клетки, чтобы в деталях разобраться с ними. Обычно такие события просто исключается из анализа данных. Между тем, именно эти «артефакты» могут представлять большую научную ценность. Тем не менее существуют решения, позволяющие рассмотреть каждую клетку, проходящую через анализатор, индивидуально и тем самым совместить высокую скорость анализа проточного цитофлуориметра с возможностью морфологического анализа флуоресцентного микроскопа с хорошим разрешением. Технология визуализации в проточной цитометрии реализована в цитофлуориметрах FlowSight и Image Stream Marck II. При использовании данной технологии прибор фиксирует изображение каждой (!) клетки, проходящей через зону детекции. Пользователю достаточно кликнуть курсором на интересующую область на диаграмме, чтобы получить изображения клеток, которые были проанализированы. Бесспорное преимущество такой технологии — возможность «увидеть», в прямом смысле этого слова, каждую анализируемую клетку и понять что это: мусор или же редкая атипичная форма клетки. Это позволяет существенно расширить потенциал метода проточной цитометрии, дополнив его возможностями современной клеточной микроскопии.
|
|
|
Системы ImageStream®X MKII и FlowSight® обеспечивают анализ большого количества изображений каждой клетки в потоке, включая светлопольный и темнопольный каналы (SSC) и до 10 флюоресцентных каналов на высокой скорости. Камера ImageStream®X оперирует размерами пикселя 0.1/0.25/1 мкм2 с увеличением 60X/40X/20X, соответственно, что позволяет визуализировать флуоресценцию мембраны, цитоплазмы, субклеточных органелл или ядра с высоким разрешением.
Традиционные проточные цитометры отлично подходят для рутинных операций с использованием характеристик светорассеяния низкого разрешения для аппроксимации размера и внутриклеточной гранулярности. Проточные имаджинг-цитометры Amnis® генерирует такие же ‘размер vs комплексность, но с мощью 20- кратного увеличения (или даже больше), что позволяет дать абсолютно иную информацию, чем просто относительный размер клетки.
Дата добавления: 2022-11-11; просмотров: 20; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!