Полимерные флуорохромы нового поколения
История
Основные исторические вехи на пути развития проточной цитометрии. 1934 г. — Первая публикация с упоминанием полуавтоматического проточного оптического счетчика клеток. 1947 г. — Публикация схемы фотоэлектрического счетчика для анализа бактериальной загрязненности воздуха [3]. 1949 г. — Патент Уолласа Коултера Means for counting particles suspended in a fluid. 1965 г. — Первый волюметрический проточный анализатор [4]. 1969 г. — Первый коммерческий флуоресцентный проточный анализатор (цитометр) (Wolfgang Göhde, ICPII, Partec). 1973 г. — BD FACS-1 — первый проточный флуоресцентный сортер-анализатор [5]. 1980–2000-е гг. — Выход на коммерческий рынок решений для цитофлуориметрии и сортинга, дальнейшее совершенствование метода. Рост числа параметров от 3–4 до 20+ (BD LSR-II, Cytopea Influx). 2005 г. — Первый проточный цитометр с визуализацией. 2009 г. — Первый коммерческий инструмент для масс-цитометрии. 2016 г. — BD выпускает на рынок анализатор BD Symphony с потенциальными возможностями по детекции до 50 параметров.
Сейчас выпускают два основных типа приборов для проточной цитометрии:
- простые в использовании аппараты, которые могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под углом около 10° (малоугловое прямое рассеяние) и 90°;
- большие клеточные сортеры, которые не только измеряют пять и более клеточных или ядерных параметров, но и автоматически сортируют частицы с заданным набором этих параметров по отдельным фракциям.
|
|
|
Основные принципы метода
Суть проточной цитометрии, пожалуй, можно изложить всего одним предложением: поток клеточной суспензии в ячейке сжимается, клетки выстраиваются в очередь и проходят через лазерный луч, регистрация рассеяния от которого позволяет охарактеризовать каждую клетку в потоке индивидуально
Клетки, исследуемые цитометрией, метят флуорохромами, поэтому лазерный луч возбуждает вторичное свечение (флуоресценцию). Затем сигналы флуоресценции и светорассеяния регистрируются различными детекторами (рис. 3). Информация от детекторов используется компьютерным алгоритмом, который позволяет в наглядной форме «посчитать» клетки и разделить их на отдельные популяции, отличающиеся друг от друга по каким-то важным параметрам, интересующим исследователя
В зависимости от используемых флуорохромов требуются разные длины волн для их возбуждения и разные детекторы (фильтры) для анализа испускаемого свечения. В современных приборах (рис. 4) может быть до 7 лазеров и до 30 каналов детекции, но для большинства приложений достаточно 1–3 лазеров и 4–10 каналов. Такие сложные конфигурации позволяют проводить многопараметрический анализ, когда одна клетка связана с несколькими флуорохромами с отличными друг от друга длинами волн испускания, а нередко — и возбуждения. Это позволяет исследовать сразу несколько свойств клеток из одной пробы, что экономит время анализа и расход анализируемого образца.
|
|
|
Детекторы флуоресценции
Система для регистрации свечения флуоресцентных меток (детектор флуоресценции, канал флуоресценции) состоит из комплекса светофильтров, зеркал и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в определенном диапазоне длин волн, соответствующем измеряемому флуорохрому.
Что «видит» цитометрия?
Прямое и боковое светорассеяние Проточный цитометр обладает двумя детекторами светорассеяния, позволяющими делать выводы о размерах и структуре клеток (рис. 5): Детектор прямого (малоуглового) светорассеяния (forward scatter, FS) располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой. Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки. Детектор бокового светорассеяния (side scatter, SS). Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого бокового светорассеяния позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро/цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений).
|
|
|
Комбинация бокового и прямого светорассеяний позволяет судить о морфологии клетки в целом и выделять различные популяции клеток для дальнейшего анализа. Например, использование только двух перечисленных выше детекторов позволяет провести первичный анализ популяций лейкоцитов с помощью диаграммы бокового—прямого (SS—FS) светорассеяния.
Основные типы красителей
Главное свойство красителей для проточной цитометрии — флуоресценция. Их можно разделить на три группы по принципу связывания с клеткой или ее фрагментами:
- Низкомолекулярные флуоресцентные соединения, способные связываться с определенными компонентами клетки. Применяются для анализа клеточного цикла и клеточной смерти.
- Белки, связанные с флуорохромами,— например, любые флуоресцентно меченные антитела. О типах флуорохромов будет рассказано чуть ниже.
- Флуоресцентные белки (например, знаменитый GFP), синтезирующиеся прямо в клетке при помощи трансфекции.
- Флуорохромы, используемые самостоятельно или же как метки для антител, можно разделить на несколько групп в зависимости от принципа флуоресценции и их химического состава.
|
|
|
Флуорохромы
Флуорохромы (флуоресцентные красители) — вещества, которые способны связываться с объектом и при освещении светом флуоресцировать, то есть поглощать энергию света и переизлучать ее с бóльшей длиной волны.
Что делать, если цитофлуориметр оснащен всего одним лазером, а экспериментатору необходимо измерить три или четыре параметра с минимальным «засветом» друг на друга? Есть хорошее решение — использовать так называемые тандемные красители: это два флуорохрома, ковалентно соединенные между собой через «мостик» (спейсер). Когда первый краситель возбуждается и переходит в синглетное состояние, его энергия передается на второй краситель. Это активирует второй флуорохром, флуоресценцию которого и регистрирует цитометр. Этот процесс называется флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET).
Полимерные флуорохромы нового поколения
В 2000 году Нобелевскую премию присудили за проводящие органические полимеры, которые нашли свое применение и в биоисследованиях. На основе этого открытия были созданы полимерные флуорохромы нового поколения (например, краски серии Brilliant Violet [9]). Фактически, к антителам присоединили органические полимеры, которые хорошо поглощают свет и эффективно высвечивают его в форме флуоресценции (рис. 10). Именно совокупность этих двух параметров делает полимерные флуорохромы столь удобными для применения в проточной цитометрии.
Дата добавления: 2022-11-11; просмотров: 46; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!