Способы получений моноклональных антител.
Когда после слияния клеток двух различных линий образуется клон, продуцируемые им антитела необязательно будут моноклональными в иммунологическом смысле, ибо в каждой клетке гибридного клона присутствуют хромосомы обоих родительских клеток и экспрессия этих хромосом ведет к продукции соответствующих двух иммуноглобулинов.
Однако на ранних стадиях размножения гибридные клетки быстро утрачивают часть хромосом, в т.ч. и хромосомы миэломы, ответственные за синтез миэломных иммуноглобулинов.
Селекция клонов гибридом с экспрессивными хромосомами иммуных лимфоцитов значительно отличается, если имеется мутантная миэломная линия, не продуцирующая миэломных иммуноглобулинов.
Отобранные клоны могут храниться в замороженном состоянии. В любое время определенное количество клеток такого клона можно ввести животному той же линии, от которой получены клетки для слияния. У животных развивается опухоль, которая продуцирует моноклональные антитела заданной специфичности. Антитела накапливаются в сыворотке крови животного в очень высокой концентрации – от 10 до 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать invitro, а секретируемые антитела получать из культуральной жидкости.
Гибридомная техника получила широкое применение. Теперь моноклональные антитела можно определить, как химический реагент известной структуры, который можно получить по желанию, тогда как соответствующая антисыворотка, получаемая классическим способом является вариабельной смесью реагентов и никогда не может быть в точности воспроизведена после гибели исходного животного.
|
|
|
Получение моноклональных антител.
Таким образом, резюмируя сказанное, биотехнологию получения моноклональных антител можно свести к следующим этапам:
1/ иммунизация животных
2/ подготовка клеток к слиянию
3/ слияние
4/ клонирование гибридных клеток, т.е. отбор клонов, продуцирующих необходимые исследователю антитела
5/ массовая наработка гибридных клеток
6/ получение культуральной жидкости или асцита, содержащего антитеа
7/выделение и очистка антител
Не рассматривая подробно каждый из этапов, остановимся на некоторых моментах технологии.
Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделить из селезенки B-лимфоциты через 3-4суток после последнего введения антигена, т.е. тогда, когда в лимфатических органах много активно пролиферирующих клеток.
После слияния клеток образуются гибридные клетки. Антитела, которые ими продуцируются, необязательно будут моноклональными в иммунологическом смысле, ибо в каждой клетке гибридного клона присутствуют хромосомы обеих родительских клеток, т.е. ядра новых клеток содержат число хромосом, являющееся суммарным числом хромосом родительских клеток. Экспрессия этих хромосом ведет к продукции иммуноглобулинов обеих родительских клеток. Однако на ранних стадиях размножения гибридные клетки быстро утрачивают часть хромосом. Эта утрата носит случайный характер, а потому «потеряться» могут как хромосомы лимфоцитов, так и хромосомы опухолевой клетки. В случае «потери» миэломных хромосом и образуются, необходимые нам клоны гибридом, продуцирующие лимфоцитарные антитела, которые в этом случае и будут моноклональными. Таким образом, после слияния клеток задача исследователя заключается в том, чтобы обнаружить и выделить из популяции клеток-гибридов необходимый клон. Для выявления моноклональных антител, синтезируемых гибридомами, применяют разные методы. Основные требования к выбранному методу – надежность и быстрота, т.к. проверке должно подвергаться сразу большое количество проб. Основные методы проверки для обнаружения антител к интересующему антигену – это иммуноферментный, радиоиммунный и иммунофлуоресцентный методы.
|
|
|
Отобранные клоны гибридом могут длительное время храниться в замороженном состоянии. В любое время определенную дозу такого клона можно использовать для наработки моноклональных антител. С этой целью клетки гибридом культивируют либо в стационарных переодических культурах, либо в роллерных или иной конструкции ферментерах в протоке. Рост клеток поддерживает в фазе логарифмического роста и избегают превышения концентрации их выше 0,5 млн/мл. Антитела выделяются в культуральную жидкость, поэтому ее собирают, а клеточный осадок утилизируют. При таком методе наработки антител их концентрация в культуральной жидкости достигает 10-100 м к г/мл.
|
|
|
Для получения больших количеств антител клетки гибридом вводят в организм животных и получают от них асцитную жидкость, содержащую антитела.
Для многих целей не требуется очистки антител и они используются в виде культуральных или асцитных жидкостей. При необходимости же их очистки грубые иммуноглобулиновые фракции получают высаливанием белков сульфатом аммония /45% насыщения/ с последующим диализом. Выделение антител в чистом виде проводят методами иммуноадсорбциимили монообменной хроматографии. Наиболее простой метод – хроматография на сахарозе с использованием белка А /продукт Staph.aureus/, обладающим высоким средством к Fc фрагменту антител.
|
|
|
Производство и применение моноклональных антител.
Поскольку гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, то для научных целей создаются гибридомные банки. Многие фирмы кровно заинтересованы в увеличении масштабов производства моноклональных антител, поскольку сфера их применения, помимо количественного определения веществ, групп крови, тканевых антигенов, аллергенов и пр. включает разнообразную диагностику, в т.ч. и инфекционных болезней.
Благодаря использованиюмоноклональных антител, стало возможным диагностика злокачественных опухолей, выделение биологически активных веществ из сложных смесей, точная идентификация специализированных клеток, изучение клеточных мембранных белков, терапия при опухолях и аутоиммунных заболеваниях.
Интерес к применению моноклональных антител проявляют целый ряд фирм. В США существуют компании, выпускающие диагностические наборы для обнаружения вирусных и раковых заболеваний, установления аллергенов, иммунореагенты для биологических анализов. Перед нами типичный пример фантастического бума на мировом биологическом рынке, который порожден созданием гибридомной биотехнологии. В настоящее время многочисленные фирмы представляют уже целый ряд препаратов моноклональных антител для прикладной медицины. В отечественной ветеринарии уже выполнены в этом направлении первые экспериментальные работы.
Дата добавления: 2022-01-22; просмотров: 20; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!