Различные стадии обработки при изготовлении иммуноглобулиновых препаратов.
| Получение сыворотки | 1.Центрифугирование 2.Дефибринация 3.Фильтрация |
| Фракционирование | Криопреципитация Термопреципитация Высаливание Осаждение риванолом Осаждение этанолом Хроматография на ионообменных смолах Способы адсорбции Ультрацентрифугирование Фильтрация |
| Разрушение молекул глобулина | Обработка пепсином или плазмином pH - изменение |
| Деконтаминация | Пастеризация УФ-облучение ВРI-обработка |
| Консервация | Фенол Мертиолат |
| Стабилизация | Лиофилизация Аэросил Гликоколл |
Проверка активности и безвредности Ig -препратов.
Как и для всех медицинских средствIg-препараты в обязательном порядке подвергаются конечной проверке на активность действия и безвредность. При этом в полном объеме проводятся следующий методы исследования:
1.Доказательство желаемого общего содержания Ig-нов
2.Доказательство отдельных желаемых классов Ig (G, M, A)
3.Доказательство специфической активности антител против соответствующего микроорганизма.
4.Биопроба со все увеличивающимся количеством возбудителя на лабораторных животных /титрация/.
5.Биопроба на животных восприимчивого вида, для которых предназначен биопрепарат.
6.Эпизоотологическое исследование на профилактическую и терапевтическую эффективность иммуносыворотки.
7.Проверка активности и безвредности Ig-препаратов в процессе стабилизации, сроков хранения биопрепарата.
|
|
|
При контроле безвредности в обязательном порядке проверяют стерильность, отсутствие пирогенов, клиническая переносимость /морские свинки, белые мыши/, отсутствие антител против хозяина и неспецифических комплеменфиксирующих антител.
Если препарат предназначен и для внутривенной аппликации, то дополнительно проводят поверку на экспериментальных животных на внутривенную переносимость /безвредность/.
Гибридомная техника и получение моноклональных антител.
Принципы слияния соматических клеток.
Еще до разработки технологии гибридом, позволившей получить гомогенные антитела, большое влияние на развитие клинической медицины оказали «обычные» антитела и гипериммунные сыворотки. Отметим, что наработка походящих антител всегда осложнялась непредсказуемостью иммунного ответа, и их титр, как и перекрестные реакции, варьировали от животного к животному и от одной партии сыворотки к другой. Это определялось тем, что данный антиген вызывает образование целого набора антител. В основу метода получения практически неограниченного количества гомогенных антител, которые находят самое широкое применение, легла фундаментальная работа Кёлера и Миьштейна, выполненная в начале 70 гг.
|
|
|
В 1960 г Барски и др. /Франция/ обнаружили, что при совместном культивировании двух линий опухолевых клеток мыши образуется новый тип клеток. Ядра новых клеток содержали суммарное число хромосом родительских клеток и обнаруживали хромосомные маркеры родительских клеток.
Частота слияний оказалась очень низкой, примерно 10-4-10-6, но Окаде /1962/ удалось увеличить эффективность слияния опухолевых клеток с помощью гемагглютинирующего вируса Сендай, при том используя его в инактивированном виде. Вирус способствует слиянию, связываясь одновременно с мембранами двух клеток.
Позднее Харрис и др. /1965/ показали, что между клетками, принадлежащими позвоночным различных отрядов, возможно соматические слияния, но хромосомы одного из видов исчезают. И поскольку в результате слияния клеток, принадлежащих животным разных видов, всегда наблюдалась утрата хромосом одного вида, полученные гибридные клетки оказались очень полезным объектом для генетического анализа.
Соматические гибриды были получены и при использовании вместо вируса Сендайполиэтиленгликоля /лизолитецина, ионы кальция/ при смешивании клеток животных разных видов, слиянии растительных клеток разных видов и даже слияние животных клеток с растительными.
|
|
|
Гибридомы . В результате иммунного ответа на определенный антиген в организме образуется высокогетерогенный продукт, иными словами, антисыворотка содержит смесь антител. Последние продуцируются разными линиями В-лимфоцитов и направлены к различным антигенным детерминантам.
Если бы определенную линию лимфоцитов можно было выделить и вырастить invitro, полученный клон продуцировал бы один тип антител – моноклональные антитела.
К сожалению, антителообразующие клетки не могут расти в культуре. В то же время существуют злокачетвенные опухоли костного мозга миэломы, клетки которых продуцируют большое количество аномальных глобудинов. Эти клетки обладают способностью к неограниченному росту /т.е. образуют ионы/ и продуцируемые ими иммуноглобулины идентичны по структуре.
По сути дела это моноклональные антитела, однако, антиген, к которому они направлены неизвестен. Миэломные клетки продуцируют иммуноглобулины в огромном количестве /до 10 г/л крови/. В 1973 г. Мильштеин и сотр. /Кембридж/ слили клетки крысиной и мышечной миэломы и обнаружили, что гибридные клетки продуцируют иммуноглобулины, состоящие из различных комбинаций полипептидных цепей, синтезируемых родительскими клетками. Однако комбинаций с V- и C-участками /вариабельная и постоянная области антител/ от разных линий никогда не получалось /гены, кодирующие синтез V- и C-участков расположены на одной хромосоме/, в результате в гибридных клетках миэломы не происходит аллельного исключения, иными словами, информация от обеих родительских линий «кодоминантно» экспрессируется в слившихся клетках. Таким образом, гибридные клетки двух линий миэломы продуцируют иммуноглобулины обеих родительских линий.
|
|
|
Обретя мастерство в технике слияния миэломных клеток, Кёллеру /1974/ затем удалось слить миэломную клетку с лимфоцитом из популяции, предварительно имевшей контакт с определенным антигеном.
Вначале полученным гибридомы синтезируют смесь антител, включающую два типа антител родительских клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых и легких цепей антител двух родительских форм. Впоследствии, в результате элиминации хромосом образуются клетки, способные к синтезу антител лишь одного типа. Это могут быть либо антитела, закодированные в геноме лимфоцита, либо антитела, характерные для клеток миэломы. Скрининг и обнаружение клона, синтезирующего искомое антитела, ведут при помощи биохимических и иммунохимических методов.
Полученная путем такового слияния клетка синтезировала антитела соответствующей специфичности и одновременно обладала способностью к неограниченному росту подобно злокачественной миэломной родительской клетке. Клоны клеток, способные секретировать единственный тип молекул антител и расти в культуре, удалось выделить из общей популяции путем селекции /селективная среда/. Такие клетки – химеры называются гибридомами. Они наследуют способность к неограниченному росту в культуре клеток и в то же время к продукции антител определенной специфичности –моноклональные антитела. Эта работа явилась в значительной степени результатом исследований в области синтеза антител, культивирования клеток и клеточных слияний, проводимых в течение двух десятилетий.
Дата добавления: 2022-01-22; просмотров: 14; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!