Обнаружение микроорганизмов химическими методами.
Анализ микроорганизмов по их липидному составу.
Липиды — обязательные компоненты мембран, окружающих цитоплазму каждой микробной клетки. Липидный состав различных микроорганизмов в значительной степени отличается друг от друга. Существует шесть (и даже больше) классов липидов, которые обнаружены у микроорганизмов, состоящих из индивидуальных липидов с шестью или более структурными особенностями. Каждый микроорганизм имеет свой особенный липидный профиль (основной липид), и это свойство было положено в основу их химической идентификации. Следует сразу оговориться, что данный метод не идеален, поскольку любые микроорганизмы могут существенно менять профиль липидов в зависимости от возраста культуры и условий культивирования клеток.
Широкое распространение вследствие простоты и доступности получил анализ, основанный на изучении и сравнении метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК), входящих в состав липидов. Полный процесс идентификации включает эстерификацию липидов, метилирование входящих в их состав жирных кислот, разделение на хроматографических колонках и количественное определение с помощью газовой хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Специальным образом обработанные колонки дают хорошее разрешение МЭЖК, что позволяет сравнивать их время удерживания с ранее идентифицированными липидными профилями (стандарты). Количество каждой жирной кислоты можно рассчитать по площади хроматографического пика, а абсолютные концентрации — при введении внутреннего стандарта.
|
|
|
Анализ МЭЖК, экстрагированных из почвенных образцов, позволяет быстро и относительно недорого идентифицировать состав популяции почвенных микроорганизмов. Интерпретация результатов, однако, иногда встречает значительные трудности вследствие идентичности многих липидов у различных представителей изучаемого микробного сообщества.
Обнаружение отдельных генов и геномных последовательностей.
С обнаружением отдельных генов или специфических геномных последовательностей связаны прежде всего возможности анализа микробных сообществ без выделения и идентификации отдельных его членов в чистых культурах. Методы основаны на экстракции из почвенных, осадочных или водных образцов тотальной ДНК, ее очистки и анализа с помощью градиентных гель-электрофоретических методов. Основная трудность при экстракции тотальной ДНК связана с ее отделением и очисткой от гуминовых веществ почвы, хотя методы, позволяющие проводить такую очистку, постоянно совершенствуются. После экстракции ДНК подвергают иммобилизации на нитроцеллюлозном или нейлоновом фильтре, плавят и затем гибридизуют с известными последовательностями генов, ответственными за синтез тех или иных специфических ферментов. Так, наличие в пробе тотальной ДНК генов, гибридизуемых с геном, кодирующим нитрогеназу, говорит о присутствии в анализируемом сообществе азотфиксаторов, генов метанмонооксигеназы — о присутствии метанотрофов, а содержание генов РуБисКО — о наличии автотрофных микроорганизмов, фиксирующих углекислоту через цикл Кальвина. Генов, кодирующих ключевые реакции тех или иных процессов, расшифровано уже несколько десятков, и применение метода гибридизации дает возможность делать выводы о наличии определенных микроорганизмов в анализируемой пробе.
|
|
|
Мощный метод ПЦР позволяет идентифицировать неизвестные микроорганизмы, находящиеся в природной пробе, без выделения чистых культур. Разработаны «универсальные» праймеры на бактерии, археи и эукариоты, которые позволяют специфически амплифицировать последовательности этих трех разных групп микроорганизмов, разделить их с помощью TGGE/DGGE-методов, и затем, после вторичной амплификации отдельных полос, получить почти полный профиль микробного сообщества с идентификацией отдельных филогенетических линий и классификацией микроорганизмов на основе последовательностей 16S рРНК.
|
|
|
Для идентификации нужных микроорганизмов в сообществе используют гены-репортеры, которые легко обнаруживаются после проведения химических реакций или заявляют о себе после экспрессии в клетке испусканием света различной длины волны. Гены-репортеры используют обычно для обнаружения тех или иных видов активности в природных образцах при определении выживаемости введенных в них микроорганизмов, для обнаружения экспрессии и изучения активности нужного гена/фермента, под контролем промотора которого экспрессируется и ген-репортер. Генетическая конструкция в таком случае выглядит и работает следующим образом. Если нужный ген экспрессируется и фермент осуществляет свою функцию (например, расщепляет тот или иной ксенобиотик), то об этом можно судить на удалении по люминесценции гена-репортера (например, в толще почвы свет от места реакции трансмиттируется в таком случае с использованием оптоволоконных световодов). По тушению люминесценции в генно-инженерных штаммах E. coli судят о степени токсичности пробы воды или почвы.
Дата добавления: 2021-07-19; просмотров: 60; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!