Фенотипическое обнаружение микроорганизмов.
Тема лекции «Выделение микроорганизмов
Из экологических ниш»
Большинство микроорганизмов, растущих в природных образцах, еще ждут своей очереди быть выделенными в чистые культуры. По некоторым оценкам, мы можем культивировать меньше 0,1 % всего микробного разнообразия.
Десятки тысяч видов микроорганизмов, живущих как симбионты животных и растений, нуждаются в выделении и идентификации. Хотя многие из таких микроорганизмов относят к так называемым «некультивируемым» и, таким образом, остающимся недоступными классическим микробиологическим методам идентификации, существует несколько способов, позволяющих оценить их разнообразие и распространение. Такие методы включают прямые микроскопические наблюдения и различные приемы на основе молекулярной диагностики, включая амплификацию диагностирующих последовательностей генома, кодирующих синтез молекулы 16S рРНК, для последующей их расшифровки.
Методы прямого прижизненного окрашивания различных проб воды, почвы и осадков позволяют с уверенностью считать, что этот метод выделяет гораздо больше живых клеток, чем высевы на различные среды. Другими словами, результаты прямого счета живых клеток микроорганизмов показывают, что пока мы нс можем вырастить и идентифицировать более 99% видов микроорганизмов из таких проб. Такое большое расхождение в результатах прямого счета в сравнении с высевом на среды поставило вопрос: являются ли прижизненно окрашенные микроорганизмы живыми или мертвыми? При применении в качестве прижизненного красителя акридинового оранжевого было замечено, что часть клеток окрашивается с последующей зеленой флуоресценцией, часть остается оранжевой. Это привело вначале к неверному выводу, что зеленые клетки — живые, а оранжевые — мертвые. Впоследствии было, однако, выяснено, что цвет флуоресценции зависит от отношения ДНК/белок в клетке: активно делящиеся клетки выглядят зелеными, а растущие более медленно или покоящиеся клетки дают оранжевую флуоресценцию, оставаясь при этом живыми.
|
|
|
В дальнейшем были разработаны более прямые методы, основанные на оценке метаболитической активности клеток (клеточное дыхание), позволяющие отличить живые клетки от неживых в природных пробах. Методы основаны на применении различных солей тетразолия, которые при восстановлении в клетке дегидрогеназами (дыхательная активность) превращаются в нерастворимый формазан красного цвета, что можно обнаружить визуально под микроскопом. Есть способ различать живые, мертвые и поврежденные (умирающие) клетки при измерении состояния мембранного потенциала с помощью флуорохромов. Предлагают также добавление к пробам живых клеток ингибитора клеточного деления (налидиксовой кислоты), при этом активно растущие клетки будут удлиняться без вступления в фазу бинарного деления.
|
|
|
Возможно, многие микроорганизмы, наблюдаемые при прямом микроскопировании как живые, вступили в состояние «не- культивируемой формы бактерий (НФБ)». Эта концепция была предложена американским микробиологом Р.Колвелл в 1987 г. Вначале концепция была встречена с критикой, однако к настоящему времени получила повсеместную поддержку. Показано, что часть клеток из природных образцов не дает колоний на лабораторных средах, хотя в природе они ведут активный образ жизни и патогенные формы удерживают свою вирулентность по отношению к животным. Эксперименты четко показали, что такие патогены человека, как Legionella pneumophila, Salmonella enter it id is, Vibrio cholerae и V. vulnificus, постоянно образуют НФБ формы в природных эконишах. Таким образом, становится понятной важность прямых микроскопических наблюдений природных образцов для обнаружения НФБ патогенов.
Для наблюдения за некультивируемыми формами микроорганизмов в природных образцах применяют методы молекулярного анализа. Разработано несколько десятков диагностических проб- последовательностей ДНК/РНК для специфического обнаружения определенных видов, родов, семейств или таксонов более высокого порядка непосредственно в природных образцах. С использованием таких последовательностей было обнаружено, что морские воды содержат многие виды архей и бактерий, которые не поддаются культивированию в лаборатории. Наиболее подходящие для такой диагностики олигонуклеотидные пробы длиной 18 — 20 нуклеотидов, так как они легко гибридизируются со специфическим участком ДНК искомого организма. Даже небольшие количества не культивируемых форм могут быть обнаружены в популяциях природных образцов с помощью ПЦР-амплифика- ции диагностических последовательностей ДНК (см. гл. 6). Жизнеспособные клетки микроорганизмов могут быть идентифицированы также с помощью специфических иPHК методом обратной транскрипции, при этом следует помнить, что время полужизни некоторых бактериальных иРНК может составлять меньше минуты.
|
|
|
Микроэлектроды.
Поскольку микробы очень малы, также малы и их микроокружения. Для клетки в 3 мкм микроокружение на расстоянии 3 мм соответствует расстоянию в 2 км для человека! Поэтому экологи-микробиологи, проводя эксперименты по изучению микробов в их экологических нишах (микроокружение), должны «думать о малом». Экспериментаторы разработали специальные миниатюрные стеклянные электроды с диаметром кончика до 2 — 3 мкм, которые позволяют проникать в микроокружение клеток в природных эконишах и проводить там измерения градиентов pH, Eh, солености, температуры, содержания кислорода и других химических элементов (Na+, К+, HS“, NH4, N20 и т.д.). К тому же разработаны миниатюрные спектрорадиометры, позволяющие качественно измерять поглощение света в микронишах, что важно при изучении структуры и функционирования цианобактериальных матов и других микробных сообществ. По спектрам поглощения света в видимой и ближней инфракрасной области в фото- трофных микробных сообществах можно предсказать наличие тех или иных фототрофных компонентов системы. Микроэлектроды интенсивно применяют при изучении цианобактериальных сообществ, на поверхности которых развиваются цианобактерии и водоросли, основные продуценты мата, до глубины, на которой свет становится лимитирующим фактором. Прослежено, что на глубине 1,0 —1,2 мм такого мата (при его общей толщине около 2 см) оксигенный фотосинтез прекращается (и сообщество становится анаэробным). С этого уровня резко возрастает концентрация сероводорода, возникающего в результате активности сульфатре- дукторов нижних слоев мата (в данном примере рассмотрена структура матов морских местообитаний — заливов, лиманов, эстуарий). Концентрация сероводорода в каждом слое сообщества — результат сбалансированного процесса его выделения сульфатре- дукторами, использующими остатки отмершей органики фото- трофов-продуцентов и его потребления аноксигенными фототро- фами, тионовыми или бесцветными серными бактериями.
|
|
|
При изучении распределения содержания кислорода в почвенных образцах применение микроэлектродной техники доказало, что даже в хорошо аэрированной почве в середине комочков диаметром 12 —15 мм могут быть анаэробные зоны диаметром до 6 мм!
Радиоизотопы
Эксперименты по измерению активности микроорганизмов в их природных местообитаниях или свежих образцах с применением радиоизотопов являются наиболее чувствительными методами из всех существующих. Кроме того, они могут пролить свет на судьбу того или иного субстрата в микробных сообществах определенной экониши. Для измерения интенсивности фотосинтеза применяют метод измерения включения меченого |4С02, имея контролем при этом «темновую» пробу. Для обнаружения и измерения скорости сульфатредукции применяют изотоп серы 35S042“, который превращается в H235S. Скорость метаногенеза можно проследить по превращению ,4С02 в ,4СН4 в присутствии значительного количества водорода или по трансформации |4С-метанола, метилированных аминов или ацетата в 14СН4. Хемоорганотрофные активности измеряют по скорости включения меченных по ,4С органических соединений, обычно для этих целей используют глюкозу или аминокислоты. Эффект использования органики можно определять и по выделению |4С02 из меченных по ,4С органических субстратов. Во всех случаях, определяя скорости процессов потребления изотопа или его выделения, необходимо учитывать соотношение меченого и немеченого субстрата, внесенного в пробу для расчета специфической активности потребления субстрата или образования продукта.
Эксперименты с радиоактивными изотопами широко применяют в экологии микроорганизмов, однако, поскольку в гетерогенных природных местообитаниях всегда могут проходить и химические превращения субстратов, необходимо параллельно проводить опыты с соответствующими контрольными образцами; ключевые из них — пробы с убитыми клетками. Для этой цели часто применяют формальдегид в концентрации 4 % или кипячение.
Стабильные изотопы
Поскольку большинство биогенных элементов имеет изотопы, как стабильные, так и радиоактивные, возможно изучение активности микроорганизмов в природных образцах с применением так называемого «изотопного эффекта», суть которого сводится к тому, что живые клетки способны дифференцированно использовать легкие и тяжелые изотопы одного и того же элемента в биологических трансформациях. В экологии микроорганизмов наибольшее распространение получили исследования, связанные с трансформацией изотопов углерода и серы. Большинство углерода представлено в природе в виде изотопа |2С, хотя встречается небольшое количество стабильного тяжелого |3С, а также радиоактивного |4С. Подобно этому, большинство соединений серы состоит в основном из 32S, хотя встречаются стабильный изотоп 34S и радиоактивный 35S. В большинстве биохимических реакций живых клеток выбираются соединения с более легким изотопом из имеющихся в наличии. Поэтому соединения с более тяжелыми изотопами остаются непрореагировавшими и их относительная доля в оставшемся субстрате увеличивается, а в продукте уменьшается. Этот феномен получил название «фракционирования изотопов».
При изучении проб различного происхождения оказалось, что наиболее «тяжелые» по углероду морские карбонаты (химического происхождения с соотношением Д,3С = ±5%о). Недавние (геологические) морские осадки имеют Д,3С = —10 — 35 %о, что явно указывает на участие микроорганизмов в их формировании. Биомасса растений имеет дефицит по ,3С 12 — 25 %о, нефть — 20 — 35 %о, а метан — 25 — 80 %о! Интересно отметить, что скальные породы возраста около 3,5 млрд лет (время появления жизни на Земле) обеднены по ,3С на 12 — 22 %о, что свидетельствует об очень раннем возникновении автотрофии на планете.
Подобные же измерения, проведенные в отношении изотопов серы, показали, что метеоритный сульфид имеет Д35Б от -3 до +3%о, тогда как залежи элементной серы — от -18 до +18 %о, а сульфид морских осадков — до -30 %о, что говорит о значительном вкладе сульфатредукторов в процесс глобального цикла серы.
Сбор образцов.
Для определения численности и активности микробных популяций в различных экосистемах разработаны многочисленные методологические подходы. При изучении микроорганизмов в природных образцах (общее число, число сообществ, их метаболические активности) репрезентативные части образца анализируют и результаты проецируют на сообщество в целом или экосистему. Термин «репрезентативный» отражает тот факт, что проба показывает разнообразие и плотность организмов общего местообитания, из которого взята проба. Во многих местообитаниях распределение микроорганизмов не гомогенное, а скорее кластерное, поэтому любая взятая проба, несомненно, точечная по отношению к изучаемому местообитанию (пространству), может содержать и много, и мало микроорганизмов, что приведет к неверной экстраполяции результатов. В особенности это верно для микроорганизмов, которые живут в условиях микроокружения, о чем экспериментатор может во время отбора пробы и не догадываться.
Обработка сложных проб, приготовленных из собранных индивидуальных проб с использованием специальных смесителей, позволяет минимизировать ошибку. Уровень достоверности при экстраполяции данных соответствующих проб на всю эконишу необходимо подкреплять статистическим анализом. Важно помнить, что каждое измерение состоит из трех фаз: 1) сбор образцов; 2) подготовка проб; 3) собственно измерение. При интерпретации результатов должны быть критически рассмотрены все три стадии пробообработки.
Различнее подходы применяют при отборе проб из таких сложных и разнообразных местообитаний, как кишечник животных, поверхностный слой почвы, воды озер, глубоководные осадки морей. Невозможность вплотную приблизиться к месту отбора проб заставляет придумывать различного рода пробоотборники для дистанционного забора проб.
Методы отбора проб и их хранение не должны изменять количества клеток или их активности в большую или меньшую стороны. Исследователю важно быть уверенным, что отобранные образцы репрезентативны и не загрязнены посторонними микроорганизмами, поэтому способ отбора пробы должен гарантировать наличие в ней микроорганизмов лишь из нужного местообитания.
1) Пробы почвы — отбирают обычно с соблюдением минимума асептики, так как количество микроорганизмов в поверхностных почвенных горизонтах во много раз больше, чем в воздухе или нестерильном (но чистом!) контейнере для образца. Для сбора образцов со значительной глубины отбирают керн, который высверливают вручную или с помощью специальных механизмов, и внутри керна находят нужные зоны, уже работая асептически в лаборатории.
Для отбора проб почвенных микроорганизмов, находящихся в относительно небольшом количестве, применяют «аттрактанты», или «наживки». В некоторых случаях в почву опускают чистые стекла или стекла со специфической агаризованной средой, на которой развиваются нужные микроорганизмы (стекла обрастания, по Холодному). Чистые стекла, не обладающие селективными свойствами, используют для подсчета прикрепившихся микроорганизмов в почвах или осадках. В этом случае стекло служит аналогом минеральных частиц почвы (кварц) и отражает микробное разнообразие неселективно.
Еще один вариант стекол обрастания — плоскопараллельные капилляры, впервые разработанные Перфильевым. Их называют также педоскопы — при погружении в почву, и пелоскопы — при погружении в донные осадки. Капилляры открыты с обоих концов, и микроорганизмы могут свободно перемещаться внутри них. Часто капилляры заливают средой (аттрактант), селективной для той или иной физиологической группы микроорганизмов. Преимущество плоских капилляров в том, что их содержимое можно рассматривать под микроскопом непосредственно, а плоская стенка сводит к минимуму искажение и преломление света при прохождении через капилляр. Применение капилляров Перфильева позволяет проводить прижизненные наблюдения за развитием почвенной или осадочной микробиоты, дает возможность вести непрерывные (с помощью автоматической кинокамеры, рассчитанной на определенное число снимков в час или день) исследования развития микробных популяций, не опасаясь подсыхания препарата, расширяет поле деятельности экспериментатора с внесением разного рода питательных веществ с одного конца капилляра, делая его проточным. Такие капилляры позволяют следить за развитием анаэробного сообщества без применения сложной техники анаэробного культивирования. Капилляры помогают наблюдать за прижизненным развитием экосистем в природных условиях, не нарушая их целостности, и дают возможность обнаруживать необычные морфологические формы пока нскультивируемых микроорганизмов.
2) Пробы воды —проблем с отбором водных образцов обычно бывает больше, чем с почвенными пробами, поскольку практически всегда пробы воды отбирают на значительном удалении от экспериментатора. При этом возникают большие проблемы в соблюдении стерильности, поскольку открытые водные пространства содержат немного микроорганизмов, и эти пробы легко загрязнить неестественной микробиотой самого прибора для отбора проб. Каждый из разработанных пробоотборников имеет свои преимущества и недостатки. Целью создания часто довольно сложных приспособлений является уверенность, что проба воды действительно отобрана из нужного места, например с глубины 100 м. Разработанные образцы водных пробоотборников включают вакуумированные бутыли, которые заполняются водой на определенной глубине с помощью грузика-мессенджера, разбивающего водозасасывающий капилляр. Другой вариант содержит стерильный пластиковый пакет, раскрывающийся с помощью пружины на определенной глубине после опускания груза с поверхности, одновременно приводящим в движение пружину и бритву, вскрывающую отверстие в пакете. Существует пробоотборник с укрепленными на разной глубине стерильными шприцами, в которые одновременно засасываются пробы воды. Такие приспособления применяют обычно для отбора проб из неглубоких стратифицированных озер. С глубоководными пробами необходимо предусматривать возможность декомпрессии организмов при подъеме на поверхность. Разработанные пробоотборники позволяют открывать и закрывать входные отверстия на глубине, препятствуя падению давления внутри пробы при подъеме.
3) Пробы донных осадков — отбирают с поверхности скребками или ковшами, однако такие способы не позволяют уберечь пробы от загрязнения посторонней микрофлорой. С соблюдением асептики можно отбирать пробы-керны, которые затем в лаборатории в стерильных условиях делят в вертикальном направлении, что позволяет прослеживать динамику осадков по горизонтали. Наиболее точно отбирают пробы морских осадков с использованием миниатюрных двух-трехместных подводных лодок, которые погружаются на глубину до 3 км, и там с помощью манипуляторов и специальных сверл отбирают пробы осадков в точно локализованном участке (особенно это важно в местах подводных термальных источников или «черных курильщиков»). Использование миниподлодок позволяет не только отбирать пробы, но и обрабатывать их нужным образом на месте отбора (например, вводить радиоизотопы), оставляя на месте для инкубации с последующим подъемом на поверхность для анализов.
4) Пробы воздуха — отбор необходимо проводить с применением аппаратов, которые минимально травмируют живые клетки микроорганизмов, находящиеся обычно в мельчайших капельках аэрозолей. Пассивная седиментация, позволяющая подсчитать количество осевших (и образовавших колонии) клеток микроорганизмов на поверхности открытых чашек Петри с агаризованной средой, пригодна для подсчета количества спор грибов, но не для количественного учета находящихся в воздухе бактерий. Чаще всего пробы воздуха отбирают пропусканием его определенного объема через бактериальные фильтры, размер пор которых можно варьировать для дифференциации микроорганизмов воздуха по размеру. Некоторые приборы (аппарат Кротова) сконструированы таким образом, что они направляют поток засасываемого воздуха при отборе пробы на поверхность открытой чашки Петри с агаризованной средой, на которой, как считают, осаждаются все частицы, взвешенные в воздухе, включая микроорганизмы.
5) Пробы биологических образцов растений или животных — включают сбор биологических жидкостей (растительный сок, кровь, моча, лимфа, мокрота), выделений (каловые массы) или проб с поверхности объекта, а также внутренних органов (биопсии). С поверхностей микроорганизмы смывают или счищают стерильным буферным раствором или физиологическим раствором (0,85 %-й раствор NaCl в дистиллированной воде) стерильными ватными тампонами. В других случаях микроорганизмы сохраняют непосредственно в образцах тканей, что важно для наблюдения их топографического распределения в тканях или количественного учета. Иногда анализы образцов проводят непосредственно под микроскопом (сканирующая электронная микроскопия) для рассмотрения взаимодействия микробных сообществ или изучения ассоциаций между животными, растениями и микробиотой.
Фенотипическое обнаружение микроорганизмов.
При чашечном посеве природных образцов можно достичь двух результатов: получить отдельные колонии чистых культур микроорганизмов (клонов одной клетки) и начать фенотипическое определение различных организмов (описание колоний). В некоторых случаях клетки из отдельно взятой колонии могут быть введены в пластинки для анализа (API-тест, Biolog), по результатам которого возможно определение микроорганизма до рода. Современные методы позволяют амплифицировать участок ДНК из клеток одной колонии с применением пары универсальных праймеров и определить последовательность вариабельного участка генома, кодирующего ген 16S рРНК. Этого бывает достаточно, чтобы, сравнивая с известными последовательностями из геномного банка, идентифицировать микроорганизм до рода или даже вида.
Выделение и идентификация членов микробного сообщества с использованием метода прямого рассева на чашки эффективны при высокой концентрации клеток того или иного члена сообщества. Если же относительное количество клеток искомого вида невелико, они могут «потеряться» при таком методе обработки пробы, и в этом случае метод прямого рассева на чашки с разведениями пробы непригоден для анализа.
Поскольку разные члены идентифицируемого микробного сообщества могут иметь различные требования к компонентам среды (состав и содержание солей, органического субстрата), а также к физическим условиям выращивания (температура, влажность, содержание кислорода и т.д.), для более полного выявления членов сообщества применяют параллельные посевы на среды различного состава (например, для выявления копиотрофов и оли- готрофов, органотрофов и литотрофов, азотфиксаторов и т.д.). Существуют приемы добавления в среды специфических ингибиторов для подавления развития той или иной группы микроорганизмов (например, для подавления развития эукариот на чашке с прокариотами применяют актидион).
Дата добавления: 2021-07-19; просмотров: 83; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!