ШИК-реакция или PAS-реакция (для выявления гликогена).
Реактив – Шифф-периодная кислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК – шифф-йодная кислота). Под влиянием периодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.
Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.
В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.
Обнаружение гликогена методом Мак-Мануса.
Метод Мак-Мануса выявляет вещества углеводной природы (гликозаминогликанов, гликопротеидов, гликогена и др.) в цитологических препаратах. Метод основывается на образовании диальдегидов, которые определяют с помощью реактива Шиффа под воздействием окислителя (йодной кислотой). В клетках гликоген обнаруживается в виде вишнево-красных гранул.
|
|
|
Методы выявление ферментов:
1. Оксидазы – ферменты, катализирующие окислительные процессы молекулярным кислородом. Среди них особое значение имеет миелопероксидаза (МП).
Миелопероксидаза – является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента повышается по мере созревания клеток. Однако, по мере дифференцировки их в зрелые клетки, активность фермента снижается. В клетках миелопероксидаза участвует в реакциях разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема-Кнолля или его модификаций. Реакция используется главным образом с целью диагностики острых лейкозов.
2. Фосфатазы входят в состав гидролаз. Эти ферменты широко распространены в клетках человека и животных. Они участвуют в обменных процессах с жирами, полисахаридами и нуклеопротеидами. К ним относятся такие ферменты как кислая фосфатаза и щелочная фосфатазы.
|
|
|
Кислая фосфатаза (КФ) – катализирует освобождение фосфата из спиртовых или фенольных моноэфиров при кислой рН среды. Кислые фосфатазы локализованы в лизосомах и цитохимически выявляются благодаря образованию окрашенных участков красного цвета в местах гидролиза субстрата. В качестве субстрата могут быть использованы нафтол-AS-фосфат, а-нафтилфосфат натрия, нафтол-А8-О-фосфат и др. Кислая фосфатаза присутствует в большинстве клеток крови и костного мозга. В гранулоцитах, моноцитах, эозинофилах и базофилах она выявляется, начиная с незрелых клеток этих рядов, где ее активность наиболее высокая.
Щелочная фосфатаза (ЩФ) – это фермент, который способен освобождать фосфат, катализируя отщепление фосфатных групп из фосфомоноэфиров в щелочной среде и принимает участие в обмене липидов и нуклеиновых кислот. Содержится исключительно в зрелых нейтрофилах. В периферической крови активность щелочной фосфатазы значительно выше, чем в клетках костного мозга. Фермент выявляется в виде желто-коричневых гранул в цитоплазме.
3.Неспецифические эстеразы (НЭ) также относятся к гидролазам. Эти ферменты способны гидролизовать простые эфиры N-свободных спиртов жирных кислот. Это весьма неоднородная группа энзимов, названия которых обусловлены субстратом, который они гидролизуют. Получено более 9 изоферментов НЭ. Фракции 1, 2, 7, 8, 9 выявляются при использовании нафтол-АБ-О-хлорацетата и представляют активность хлорацетатэстеразы, которая присутствует в гранулоцитах. Фракции 3, 4, 5, 6 взаимодействуют с эфирами α-нафтилацетата и представляют собою НЭ, выявляемые в моноцитах, плазматических клетках и тромбоцитах. Наибольший интерес для гематологов представляют хлорацетатэстераза, α-нафтилацетатэстераза, кислая α- нафтилацетатэстераза. Неспецифические эстеразы являются лизосомальными ферментами. α-Нафтилацетатэстераза (αНАЭ) обнаруживается во всех миелоидных клетках, но наибольшая ее активность определяется в моноцитах. В клетках эритроидного ряда в норме она не определяется.
|
|
|
Кислая нафтилацетатэстераза – это фермент, локализующийся в лизосомальных гранулах. Его активность выявляется в реакции с α-нафтилацетатом в кислой среде при рН 5,8. Она характерна для Т-хелперов. Кроме того, она выявляется в клетках моноцитарного ряда.
|
|
|
Хлорацетатэстеразу (ХАЭ) называют гранулоцитарной. Как и миелопероксидаза, она является маркером нейтрофилов. Активность фермента выявляется в виде гранул синего цвета.
Сдвоенную реакцию на ХАЭ и αНАЭ проводят последовательно на одном мазке. Это позволяет разделить клетки гранулоцитарной и моноцитарной линий, что имеет значение при диагностике миеломоноцитарного лейкоза.
Реакция Браше. Метод служит для выявления РНК. Используется реактив из смеси двух красителей: метилового зелёного и пиронина. Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет. Другие структуры ядра (помимо ядрышек) – зелёные.
Реакция Фёльгена. Основной реактив – фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа). ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет.
Цитохимическое исследование липидов. Липиды локализуются в цитоплазме клеток главным образом в мембранах органелл и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах. Играют важную роль в проницаемости мембран. Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).
Выявление слизи в цитоплазме клеток методом окраски муцикармином.
1. Цитологический препарат фиксируют в метаноле 3 мин.
2. Опускают в эфир на несколько секунд, затем в 50° этиловый спирт.
3. Заливают мазки 1% спиртовым раствором муцикармина на 10 мин, затем в 96° этиловый спирт.
4. Промывают в дистиллированной воде.
5. Докрашивают гематоксилином Эрлиха – 5 мин.
6. Смывают краситель водопроводной водой.
7. Высушивают.
В результате положительной реакции в цитоплазме клеток слизь окрашивается в малиновый цвет.
Список литературы
1. Стволинская Н. С. Цитология /Стволинская Н. С. – Москва: Прометей. – 2012 г.
2. http://pandia.ru/text/79/231/31662.php
3. Основы цитологии : учебное пособие для обучающихся I курса медицинского института ПетрГУ / О. В. Пашкова И. А. Брайнина, Т. Б. Мятлюк ; М-во образования и науки Рос. Федерации, Федер. гос. бюджет. образоват. учреждение высш. образования Петрозавод. гос. ун-т. – Петрозаводск : Издательство ПетрГУ, 2017 – 32 с.
4. Владимир Коничев, Н. С. Стволинская, Руководство к практическим занятиям по цитологии/ - Москва: Прометей. – 2014 г.
Дата добавления: 2021-01-21; просмотров: 484; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!