Экспресс – методы окраски цитологических препаратов.
Окраски по Алексееву. Ответ дается уже через 5–10 минут. Метод Алексеева предусматривает ускоренную обработку цитологических препаратов азурэозиновыми смесями по принципу Романовского с целью получения привычной цитологической картины. Методика приготовления препаратов.
Обработка препаратов может производиться двумя способами:
1. Предметные стекла с высохшими на воздухе препаратами в количестве 3–5 штук, укладывают на полочку для окраски отпечатками или мазками кверху. Глазной пипеткой на каждый препарат наносят раствор краски Романовского-Гимзы в количестве 5–8 капель. Краска должна покрыть весь мазок или отпечаток. В таком состоянии препарат оставляют на 60 секунд, в течение которых он фиксируется метанолом, входящим в состав краски, и частично окрашиваются его элементы. Затем к краске на предметных стеклах добавляют 10–16 капель нейтральной дистиллированной воды, нагретой до 50–60° и покачиванием смешивают краску с водой. Препарат оставляют на l–2 минуты. Затем струей нейтральной дистиллированной воды из колбы-промывалки, не сливая, омывают краску с препарата. Остаток воды сливают и препарат просушивают фильтровальной бумагой. Окрашенный препарат просматривают под микроскопом сначала с малым увеличением, а при нахождении подозрительных мест переходят на иммерсионный объектив. Остальные мазки оставляют залитыми краской на 3–5 минут на тот случай, если первый препарат окажется бледно окрашенным. Первым обычно красится самый тонкий из препаратов, так как он быстрее пропитывается и сушится.
|
|
|
Окраска по этому методу тканевых и опухолевых клеток и лейкоцитов почти не отличается от окраски их в препаратах, обрабатываемых обычными цитологическими методами. При этом четко выделяется структура ядер, хорошо видны нуклеолы, зернистость и включения протоплазмы. Эритроциты частично гемолизируются, что облегчает исследование. 2. Приготовляют 0,4% раствор сухой краски Лейшмана в метаноле (метиловый спирт). Для ускорения растворения краски ее можно в закрытом флаконе поместить в водяную баню при 60° на 1 час, помешивая. При охлаждении краску следует профильтровать. Раствор стоек. Препараты укладывают на полочку для окраски, покрывают нетолстым слоем раствора краски Лейшмана (12–15 капель на каждый препарат) и оставляют их на 20–30 секунд. Затем, не сливая краски Лейшмана со стекла, добавляют к ней раствор краски Романовского-Гимзы на нейтральной дистиллированной воде (1,6 капли на 1 мл воды), нагретый до 50–60°, в количестве, способном удержаться на стекле. Первый препарат смывают через 2–3 минуты, остальные – докрашивают. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и исследуют под микроскопом. Микроскопическая картина при этом способе окраски более яркая, чем при первом. Эритроциты сохраняются. Особенно четко выступают темные нуклеолы на нежно окрашенных ядрах. Дистиллированная вода для разведения краски и смывания ее с препаратов должна иметь рН 6,8–7,0.
|
|
|
Окраски по Папаниколау. Метод окрашивания по Папаниколау является наилучшим для гинекологических мазков, так как этот метод полихромный, он позволяет оценить степень созревания цитоплазмы (от сине-зеленого цвета в незрелых клетках до розового в клетках со зрелой цитоплазмой и оранжевого в клетках с ороговением), благодаря влажной фиксации хорошо сохраняются ядра, клеточная мембрана и структура хроматина. Ответ дается через 15–20 минут.
Необходимые реактивы:
1. Смесь Никифорова.
2. Спирт 95, 90, 80, 70 и 50°.
3. Гематоксилин Гарриса.
4. 0,25%-ный раствор соляной кислоты.
5. Краска оранжевая Г.
6. Краска (ЕА-36).
7. Абсолютный спирт.
8. Ксилол.
9. Канадский бальзам.
Приготовление гематоксилина Гарриса:
1 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта, 20 г калийных квацов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды. Через 24 ч оба раствора соединяют и прибавляют 0,5 г красной или желтой окиси ртути. Раствор нагревают до кипения, остужают и через 24 ч фильтруют.
|
|
|
Приготовление раствора краски оранжевая Г:
К 100 мл 0,5%-ного спиртового раствора оранжевой краски Г добавляют 0,015 г фосфорно-вольфрамовой кислоты.
Приготовление составной краски (ЕА-36):
45 мл 0,5%-ного спиртового раствора светлой зеленой, 10 мл 0,5%-ного спиртового раствора бисмаркбраун, 45 мл 0,5%-ного спиртового раствора эозина желтоватого (водо - и спирторастворимого), 0,2 г фосфорновольфрамовой кислоты, капля насыщенного водного раствора углекислого лития.
Ход окраски:
Мазки после фиксации проводят последовательно через сосуды, содержащие 80, 70 и 50° спирты и дистиллированную воду. Затем 6 мин гематоксилином Гарриса, осторожно споласкивают дистиллированной водой и погружают (6 раз) в 0,25%-ный раствор соляной кислоты. Далее на 6 минут кладут в сосуд с проточной водопроводной водой и обмывают дистиллированной водой. Затем проводят через 50, 70, 80 и 95° спирты. Обезвоженные таким образом препараты окрашивают в течение 1,5 мин краской оранжевой Г, споласкивают в двух сменах 95° спирта и красят в течение 1,5 мин составной краской (ЕА-36). Мазки отмывают от избытка краски в трех сменах 95° спирта. Далее препараты просветляют проведением через абсолютный спирт, через смесь абсолютного спирта и ксилола в равных объемах и, наконец, через ксилол, после чего заключают в канадский бальзам.
|
|
|
К полихромным методам окраски так же относят метод Шорра (или его модификацию (1963) и др.), позволяющий дифференцировать клетки на эозинофильные (красные) и базофильные (синие), и монохромные методы (окраска гематоксилином и эозином или гематоксилином и фуксином). Фиксация препарата производилась в метиловом спирте (15 минут). Окрашивание препаратов производилось гематоксилином-эозином. Фиксированные мазки окрашивались водным раствором гематоксилина до получения бледно-фиолетового окрашивания (7–10 минут). После промывания проточной водой мазки вновь окрашивались 1%-ным водным раствором эозина в течение 0,5 мин, промывались проточной водой и высушивались. При полихромном методе поверхностные клетки окрашиваются в красный или сине-зеленый цвет, промежуточные и парабазальные – в сине-зеленый, базальные – в темно-синий. Цитохимические методы основаны на специфической химической цветной реакции между химическим реактивом и определённым компонентом клетки для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ).
При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски (средний цитохимический коэффициент - СЦК). В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (–), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы. Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермента не выявлена (–), в 35 – специфическая окраска была слабой (+) и в 5 – более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах в таком случае составит (60х0)+(35х1)+(5х2)/100=0+35+10/100=0,45 ед.
Дата добавления: 2021-01-21; просмотров: 193; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!