ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

 

Традиционные методы селекции и методика слияния прото­пластов позволяют получать новые генотипы растений, и в этом смысле указанные методы можно отнести к генно-инженерным. Однако новые генетические комбинации, возникающие случай­ным образом, требуют много труда, времени и терпения, чтобы получить желаемое изменение фенотипа, как результат реорга­низации генетического материала. Кроме того, скрещивание происходит между ограниченным числом генотипов, и общий ге­нофонд оказывается ограниченным. В этом генофонде может во­обще не содержаться генов, которые могли бы улучшить сорт.

Технология рекомбинантных ДНК в принципе позволяет вы­делять в чистом виде и в достаточном количестве любой ген и при наличии подходящего вектора или иным способом встраи­вать этот ген (или гены) в состав хромосомной ДНК и добиться его экспрессии. Мы будем рассматривать генетическую инже­нерию в плане использования технологии рекомбинантных ДНК для создания новых генотипов, а значит, и форм расте­ний. Применение этой технологии делает поиск целенаправлен­ным и значительно расширяет возможности манипулирования генетическим аппаратом при сокращении времени получения новых форм растений.

Важным преимуществом растений по сравнению с живот­ными является то обстоятельство, что клетки растений в куль­туре обладают свойством тотипотентности, т. е. при наличии

 

7-177193

 

 

подходящих условий по крайней мере часть клеток может раз­виться в целое растение. Таким же свойством обладают и рас­тительные протопласты — клетки, лишенные целллюлозной оболочки.

Какие же гены нужно клонировать и вводить в растения, чтобы их улучшить? Наиболее целесообразно приобретение сле­дующих признаков: устойчивость к холоду, засухе, повышенной засоленности почвы, т. е. к стрессовым воздействиям внешней среды, также полезна устойчивость к вредителям, гербицидам и пестицидам, резистентность к болезням, скороспелость и др. Оп­ределение и выделение генов, ответственных за эти признаки,— задача чрезвычайно трудная. Дело осложняется еще и тем, что геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих.

Другая проблема связана с введением и адекватной экс­прессией генов. Здесь основная задача связана с созданием векторных молекул и с разработкой метода прямого переноса генов. Сюда же входит задача отбора трансформированных клеток и обеспечение стабильного наследования приобретенно­го признака. Решение этих задач существенно облегчается в связи с обнаружением природного генного вектора, возникшего в результате эволюции почвенных бактерий.

Наконец, третья проблема касается регенерации трансфор­мированных клеток или протопластов в целое фертильное рас­тение. Дело в том, что регенерацию удалось получить для дву­дольных растений. Только для некоторых хозяйственно полез­ных растений удалось наладить методический цикл от протопласта до растения. Это картофель, люцерна, томаты, морковь, табак, капуста и др. Что же касается злаков, то реге­нерацию их клеток пока надежно осуществить не удалось.

Мы перечислили основные проблемы, которые «лежат на поверхности», и трудно предсказать, какое множество препят­ствий встанет на пути исследователей.

Векторы на основе Ті-плазмид. Некоторые виды бактерий из группы агробактерий (Agrobacteria) могут заражать расте­ния и вызывать при этом образование опухолей — корончатых галлов. Опухоли состоят из недифференцированных клеток, ин­тенсивно делящихся и растущих в месте заражения. Почти все двудольные растения чувствительны к бактериям, а злаки и другие однодольные — нет. При культивировании клетки опухо­ли могут расти в отсутствие гормонов, необходимых для роста нормальных растительных клеток. Если убить все бактерии ан­тибиотиком, то клетки корончатых галлов сохраняют трансфор­мированный фенотип. На примере одного из самых сильных ин­дукторов опухолей — Agrobacteriumtumefaciense— было пока-

 

194

 

зано, что собственно опухолеродным агентом является плазмида, часть которой встречается в хромосомах клеток рас­тения (рис. 3.17).

После трансформации клетки растения начинают синтези­ровать необычные аминокислоты — опины, которые использу­ются бактериями в качестве источника азота и углерода. Та­ким образом образование опухоли сопровождается перестрой­кой метаболизма клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий.

Плазмиды, вызывающие опухоли, называются Ті-плазмидами (от англ. tumorinducing — инициирующие опухоль). Это кольцевые молекулы длиной около 200 кб (3—5% от размера хромосомы агробактерий). В бактериальных клетках они репли­цируются автономно. Ті-плазмиды различают по типу синтези­руемого опина. Чаще всего встречаются плазмиды, кодирующие нопалин или октопин, причем клетка может содержать только один тип плазмиды: либо октопиновую, либо нопалиновую.

Генетические исследования показали, что гены, ответствен­ные за индукцию опухоли, синтез опинов и подавление дифференцировки, расположены близко друг от друга и входят в со­став Ті-области плазмиды, которая встраивается в хромосому клетки при инфекции. Т-сегмент имеет длину около 20 кб (10% Ті-плазмиды) и встраиваются в различные, по-видимому неспе­цифичные, области хромосомы. На Т-области картировано семь генов, каждый из которых регулируется собственным промото­ром. Эти гены отвечают за синтез опина и за подавление дифференцировки клеток (подавление образования корней и побе­гов). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и

195

 

интеграцию Т-ДНК, находятся не в Т-ДНК, а в области виру­лентности (vir-область) (рис. 3.18).

Уникальные биологические свойства Ті-плазмиды делают его идеальным вектором, естественным агентом для переноса генов. Она имеет широкий круг хозяев, встраивает ДНК. в со­став хромосомы, где она реплицируется и большая ее часть транслируется с образованием белка. Существенно также, что границы Т-ДНК обозначены прямыми повторяющимися после­довательностями длиной 25 нуклеотидных пар, и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-ДНК и перенесена в растительную клетку. Поскольку гены в составе К-ДНК имеют промоторы, то под их контроль можно поставить чужеродные гены. Однако из-за больших размеров манипуля­ции с Ті-плазмидой затруднены, вставить ген в плазмиду тра­диционными методами не представляется возможным.

Промежуточный и бинарный векторы. Один из способов введения чужеродной ДНК заключается в использовании про­межуточного вектора. Смысл подхода состоит в следующем (рис. 3.19). Сначала Т-ДНК с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды и вставляют в вектор для клонирования в Е. coli(например, pBR 322). Плазмиду с Т-ДНК размножают и, ис­пользуя стандартные методы, встраивают чужеродный ген внутрь Т-области и вновь размножают с уже вставленным ге­ном. Затем полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки А. tumefacien . ee , несущие полную Ті-плазмиду. В резуль­тате двойного кроссинговера (гомологичной рекомбинации) ме­жду гомологичными районами Т-ДНК часть рекомбинантной плазмиды, которая содержит чужеродный ген, включится в Ті-плазмиду, заместив в ней нормальную Т-ДНК. Наконец, бактериями, имеющими Ті-плазмиду со встроенными генами, заражают растения и в результате получают клетки корончато­го галла, которые будут содержать Т-область со встроенным в нее чужеродным геном.

 

 

196

 

 

Другой распростра­ненный метод введения чужеродной генетиче­ской информации за­ключается в использова­нии бинарных векторов. Оказалось, что для за­ражения и трансформа­ции растительных кле­ток агробактериями необходима vir-область, ответственная за пере­нос ДНК и прямые по­вторы, ограничивающие Т-район. Более того, vir-область и ДНК, со­держащая на концах по­граничные повторы Т-района, могут нахо­диться в разных плазмидах. Бактерии, содер­жащие Ті-плазмиду с vir-областью и другую плазмиду, в которой в Т-ДНК встроены любые гены, обеспечивают ин­теграцию последней в геном растения. Гомоло­гичная рекомбинация для этого не требуется.

Однако полученные клетки не будут способны к регенерации, поскольку в них подавлена дифференцировка. Если же в гены, блокирующие дифференцировку, ввести мутации или вырезать их из Т-ДНК, трансформированные клетки обретут способность к регенерации. Так, ген алкогольдигидрогеназы (АДГ) дрожжей был встроен в область клонированной Т-ДНК, ответственную за подавление дифференцировки. Этой Т-ДНК трансформировали клетки табака, из которых затем удалось регенерировать целые растения, содержащие в геноме многочисленные копии АДГ —Т-ДНК. Растения были фертильными и в клетках потом­ства также содержались копии химерной ДНК (рис. 3.20).

В общем случае для конструирования безвредного (для ре­генерации) вектора из Т-ДНК нужно удалить все ее собствен­ные гены, оставив сигнальные прямые повторы и чужеродную

 

197

 

ДНК. Для того чтобы эта ДНК экспрессировалась в растительных клетках, конструируют составной ген, в котором регуляторная об­ласть с промотором взята от одно­го из генов Т-области (например, гена нопалинсинтетазы, ответст­венного за синтез нопалина), а структурная часть представлена структурной частью гена, который нужно ввести в растение. Показа­но, что такие составные гены, бу­дучи интегрированными в геном растения, хорошо экспрессируются под контролем нового промотора. Таким образом, проблема экспрес­сии генов в трансформированных растениях в принципе решена.

Еще одно семейство плазмид А. rhizogenesвызывает усиленное об­разование корешков при зараже­нии растений. Эти плазмиды на­званы Ri-плазмидами (от англ. rootinducing—индуцирующий корни). Корешки быстро растут в культуре, подобно ткани коронча­того галла, причем отсутствие бак­терий не влияет на их рост. Выяс­нилось, что клетки корешков так­же содержат опины, а их геномы содержат по нескольку копий Т-ДНК. Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ті-плазмид тем, что они являются естественными безвредными векторами, т. е. после трансформации раститель­ные клетки способны регенерировать в здоровые плодовитые растения. В настоящее время эти плазмиды рассматриваются как более перспективные векторы.

Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК- Лишь 1—2% от чис­ла вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содер-жащим. Именно они наиболее удобны для использования в тех­нологии рекомбинантных ДНК и рассматриваются главными кандидатами на роль векторов для переноса генов в растения.

 

198

Наиболее перспективным в этом отношении и поэтому луч­ше изученным является вирус мозаики цветной капусты CaMV (cauliflowermozaicvirus), поражающий в основном растения семейства крестоцветных. Частицы этого вируса имеют диа­метр около 50 нм и содержат кольцевую ДНК длиной 8 кб. С вирионной-ДНК транскрибируются не менее 80% информации, и, по крайней мере, некоторые из образовавшихся РНК явля­ются матрицами для синтеза белков.

Небольшой размер генома CaMV дает возможность манипу­лировать invitro с вирусной ДНК, как с бактериальной плазмидой, и затем вводить ее в растения путем втирания в листья. Инфицирование небольшого числа клеток приводит к зараже­нию всего растения, так как вирус быстро распространяется, передаваясь от клетки к клетке. При использовании 1—5 мкг клонированной ДНК для инфицирования одного растения по­средством механической инокуляции достигается почти 100%-ная эффективность инфекции.

Для клонирования ДНК CaMV в Е. coliиспользуют плазмидные векторы Е. coli , например, pBR 322. После обработки соответствующими рестриктазами ДНК CaMV и pBR 322 и лигирования образуется гибридная плазмида, способная к ампли­фикации в Е. coli .

Прямая интеграция ДНК CaMV в геном хозяина после ин­фекции не показана. Разработан методический прием — агро-инфекция, позволяющий осуществить прямое встраивание ви­русной ДНК после инокуляции. Для этого геном CaMV встраи­вается в Т-ДНК и в ее составе интегрирует в ядерный геном различных растений.

К преимуществам векторных систем на основе вирусов можно отнести следующие: малый размер генома, что дает воз­можность легко манипулировать вирусной ДНК; высокая ко-пийность вирусной ДНК в клетках зараженных растений (до 50 000 на клетку); наличие сильных промоторов, которые могут обеспечить эффективную экспрессию чужеродных генов.

Среди недостатков следует отметить небольшую емкость вектора (менее 800 н. п.) и ограниченный круг хозяев — кресто­цветные. Емкость вектора можно увеличить до 800—1000 н. п., если инфицировать вирусом растительные протопласты. В этом случае инфекция не передается от клетки к клетке и нет необ­ходимости в упаковке ДНК в частицы. Таким образом, часть вирусного генома, ответственная за упаковку в вирусные час­тицы, может быть удалена и замещена чужеродной ДНК.

В заключение следует отметить, что сильные вирусные про­моторы могут использоваться для экспрессии чужеродных ге-

 

 

199

нов в других векторных системах. Например, промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты является сильным про­мотором, кроме того, он не проявляет тканеспецифичности экс­прессии и активен не только в клетках крестоцветных, но и в клетках других семейств.

Использование хлоропластной и митохондриальной ДНК растений для создания челночных векторов. Геном хлоропла­ста состоит из кольцевых молекул ДНК длиной 120—140 кб. Внутри хлоропластов одного вида содержится до нескольких десятков таких кольцевых молекул, близких по нуклеотидной последовательности. Клетка содержит до нескольких десятков хлоропластов, и, таким образом, общее число кольцевых моле­кул составляет несколько сот копий на клетку. В состав коль­цевых молекул входят гены рибосомальных и транспортных РНК, а также гены, продукты которых необходимы для функ­ционирования хлоропластов.

Репликация и транскрипция хлоропластного генома осуще­ствляется автономно. Последнее обстоятельство дает возмож­ность использовать хлоропластную ДНК в качестве вектора. Если же «сшить» бактериальную плазмиду с фрагментом ДНК хлоропласта, содержащим участки начала репликации и участ­ки инициации и терминации транскрипции, то можно получить челночный вектор. Такой вектор способен реплицироваться в прокариотических клетках, а в клетках эукариот не только реп­лицироваться, но и экспрессировать чужеродную генетическую информацию. Такие векторы будут функционировать как эпи-сомы, т. е. автономно от хромосомы. Для конструирования чел­ночных векторов растений могут быть также использованы кольцевые молекулы митохондриальной ДНК, длина которых варьирует в широких пределах — от 1 до 50 кб.

Кольцевые молекулы ДНК также обнаружены в ядре и ци­топлазме растительных клеток. Происхождение их еще не ясно. Это могут быть амплифицированные гены или транспозоно-по-добные элементы. Эти кольцевые молекулы интенсивно изуча­ются и, по-видимому, могут быть использованы для создания векторов.

Методы прямого переноса генов в растение. Трансфор­мациярастительныхпротопластов.При обра­ботке целлюлозной клеточной стенки растения ферментом цел-люлазой, выделенной из грибов, образуется клетка, лишенная оболочки, или протопласт. Разработаны методы прямой транс­формации протопластов с помощью ДНК. Наибольшей эффек­тивности трансформации (10" ) удалось достигнуть комбинаци­ей методики кальциевой преципитации ДНК с методикой слия-

 

200

 

ния протопластов. Хотя частота трансформации значительно ниже, чем, например, частота переноса ДНК при совместном культивировании с A . tumefaciens , метод прямого переноса об­ладает рядом преимуществ.

Донорная ДНК может не содержать специальных биологи­ческих сигналов и функций трансформации (пограничных об­ластей Т-ДНК и vir-области, см. с. 196). Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор, несу­щий чужеродный ген. При этом, гибридный ген стабильно ин­тегрирует в ядерную ДНК растения и экспрессируется (при наличии соответствующих регуляторных областей).

Методкокультивации.Этот метод может рассмат­риваться как индукция опухолей в искусственных условиях. Сначала получают культуру протопластов, затем на начальной стадии ее роста, когда протопласты только что регенерировали клеточную стенку и начали делиться, культуру заражают агро-бактериями. Период кокультивации, в течение которого прото­пласты агрегируют с бактериями, составляет 32 ч.

Модификация метода кокультивации протопластов с А. tumefacienseпозволила повысить его эффективность (до 10^-1) и сократить время получения трансформантов до трех недель. При этом в качестве селективного признака использовали то обстоятельство, что только трансформированные клетки способ­ны расти без добавок фитогормонов.

МикроинъекцииДНК.В ряде экспериментов было показано, что метод микроинъекций может успешно применять­ся для трансформации растительных клеток аналогично микро­инъекциям животных клеток (см. с. 189). Это стало возможным после преодоления ряда технических трудностей, в частности, разработки метода получения протопластов для инъекций пу­тем прикрепления их к стеклам полилизином.

Для микроинъекций применяется микроигла с внешним диаметром 2 мкм и внутренним 1 —1,25 мкм. Объем инъекций в каждый протопласт составляет (1 —10)* 10^-4 мл, при концентра­ции ДНК — 0,1 —1,0 мкг/мкл.

Трансформация растительных клеток происходит с эффек­тивностью 10—20%, независимо от типа вектора. В этом смыс­ле метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Важно также, что трансформация не является видоспецифич-ной, и ее можно применять, когда другие способы переноса ге­нов невозможны (например, агробактерии имеют ограниченный круг хозяев). Многие исследователи полагают, что микроинъек­ции пригодны для всех типов растений.

201

Э л е к т р операция.Этот метод основан на том, что им­пульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницае­мость биомембран. Для растительных протопластов процедура электропорации оказалась очень эффективной. Метод состоит в следующем: на растительные протопласты в высоких концентра­циях, находящиеся в среде электропорации, содержащей ДНК, действуют высоковольтным импульсом. В результате молекулы ДНК поглощаются клетками через поры в клеточной мембране. Далее после разведения протопласты высеваются на соответст­вующую среду для проращивания. Эффективность переноса оп­ределяется через 24—48 ч после электрошока (напряжение 200—350 В, длительность импульса 54 мс).

При переносе электропорацией удалось получить экспрес­сию чужеродных генов. Она показана на двух типах промото­ров— NOS (нопалинсинтетазного) промотора Ті-плазмиды А. tumefaciens , под контролем которого экспрессировалась хлорамфениколацетилтрансфереза (CAT), и З5S-поромотора виру­са CaMV.

Упаковкав липосомы. Это один из методов, ис­пользуемых для защиты экзогенного генетического материала, который вводится в протопласты растений, от разрушающего действия нуклеаз.

Экзогенный генетический материал, вводимый в протопла­сты растений, нуждается в надежной защите от действия фер­ментов — нуклеаз, которые разрушают нуклеиновые кислоты. Один из методических подходов заключается в использовании липосом. Липосомы — это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. Их можно получить в ре­зультате резкого встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фос-фатидилсерина и холестерина, наиболее пригодны для введе­ния ДНК в клетки животных и растений.

С помощью липосом в протопласты растений были введены РНК вируса табачной мозаики, ДНК Ті-плазмиды А. tumefaciens , а также целые метафазные хромосомы. Особенно важно для системы переноса в протопласты растений то, что липосомы надежно защищают молекулы нуклеиновых кислот от действия нуклеза, присутствующих в значительных количе­ствах вне клеток. К преимуществам систем переноса с помо­щью липосом можно отнести их низкую токсичность по отноше­нию к клеткам и возможность их использования на множестве растений, клетки которых способны утилизировать липосомы.

В заключение следует подчеркнуть, что дальнейшее совер­шенствование методов прямого переноса генов в существенной

202

степени зависит от роста эффективности трансформации кле­ток. К настоящему времени эффективность прямого переноса генов в протопласты повысилась в 100 раз по сравнению со временем первых сообщений. Без селекции 2% всех колоний подвергаются трансформации.

Метод биологической баллистики. Метод биологической баллистики (биолистики) является одним из самых эффектив­ных на сегодняшний день методов трансформации однодоль­ных. В качестве исходного материала для трансформации бе­рется суспензионная культура, каллусная ткань или 4—5-днев­ные культивируемые незрелые зародыши однодольных.

Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частич­ки вольфрама, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК век­тора, содержащего необходимую для трансформирования ген­ную конструкцию. Вольфрамовые частички, несущие ДНК, на­носятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10—15 см. В пушке ва­куумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной ско­ростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления вольфрамовых частиц, в то время как в зоне 0,6—1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осто­рожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.

С помощью биолистической пушки были протрансформиро-ваны однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшени­ца, ячмень. При этом были получены стабильные расте­ния-трансформанты.

Кроме успехов в получении трансгенных однодольных, био-листическая трансформация применяется для прямого перено­са ДНК в эмбриогенную пыльцу и дальнейшего быстрого полу­чения трансгенных дигаплоидных растений, которые являются важным этапом в селекционной работе. В настоящее время этим методом была проведена трансформация растений табака и после регенерации гаплоидных растений получены стабиль­ные трансформанты.

 

 

203

---

Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 756; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!