ВВЕДЕНИЕ ГЕНОВ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

 

Один из наиболее эффективных методов введения чужерод­ного гена млекопитающего состоит в том, что этот ген, предва­рительно клонированный в бактериальных клетках, переносят не в микроорганизмы, а в клетки млекопитающего, растущие в культуре. Хотя культуры клеток животных, особенно при мас­совом выращивании, гораздо менее экономичны, чем бактери­альные дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом — способностью осуществлять мелкие, но весь­ма важные модификации белков — продуктов гена млекопи­тающих. Например, для эффективного функционирования, ряда белков необходимо присоединение к ним цепочек из молекул углеводов или липидов. Образование и присоединение таких цепочек — обычный процесс для клеток млекопитающих, тогда как бактериальная клетка не способна производить подобные модификации.

Трансфекция. Эффективной трансформации клеток млеко­питающих очищенной ДНК удалось достичь при добавлении к трансформирующей ДНК ионов Са. Предполагают, что клетки преимущественно поглощают частицы кальциевого преципита­та ДНК по механизму фагоцитоза, а затем небольшая часть проникших в клетку молекул стабильно интегрирует с хромосо­мой ДНК. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, необходима разра­ботка метода маркера. Был разработан метод получения кле­ток, дефектных по гену тимидинкиназы (тк-клетки). При транс­формации таких клеток ДНК, содержащей ген тимидинкиназы вируса герпеса, с частотой 1 на 10 (10) клетки приобретали ген тк и могли расти на селективной среде. Анализ методом блот-гибридизации (см. с. 180) подтвердил, что выжившие клет­ки содержали интегрировавший в геном тк-ген вируса герпеса.

Другой селективный маркер — ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ДГФР), можно использовать при трансформации немутантных линий клетки. Благодаря экспрессии многих ко­пий этого гена животная клетка вместе с плазмидой приобре­тает устойчивость к высоким концентрациям ингибитора фер­мента, и, таким образом, трансформантов можно отбирать при высоких концентрациях ингибитора.

Разработано еще два универсальных вектора, содержащих генные маркеры, работающие в нормальных клетках. Они по­строены по одному и тому же принципу: прокариотические генң, определяющие фенотип трансфицированных клеток, соеди­нены с эукариотическими регуляторными сигналами. Первый

188

вектор сконструирован путем встраивания клонированного бак­териального гена, кодирующего ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазу (КГФРТ), между промотором и сайтом полиадени-лирования гена большого Т-антигена вируса SW 40. Наличие этого гена позволяет клеткам расти на селективной среде, со­держащей микрофеноловую кислоту и ксантин (нормальные клетки утилизируют ксантин с очень низкой эффективностью).

Второй вектор состоит из прокариотического гена устойчи­вости к антибиотику неомицину (NeO), встроенного в раннюю область генома SW 40. Эукариотические клетки чувствительны к аналогу неомицина G418^R, который инактивируется продук­том гена (NeO^R). Таким образом трансфицированные клетки приобретают способность расти на среде, содержащей G418 .

Наличие селективных маркеров дает возможность вводить в клетки млекопитающих любой ген, если заранее лигировать его с клонированным селективным маркером. Однако дальнейшие исследования показали, что лигирование вне клетки не обяза­тельно. Клетки, поглощающие селективный ген, вместе с ним поглощают и другую ДНК, имеющуюся в кальциевом преципи­тате. Таким образом, пользуясь методом котрансформации, практически любой клонированный сегмент ДНК можно ввести в культивируемые клетки эукариот, если включить эту ДНК вместе с селективным маркером в состав смеси для образова­ния кальциевого преципитата.

Векторы на основе вирусов. С самого начала работ по трансформации животных клеток вирусы были главными кан­дидатами на роль векторов для введения чужеродной ДНК. Вирусная инфекция может быть намного более эффективным способом введения ДНК в некоторые клетки, чем трансфекция. При вирусной инфекции каждая клетка может получить боль­шое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать так, чтобы она находилась под контролем сильных вирусных промоторов, что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более доступны для исследования.

В последние годы сконструированы многочисленные «чел­ночные» векторы и их рекомбинантные производные, способные к репликации в животной и бактериальной клетках и эффек­тивно экспрессирующие клонируемый ген в животной клетке. Наиболее распространенные векторы состоят из плазмиды pBR 322 и интактного раннего района транскрипции ДНК SW 40, а нужный ген встраивается под контроль промотора поздних ге­нов или дополнительного раннего промотора.

Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих. С появле­нием прибора для  изготовления микропипеток диаметром

 

189

0,1 -—0,5 микрона и микроманипулятора появилась возможность введения чужеродной ДНК в культивируемые клетки путем прямой микроинъекции в ядро. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы и плазмиды pBR 322, были инъецированы в тк-клетки и было показано, что тк-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался.

В принципе, при наличии хорошего оборудования можно за 1 ч инъецировать 500—1000 клеток, причем в лучших экспери­ментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемо­го метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках вве­денного гена не требуется никакого селективного давления.

Помимо создания клеток-продуцентов, трансформация со­матических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно мо­дифицировать генетический аппарат клетки животных, а при необходимости и человека, что имеет огромное значение для ме­дицинской генетики. Кроме того, культуры клеток млекопитаю­щих могут оказаться эффективным источником выделения не­которых вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. Получение таких вакцинных культур клеток осуществимо при помощи техники рекомбинантных ДНК и эффективных векторов экспрессии для клеток млекопи­тающих и человека.

Введение генов в эмбрионы и их экспрессия. В настоящее время можно ввести чужеродную клонированную ДНК не толь­ко в культивируемые клетки, но и в интактные клетки живот­ных и растений. Задача подобных экспериментов заключается не в создании клеток-продуцентов, но в изменении генома клет­ки, в результате чего клетка приобретает новые свойства. Если вводить ДНК в клетки многоклеточного организма, то резуль­татом трансформации будет изменение свойств лишь неболь­шого числа клеток, которые приобрели новый ген или гены. Следовательно, для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток, которые перенесут новые свой­ства потомкам. У растений и животных целесообразно изме­нять такие свойства, как скорость роста, устойчивость к забо­леваниям, способность адаптироваться к новым внешним усло­виям.

Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений. От работы с довольно крупными яйцами амфибий перешли к изучению яйцеклеток и эмбрионов мыши, которая представляет наиболее

 

 

190

изученное в генетическом отношении млекопитающее. Микро­инъекцию клонированных генов производят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. Чаще выбирают мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры больше. После инъекции яйцеклетку не­медленно имплантируют в яйцевод приемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Таким образом были инъекцированы гены интерферона и ин­сулина человека, ген глобина кролика, ген тимидинкиназы виру­са простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Число мо­лекул, вводимое за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000, а их размер — от 5 до 50 кб. Выживает обычно 10—30% яйце­клеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яй­цеклеток, варьируется от нескольких до 40%. Таким образом, реальная эффективность составляет около 10%.

Интеграция чужеродных генов неспецифична по отношению к хромосомам, а число копий чужеродного гена может разли­чаться от нескольких штук до 100 и более. Эти гены образуют группу тандемных повторов, объединенных по типу «голова к хвосту». Чужеродная ДНК после инъекции была обнаружена как в соматических, так и в половых клетках. Это означает, что интеграция проходит на самых ранних стадиях развития зиго­ты. В нескольких случаях гетерологичная ДНК наследовалась в трех поколениях мышей, что свидетельствует о стабильной интеграции. Интегрировавшая в половые клетки ДНК переда­ется как менделевский ген.

Установлено, что уровень экспрессии чужеродного гена за­висит от места интеграции ДНК с хромосомами и от степени ее метилирования, а также от дифференцировки тканей. В некото­рых случаях удалось получить тканеспецифическую экспрес­сию. Важно отметить, что специфические чужеродные гены можно встраивать в геном клетки таким образом, что они под­чиняются нормальным регуляторным сигналам.

Примечательными в этом отношении являются результаты экспериментов с гибридным геном, состоящим из 5-концевого регуляторного участка гена металлотионина (МТ) мыши и по­следовательности, кодирующей гормон роста (GH) крысы. Бы­ла получена гибридная плазмида, pMG Н, состоящая из плаз­миды pBR 322, к которой была пришита конструкция, состоя­щая из регуляторной зоны гена МТ и структурной части гена GH. При инъекции использовали линейную форму плазмиды размером 5 кб, предполагая, что линейные фрагменты со сво­бодными концами встраиваются в клеточную ДНК эффектив-

191

нее, чем кольцевая плазмида. В каждый пронуклеус было вве­дено по 600 копий гибридного гена, и в матки приемных мате­рей имплантировано 170 оплодотворенных яйцеклеток, из которых развилась 21 мышь. У семи из них методом блот-гибридизации были обнаружены множественные копии гена MGH. Шесть из этих мышей росли быстрее, чем нормальные живот­ные того же помета. Содержание гормонов у них в 100—300 раз превышало его содержание в организме контрольных мы­шей. Таким образом, интеграция и экспрессия гибридного гена обеспечивает ускоренный рост и большой размер этих мышей. Эксперименты такого рода в перспективе могут найти прямое практическое применение, и не за горами выведение пород ско­та с измененными ростовыми показателями.

Однако сегодня метод введения генов в эмбриональные клетки имеет ограничения. Не всегда удается встроить чуже­родную ДНК в заданный участок хромосомы. Разработанные методические приемы пока не позволяют заменить имеющийся в геноме ген, вытесняя его. Не всегда удается подчинить новый ген системе регуляции организма. Преодолев эти трудности, можно будет серьезно говорить о генотерапии человека, цель которой — лечение 2000 генетических заболеваний, вызванных отсутствием или дефектами генов.

Клонирование животных. Под клоном обычно подразумева­ется популяция клеток или организмов — потомков одной клет­ки или организмов, полученных неполовым путем. Таким обра­зом, все особи в клоне имеют идентичный набор генов. Молеку­лярные биологи обычно имеют дело с клонами бактерий или других микроорганизмов, клетками культуры тканей, а послед­нее время — и с клонами молекул ДНК.

С другой стороны, садоводы и селекционеры, размножающие растения вегетативным путем, получают клоны высших организ­мов. У многих дикорастущих видов растений вегетативное раз­множение играет большую роль, чем половое. Высшие животные в природе размножаются только половым путем, и для клониро­вания животных нужно заменить ядро оплодотворенной яйце­клетки ядром, взятым от другой особи. Собственное ядро удаля­ется или инактивируется хирургически. Оказалось, что тотипо-тентность (возможность развиваться во взрослую особь) сохраняют ядра из клеток очень ранних эмбрионов. По мере развития и дифференцировки донорных клеток их ядра утрачи­вают способность заменять ядро оплодотворенной яйцеклетки.

В 1952 г. удалось впервые пересадить ядра из яйцеклеток лягушек. Практический интерес представляет размножение

 

192

млекопитающих бесполым способом. Для этого необходимо взять от беременных самок ядра тотипотентных клеток эмбрио­нов. Сначала получают бластоцисты и из них с помощью мик­ропипетки удаляют ядра и вводят в оплодотворенные клетки других мышей. Затем удаляют геном (т. е. мужской и женский пронуклеусы) яйцеклетки-реципиента. Полученные в результа­те трансплантации эмбрионы культивируют до стадии бласто­цисты и имплантируют в клетки приемных матерей. Выполне­ние такой программы на млекопитающих сталкивается с мно­жеством технических проблем, поскольку работать с яйцеклет­ками млекопитающих исключительно сложно. В 1981 г. была описана серия таких экспериментов на мышах, но ее результа­ты пока не получили независимого подтверждения. Только ко­гда эффективность и воспроизводимость данного метода удаст­ся повысить, его можно будет использовать в селекции живот­ных и в экспериментах по изучению механизмов индивидуаль­ного развития млекопитающих.

 

 

---

Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 243; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!