Молекулярные механизмы рекомбинации.
С момента открытия Т.Г. Морганом в 20‑х годах процесса обмена участками хромосом (кроссинговера) исследователи не раз пытались представить механизм, объясняющий последовательность протекающих при рекомбинации реакций. Все гипотезы, высказанные и в рамках классической и в современной молекулярной генетике, можно разделить на два класса: обменные и контактные гипотезы. Согласно представлениям одних исследователей, хромосомы сначала претерпевали разрыв нитей, а затем происходило замыкание концов одной нити с концами нити от другой хромосомы; согласно другим гипотезам, процесс начинался с пространственного примыкания хромосом в каких‑то участках, после чего в этих точках происходили разрыв нитей и «неправильное» их соединение. Поскольку в настоящее время установлено, что стабильность хромосом высших организмов в большой степени зависит от непрерывности молекул ДНК, входящих в хромосомы, стало возможным, по аналогии с тем, как это делалось в микробной генетике, перенести вопрос о молекулярных основах процесса рекомбинации в сферу изучения поведения молекул ДНК, не затрагивая вопроса о поведении молекул хромосомных белков, окружающих ДНК (Г. Вайтхауз, 1965; Р. Холлидей, 1970).
В настоящее время окончательной схемы, объясняющей механизм рекомбинации, не существует. Для иллюстрации направления поисков такого механизма можно привести две схемы – Г. Вайтхауза и П. Говард‑Фландерса, получившие наибольшее признание.
|
|
|
В механизме, предложенном Вайтхаузом (1963–1965), рекомбинация начинается с возникновения однонитевых разрывов в молекулах ДНК (этап 2). Затем однонитевые участки ДНК отходят от неповрежденных нитей ДНК (этап 3), создавая условия для начала рекомбинационного синтеза ДНК. Этот синтез происходит по матрице неразрезанной однонитевой ДНК (этап 4). Поскольку синтезированные участки комплементарны к противоположным им участкам, ранее отошедшим по местам разрывов, то, естественно, что между ними может произойти спаривание, в результате чего образуются участки гибридных молекул (этап 5): вновь синтезированный участок одной хромосомы соединится со старым участком другой хромосомы, ранее отошедшим от нее, а участок, вновь синтезированный на второй хромосоме, соединится со старым участком первой хромосомы. Тем самым будет положено начало образованию рекомбинантных молекул, но сами хромосомы еще будут соединены перекрестно. Чтобы отсоединить их, нужно разрезать оставшиеся пока неповрежденными старые нити обеих молекул (этап 6). Воссоединение участков в новом порядке завершит образование рекомбинантных молекул.
|
|
|
По сути дела, тот же механизм учитывается в схеме П. Говарда Фландерса (1965, 1966). Эта схема также весьма сходна со схемой том новой репарации. Как и в случае последней, при рекомбинации долги мы сначала осуществиться разрывы сахаро‑фосфатного остова молекул (этап 1), затем разрушение однонитевых участков (этап 2). Следующим, третьим этапом рекомбинации должно быть комплементарно спаривание молекул на ограниченном участке (зона синапса). Затем и образовавшейся молекуле (гетеродуплексе), соединяющей фрагменты обоих рекомбинирующих молекул, должна произойти застройка однонитевых участков (этап 4) и, наконец, их воссоединение (этап 5).
До сих пор не ясно, что является причиной возникновения однонитевых разрывов в двунитевых молекулах ДНК. По нашему мнению, начало такому разрыву могут положить нарушения или изменения оснований в структуре ДНК, возникающие либо под действием квантов лучистой энергии, либо различных химических агентов как внутриклеточной, так и внешней по отношению к клетке природы. Эта точка зрения[191], высказанная нами в 1969 г., получила в настоящее время экспериментальное подтверждение в опытах на микроорганизмах.
Важным и пока еще также не получившим должного разрешения является вопрос о том, как происходит объединение нитей друг с другом во время рекомбинации. В настоящее время в результате исследования Э. Баутца (1967–1971) в США и Ю.П. Винецкого (1970) в СССР установлено, что зона синапса захватывает не менее 500‑1000 нуклеотидов.
|
|
|
Мутации и генетический код.
В таблице кода указаны три кодона УАА, УАГ и УГА, которые не кодируют никаких аминокислот и потому называются нонсенс‑кодонами, или терминирующими кодонами. Открытие этих кодонов было важным шагом в понимании механизма синтеза белка. Выше упоминалось о том, что иРНК может быть считана сразу с нескольких цистронов. Возник вопрос о том, каким образом при синтезе белков с такой полицистропной иРНК происходит обрыв чтения на конце одного цистрона и начинается чтение следующего цистрона. Обнаружение нонсенс‑кодонов дало ответ на первый вопрос. К тому же стало понятным поведение некоторых мутантов, выделенных до этого у вирусов и бактерий. Это касается прежде всего так называемых амбер‑мутантов фагов, которые могли размножаться в клетках одних линий бактерий и оказывались не способными к этому в других. Анализ этих мутантов показал, что в тех линиях бактерий, где развитие амбер‑мутантов фагов не происходило, дефект был связан с неполным прочтением мутировавших генов. Под их контролем формировались не целые молекулы белка, а обрывки полипептидной цепи одинаковой длины. Такие амбер‑мутанты удалось выделить практически для всех генов фага Т4 (Р. Эпштейн, 1963; Р Эдгар Г. Денхардт и Р. Эпштейн, 1964; Р. Эдгар, 1965, и др.), а также для гена щелочной фосфатазы кишечной палочки (лаборатория А. Герена в США, 1962 1964), а сам метод изучения амбер‑мутантов оказал большую услугу ученым, позволив описать неизвестные ранее гены. Весьма примечательным было и то, что свойства амбер‑мутантов фагов проявлялись только при заражении такими фагами определенных видок бактерий. При заражении же других видов дефект исправлялся, и синтезировались молекулы белка нормальной длины, хотя нередко и с измененными свойствами.
|
|
|
Последовательность реакций при матричном биосинтезе белков (по А.С. Спирину Л.П. Гавриловой, 1963).
I – свободные субъединицы рибосом, отдельные транспортные РНК и аминоацил‑тРНК в клетках перед началом синтеза белка; II – присоединение индивидуальной молекулы иРНК к малой субъединице рибосомы; III – присоединение большой субъединицы рибосомы к малой субъединице, заряженной иРНК. Этот комплекс в нормальных условиях остается стабильным до конца считывания матрицы иРНК; IV – присоединение к малой субъединице рибосомы аминоацил‑тРНК (первой всегда присоединяется формилметиониновая аминоацил‑тРНК); V – конец аа‑тРНК, несущий аминокислоту, присоединяется к большой субъединице рибосомы; VI – конец иРНК с присоединенной к нему формилметиониновой тРНК «вдвигается» в большую субъединицу рибосомы; VII – начало следующего цикла в работе рибосомы. Снова к малой субъединице присоединяется аа‑тРНК, соответствующая очередному кодону иРНК, вошедшему в рибосому; VIII – конец аа‑тРНК, несущий аминокислоту, присоединяется к большой субъединице. Теперь две аминокислоты (формилметиониновая и очередная, вошедшая в рибосому) оказываются в пространственной близости; IX – формилметионин перебрасывается на очередную аминокислоту: начался синтез полипептидной цепи; X – транспортная РНК, освободившаяся от аминокислоты формилметионина, покидает рибосому, уступая место для очередного акта «протягивании» иРНК в рибосому; XI – нить информационной РНК продвигается в рибосому еще ни один кодон; XII – начало третьего цикла работы рибосомы: в малую субъединицу вошла новая аминоацил‑тРНК.
Спустя некоторое время удалось выделить так называемые охра мутанты (УАА‑кодон) (С. Бреннер, А. Стреттон и С. Каплан, 1965; М. Вейгерт и А. Герен, 1965) с точно такими же свойствами, а затем и мутанты, у которых обрыв чтения иРНК происходил на кодоне УГА (опал‑кодон), (С. Бреннер, Л. Барнет, Е. Кац и Ф. Крик, 1967), И охра‑мутанты, и мутанты, несшие нонсенс‑кодон УГА, удалось искра вить (супрессировать) в специальных линиях, имевших так называемы о гены‑супрессоры. Все гены‑супрессоры относились к трем классам: амбер‑супрессоры (su‑1, su‑2 и su‑3), восстанавливавшие чтение иРНК, оборванное на амбер‑кодоне; охра‑супрессоры (su‑4 и su‑5), подавлявшие амбер‑ и охра‑кодоны; супрессоры кодона УГА.
Свойство супрессии оказалось связанным с наличием в клетках, несущих супрессорные гены, молекул тРНК, способных узнавать нонсенс‑кодон (Г. Броуди и Ч. Яновский, 1963; Дж. Беквит, 1964; Ч. Яновский, 1966; Г. Корана и др., 1966). Такие мутантные тРНК могут спариваться с нонсенс‑кодоном и таким образом подставлять против них аминокислоту. Анализ подстановок, осуществляемых в супрессорных линиях, показал, что в su‑1‑линиях Е. coli тРНК подставляют против амбер‑кодона серил; в su‑2‑глутамин, в su‑3‑тирозин. В результате обрыва чтения не происходит и формируются полные молекулы белка. Чаще всего они имеют измененные свойства, так как на месте возникшей амбер‑мутации подставляется не та аминокислота, которая была до возникновения амбер‑кодона.
Анализ природы различных мутаций привел к выводу, что все точечные мутации можно разделить на три основных класса:
1. Миссенс‑мутации – мутации, при которых изменяется смысл кодона; в этом случае против него встает неверная аминокислота, и свойства синтезируемого белка меняются. К миссенс‑мутациям относится большинство мутаций, описанных ранее.
2. Нонсенс‑мутации – мутации, при которых возникает нонсенс‑кодон, не кодирующий никаких аминокислот, и на нем обрывается чтение иРНК в рибосомах. К таким нонсенс‑кодонам относится кодон УАГ (амбер‑кодон), кодон УАА (охра‑кодон) и кодон УГА (опал‑кодон).
3. Мутации со сдвигом чтения (или, как их часто называют, мутации сдвига рамки). Эти мутации, изученные Криком и его сотрудниками, позволили доказать трехбуквенность генетического кода. Мутации сдвига чтения возникают после того, как одно или несколько оснований выпадут из молекулы ДНК или внедрятся в нее. Интересно отметить, что сдвиг чтения чаще всего приводит к тому, что в какой‑то точке он заканчивается нонсенс‑кодоном и на нем чтение обрывается вообще.
В последнее время был решен также вопрос, как начинается синтез белка. Мы уже начали описывать этот процесс с того момента, когда к пептидильному центру рибосомы была присоединена молекула строящегося белка и ее дальнейшее наращивание осуществлялось за счет переброса пептидной цепи на аминокислоту, присоединенную к аминоацильному центру. Но в самом начале цистрона, когда пептидильный центр еще не занят, переброска на аминокислоту произойти не может, и, даже если аминоацетил‑тРНК войдет в аминоацильный центр и спарится с кодонами иРНК, сдвига рибосомы по молекуле иРНК не произойдет, ибо первый кодон так и останется пустым.
Эта загадка была решена после открытия особого типа тРНК – так называемой формилметиониновой тРНК. Оказалось, что тРНК метионина может присоединять в результате ферментативной реакции формильную группу к аминокислоте:
Такая формилметиониновая тРНК может присоединиться к двум кодонам АУГ и ГУГ, если только они расположены в начале цепи иРНК. В случае, когда эти кодоны располагаются в середине иРНК, АУГ кодирует метионин, а ГУГ – валин.
Только формилметиониновая тРНК может войти в пептидильный центр рибосомы в начале синтеза. После этого может произойти переброс формилметионина к аминокислоте, присоединенной к аминоацильному центру. В результате все цепи белка начинаются с одной и той же аминокислоты – формилметионина. После того как построенная цепь белка отсоединится от рибосомы, формильная или даже метиониновая группы могут быть ферментативно отщеплены от белка. Таким образом, установлено, что роль иницирующих кодонов играют АУГ и ГУГ, если они располагаются в начальном участке иРНК, а окончание синтеза происходит на нонсенс‑кодонах.
Выяснение природы, строения и функционирования генетического кода явилось огромным достижением современной биологии. Последние успехи в искусственном синтезе белка, нуклеиновых кислот, особенно тех, которые обладают способностью к программированию живых вирусных частиц (работы лаборатории А. Корнберга в Стэнфордском университете, США), позволяют надеяться, что одна из основных проблем современной биологии – искусственный синтез живого с нужными человеку свойствами – будет, в конце концов, разрешена.
Регуляция генной активности.
Функциональная неравнозначность клеток и связанная с ней репрессия и активация генов давно привлекали внимание генетиков, но до последнего времени реальный механизм контроля генной активности оставался неизвестным.
Первые попытки объяснить регуляторную активность генов были связаны с изучением гистонных белков. Еще супруги Стэдман в начале 40‑х годов нашего века высказали мысль, что именно гистоны могут выполнять роль контролеров активности генов. В своих дальнейших работах они получили первые четкие результаты о различиях в химической природе гистонных белков. Обобщая полученные данные, они писали: «Физиологические функции ядер являются, вероятно, следствием присутствия генов, которые они содержат. Они (гены – В.С. ) должны поэтому быть идентичными во всех ядрах данного организма. Если, однако, предположить, что ядра содержат некоторый механизм для подавления активности отдельных генов или групп генов и что этот механизм специфичен для каждого типа клеток, эти трудности исчезнут. Продемонстрированные нами данные, что некоторые основные белки, имеющиеся в клеточных ядрах, являются, несомненно, клеточно‑специфичными, приводят к гипотезе, что одна из физиологических функций заключается в том, чтобы действовать в качестве репрессоров генов»[192]. Эта догадка получила некоторое подтверждение в более поздних работах Дж. Боннера, Ру‑Чи‑Хуанга, Тсьо и других.
Сейчас несколько коллективов исследователей интенсивно работает в этой области. Объем данных, свидетельствующих в пользу этой гипотезы, довольно велик, и можно полагать, что она получит экспериментальное подтверждение.
В то же время все большее количество фактов говорит за то, что регуляция генной активности гораздо более сложный процесс, нежели простое взаимодействие участков генов с молекулами гистонных белков. Об этом в первую очередь свидетельствуют эксперименты по регуляции генов у микроорганизмов (см. также главу 23).
В 1960–1962 гг. в лаборатории Р.Б. Хесина‑Лурье удалось выяснить, что гены фагов начинают считываться не одновременно. Было показано, в частности, что гены фага Т2 можно разделить на ранние, работа которых падает на первые минуты заражения бактериальной клетки, и поздние, начинающие синтезировать иРНК после завершения работы ранних генов.
Четкая координированность действия генов и их своеобразная иерархия была доказана Ф. Жакобом и Ж. Моно (1961). Они показали, что гены бактерий можно условно разделить на два различных типа – структурные гены, дающие информацию о синтезе определенных белков (ферментов), и регуляторные гены, следящие за включением и выключением отдельных генов или их блоков в зависимости от метаболических потребностёй клетки. По представлениям Жакоба и Моно, регуляторные гены должны детерминировать особые молекулы репрессоров, которые, соединяясь с другими генами регуляторной системы – генами‑операторами, управляют работой последних. Тем самым Жакоб и Моно разделили гены регуляторной системы в свою очередь на два типа – гены‑регуляторы и гены‑операторы[193]. В экспериментах с кишечной палочкой они смогли дать принципиальное доказательство существования этих типов. По их данным, ген‑регулятор находится на некотором отдалении от структурных генов, управляемых им, а оператор непосредственно к ним примыкает. Авторы ввели в генетику новое понятие, определив блок структурных генов и управляющий ими оператор, как единую функциональную единицу – оперон.
В последние годы были получены данные о наличии еще одной управляющей ячейки генной активности – промоторе. Оказалось, что по соседству с операторным участком, к которому присоединяется продукт – белковое вещество репрессор, синтезированный на гене‑регуляторе, имеется другой участок, который также следует отнести к членам регуляторной системы генной активности. К этому участку присоединяется молекула фермента РНК‑полимеразы. В этом промоторном участке должно произойти взаимное узнавание уникальной последовательности нуклеотидов в ДНК и специфической конфигурации белка РНК‑полимеразы. От эффективности узнавания будет зависеть осуществление процесса считывания генетической информации с данной последовательности генов оперона, примыкающего к промотору.
Таким образом, схема взаимодействия гена‑регулятора, оператора, промотора, ферментов и рибосом, участвующих в синтезе специфических белков, может быть представлена следующим образом (см. рисунок): на гене‑регуляторе синтезируется вещество белковой природы – репрессор. Последний может воздействовать на операторный участок – выключать (или в некоторых случаях включать) его. Репрессор, кроме того, может взаимодействовать с метаболитами, синтезируемыми под контролем специфических генов. Если метаболиты накопились в достаточном количестве, они, взаимодействуя с репрессором, изменяют его конфигурацию, и он отсоединяется от операторного участка. В том случае, когда оператор находится в состоянии, при котором он и находящиеся под его контролем структурные гены могут функционировать, к промоторному участку присоединяется молекула РНК‑полимеразы, начинающая считывать информацию с данного оперона. Информация считывается в виде последовательности оснований в молекуле иРНК. К концу этой иРНК присоединяется рибосома и, продвигаясь вперед, считывает информацию с иРНК, в результате чего синтезируется полипептидная цепь. Вслед за первой рибосомой присоединяется вторая, за ней третья и т. д. Таким образом осуществляется взаимно скоординированное функционирование частей белок‑синтезирующего аппарата.
Такова картина синтеза белка в бактериальных клетках. В клетках высших организмов она оказалась несколько иной: молекулы иРНК после окончания их синтеза отделяются от матрицы ДНК и скапливаются в цитоплазме. Предполагают, что они переходят в цитоплазму соединенными со специальными белками (возможно, близкими к гистонным белкам).
Схема генетической регуляции белкового синтеза, по Жакобу и Моно (1961).
1 – регуляторный ген; 2 – оператор; 3 – структурный ген А; 4 – структурный ген В; 5 – ДНК; 6 – репрессор; 7 – РНК; 8 – регуляторный метаболит; 9 – аминокислоты; 10 – фермент А; 11 – фермент В.
Схема, поясняющая взаимодействие регуляторных и структурных генов при синтезе белка (по Жакобу и Моно, 1961).
ГР – ген‑регулятор; П – промоторный участок; О – операторный участок; СГ1, СГ2 и СГ3 – первый, второй и третий структурные гены, входящие в данный оперон.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 217; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!