Микросомы, рибосомы, трансляция.
В середине 50‑х годов считалось, что центром белкового синтеза в клетке являются микросомы. Термин микросомы был впервые введен в 1949 г. А. Клодом для обозначения фракции мелких гранул. Позднее выяснилось, что за белковый синтез ответственна не вся фракция микросом, состоящая из мембран и гранул, а только мелкие рибонуклеопротеидные частицы. Эти частицы в 1958 г. были названы Р. Робертсом рибосомами.
Классические исследования бактериальных рибосом были проведены А. Тисьером и Дж. Уотсоном в 1958–1959 гг. Бактериальные рибосомы оказались несколько мельче растительных и животных. Дж. Литлтон (1960), М. Кларк (1964) и Э.Н. Светайло (1966) показали, что рибосомы хлоропластов высших растений и митохондрий принадлежат к бактериальному типу. А. Тисьер и другие (1958) обнаружили, что рибосомы диссоциируют на две неравные субъединицы, содержащие по одной молекуле РНК. В конце 50‑х годов считалось, что каждая молекула рибосомной РНК состоит из нескольких коротких фрагментов. Однако А.С. Спирин в 1960 г. впервые показал, что РНК в субчастицах представлены непрерывной молекулой. Д. Уоллер (1960), разделив рибосомные белки при помощи электрофореза в крахмальном геле, установил, что они весьма гетерогенны. Первое время многие сомневались в данных Уоллера, поскольку казалось, что белок рибосомы должен быть строго гомогенным, как, например, белок ВТМ. В настоящее время в результате исследований Д. Уоллера, Р. Траута, П. Трауба и других биохимиков стало известно, что в состав собственно рибосомных частиц входит более 50 совершенно различных по структуре белков. А.С. Спирину в 1963 г. удалось впервые развернуть рибосомные субчастицы и показать, что рибосомы представляют собой компактно скрученный рибонуклеопротеидный тяж, который в определенных условиях может развертываться. В 1967–1968 гг. М. Номура полностью реконструировал биологически активную субчастицу из рибосомной РНК и белка и даже получил такие рибосомы, в которых белок и РНК принадлежали разным микроорганизмам.
|
|
|
До сегодняшнего дня неясна роль рибосомной РНК. Предполагается, что она является той уникальной специфической матрицей, на которой при формировании рибосомной частицы находит строго определенное место каждый из многочисленных рибосомных белков (А.С. Спирин, 1968).
А. Рич (1962) обнаружил агрегаты из нескольких рибосом, соединенных между собой нитью иРНК. Эти комплексы были названы полисомами. Обнаружение полисом позволило Ричу и Уотсону (1963) высказать предположение, что синтез полипептидной цепи происходит на рибосоме, которая как бы продвигается по цепочке иРНК. По мере продвижения рибосомы по цепочке иРНК в частице совершается считывание информации и образование полипептидной цепи белка, а новые рибосомы поочередно присоединяются к высвобождающемуся прочитанному концу иРНК. Из данных Рича и Уотсона следовало, что значение полисом в клетке состоит в массовой продукции белка путем последовательного пропитывания матрицы сразу несколькими рибосомами.
|
|
|
В результате исследований М. Ниренберга, С. Очоа, Ф. Липмана, Г. Кораны и других в 1963–1970 гг. стало известно, что наряду с иРНК, рибосомами, АТФ и аминоацил‑тРНК в процессе трансляции принимает участие большое количество разнообразных факторов, а сам процесс трансляции может быть условно разделен на три этапа – инициацию, собственно трансляцию и терминацию.
Регуляция активности генов и белков.
После проблемы специфичности белкового синтеза на первом месте в молекулярной биологии оказалась проблема регуляции синтеза белков, или, что то же самое, регуляции активности генов.
Функциональная неравнозначность клеток и связанные с ней репрессия и активация генов давно привлекали внимание генетиков, но до последнего времени реальный механизм контроля генной активности оставался неизвестным.
|
|
|
Первые попытки объяснить регуляторную активность генов были связаны с изучением гистонных белков. Еще супруги Стэдман[186] в начале 40‑х годов XX в. высказывали мысль, что именно гистоны могут играть в этом явлении основную роль. В дальнейшем они получили первые четкие данные о различиях в химической природе гистонных белков. В настоящее время количество фактов, свидетельствующих в пользу этой гипотезы, с каждым годом все более возрастает.
В то же время накапливается все большее число данных, говорящих о том, что регуляция генной активности – гораздо более сложный процесс, чем простое взаимодействие участков генов с молекулами гистонных белков. В 1960–1962 гг. в лаборатории Р.Б. Хесина‑Лурье было выяснено, что гены фагов начинают считываться неодновременно: гены фага T2 можно разделить на ранние, функционирование которых происходило в первые минуты заражения бактериальной клетки, и поздние, начинавшие синтезировать иРНК после завершения работы ранних генов.
В 1961 г. французские биохимики Ф. Жакоб и Ж. Моно предложили схему регуляции активности генов, которая сыграла исключительную роль в понимании регуляторных механизмов клетки вообще. Согласно схеме Жакоба и Моно, в ДНК кроме структурных (информационных) генов имеются еще гены‑регуляторы и гены‑операторы. Ген‑регулятор кодирует синтез специфического вещества – репрессора, который может присоединяться как к индуктору, так и к гену‑оператору. Ген‑оператор сцеплен со структурными генами, а ген‑регулятор находится на некотором отдалении от них. Если в среде нет индуктора, например, лактозы, то синтезируемый геном‑регулятором репрессор связывается с геном‑оператором и, блокируя его, выключает работу всего оперона (блок структурных генов вместе с управляющим ими оператором). Образования фермента в этих условиях не происходит. Если же в среде появляется индуктор (лактоза), то продукт гена‑регулятора – репрессор – связывается с лактозой и снимает блок с гена‑оператора. В этом случае становится возможной работа структурного гена, кодирующего синтез фермента, и фермент (лактоза) появляется в среде.
|
|
|
По мнению Жакоба и Моно, эта схема регуляции применима ко всем адаптивным ферментам и может иметь место как при репрессии, когда образование фермента подавляется избытком продукта реакции, так и при индукции, когда внесение субстрата вызывает синтез фермента. За исследования регуляции активности генов Жакоб и Моно были удостоены в 1965 г. Нобелевской премии.
Первоначально эта схема казалась слишком надуманной. Однако впоследствии выяснилось, что регуляция генов по этому принципу имеет место не только у бактерий, но и у других организмов.
Начиная с 1960 г. заметное место в молекулярной биологии занимают исследования организации генома и структуры хроматина у эукариотических организмов (Дж. Боннер, Р. Бриттен, В. Олфри, П. Уокер, Ю.С. Ченцов, И.Б. Збарский и др.) и по регуляции транскрипции (А. Мирский, Г.П. Георгиев, М. Бернстил, Д. Голл, Р. Цанев, Р.И. Салганик). Долгое время оставалась неизвестной и спорной природа репрессора. В 1968 г. М. Пташне (США) показал, что репрессором является белок. Он выделил его в лаборатории Дж. Уотсона и обнаружил, что репрессор, действительно, обладает сродством к индуктору (лактозе) и одновременно «узнает» ген‑оператор лак‑оперона и специфически связывается с ним.
В последние 5–7 лет получены данные о наличии еще одной управляющей ячейки генной активности – промоторе. Оказалось, что по соседству с операторным участком, к которому присоединяется продукт, синтезированный на гене‑регуляторе – белковом веществе репрессора, имеется другой участок, который также следует отнести к членам регуляторной системы генной активности. К этому участку присоединяется белковая молекула фермента РНК‑полимеразы. В промоторном участке должно произойти взаимное узнавание уникальной последовательности нуклеотидов в ДНК и специфической конфигурации белка РНК‑полимеразы. От эффективности узнавания будет зависеть осуществление процесса считывания генетической информации с данной последовательностью генов оперона, примыкающего к промотору.
Кроме описанной Жакобом и Моно схемы, в клетке существуют и другие механизмы регуляции генов. Ф. Жакоб и С. Бреннер (1963) установили, что регуляция репликации бактериальной ДНК определенным образом контролируется клеточной мембраной. Опыты Жакоба (1954) по индукции разных профагов убедительно показали, что под влиянием различных мутагенных факторов в клетке лизогенных бактерий начинается избирательная репликация гена профага, а репликация генома хозяина блокируется. В 1970 г. Ф. Белл сообщил о том, что в цитоплазму из ядра могут переходить небольшие молекулы ДНК и уже там транскрибироваться.
Таким образом, регуляция активности генов может осуществляться на уровне репликации, транскрипции и трансляции.
Значительные успехи достигнуты в изучении регуляции не только синтеза ферментов, но и их активности. На явления регуляции активности ферментов в клетке указывали еще в 50‑х годах А. Новик и Л. Сциллард. Г. Умбаргер (1956) установил, что в клетке существует весьма рациональный путь подавления активности фермента конечным продуктом цепи реакций по типу обратной связи. Как было установлено Ж. Моно, Ж. Шанже, Ф. Жакобом, А. Парди и другими исследователями (1956–1960), регуляция активности ферментов может осуществляться по аллостерическому принципу. Фермент или одна из его субъединиц, кроме сродства к субстрату, обладает сродством к одному из продуктов цепи реакций. Под влиянием такого продукта‑сигнала фермент так изменяет свою конформацию, что утрачивает активность. В результате вся цепь ферментативных реакций выключается в самом начале. На существенную роль конформационных изменений белка в ферментативных реакциях, а в известном смысле и на наличие аллостерического эффекта, указывали Д. Уимен и Р. Вудворд (1952; лауреат Нобелевской премии, 1965).
Структура и функции белков.
В результате работ Т. Осборна, Г. Гофмейстера, А. Гюрбера, Ф. Шульца и многих других в конце XIX в. были получены многие животные и растительные белки в кристаллическом виде. Примерно в это же время при помощи разных физических методов были установлены молекулярные веса некоторых белков. Так, в 1891 г. А. Сабанеев и Н. Александров: сообщили, что молекулярный вес овальбумина составляет 14 000; в 1905 г. Э. Рейд установил, что молекулярный вес гемоглобина равен 48 000. Полимерная структура белков была раскрыта в 1871 г. Г. Глазиветцом и Д. Габерманом. Идея о пептидной связи отдельных аминокислотных остатков в белках была высказана Т. Куртиусом (1883). Работы по химической конденсации аминокислот (Э. Шаал, 1871; Г. Шифф, 1897; Л. Бальбиано и Д. Траскиатти, 1900) и синтезу гетерополипептидов (Э. Фишер, 1902–1907, Нобелевская премия, 1902) привели к разработке основных принципов химической структуры белков.
Первый кристаллический фермент (уреаза) был получен в 1926 г. Дж. Самнером (Нобелевская премия, 1946), а в 1930 г. Дж. Нортроп (Нобелевская премия, 1946) получил кристаллический пепсин. После этих работ стало ясно, что ферменты имеют белковую природу. В 1940 г. М. Куниц выделил кристаллическую РНК‑азу. К 1958 г. уже было известно более 100 кристаллических ферментов и свыше 500 ферментов, выделенных в некристаллическом виде. Получение высокоочищенных препаратов индивидуальных белков способствовало расшифровке их первичной структуры и макромолекулярной организации.
Большое значение для развития молекулярной биологии вообще и генетики человека, в особенности, имело открытие Л. Полингом (1940) ненормального гемоглобина S, выделенного из эритроцитов людей с тяжелой наследственной болезнью – серповидно‑клеточной анемией. В 1955–1957 гг. В. Ингрэм использовал разработанный Ф. Сенгером метод «отпечатков пальцев» (пятен, образуемых отдельными пептидами при хроматографии на бумаге) для анализа продуктов гидролиза гемоглобина S‑щелочью и трипсином. В 1961 г. Ингрэм сообщил, что гемоглобин S отличается от нормального гемоглобина только по природе одного аминокислотного остатка: в нормальном гемоглобине в седьмом положении цепи находится остаток глютаминовой кислоты, а в гемоглобине S – остаток валина. Тем самым полностью подтвердилось (1949) предположение Полинга, что серповидно‑клеточная анемия является болезнью молекулярной природы. Наследуемое изменение всего одного остатка аминокислоты в каждой половинке макромолекулы гемоглобина приводит к тому, что гемоглобин утрачивает способность легко растворяться при низкой концентрации кислорода и начинает кристаллизоваться, что приводит к нарушению структуры клетки. Эти исследования со всей очевидностью показали, что структура белка представляет собой строго определенную аминокислотную последовательность, которая закодирована в геноме. Об исключительном значении первичной структуры белка в формировании уникальной биологически активной конформации макромолекулы свидетельствовали работы К. Анфинсена (1951). Анфинсен показал, что утрачиваемая в результате Восстановления биологически активная макроструктура панкреатической рибонуклеазы предопределена аминокислотной последовательностью и может вновь возникать спонтанно при окислении SH‑групп остатков цистеина с образованием дисульфидных сшивок в строго определенных местах пептидной цепи фермента.
К настоящему времени детально изучен механизм действия большого числа ферментов и определена структура многих белков.
1
Из рентгеноструктурных исследований У. Астбери (1933) следовало, что пептидные цепи белковых молекул скручены или уложены каким‑то строго определенным образом. Начиная с этого времени, многие авторы высказывали различные гипотезы о способах укладки белковых цепей, но до 1951 г. все модели оставались умозрительными построениями, не отвечавшими экспериментальным данным. В 1951 г. Л. Полинг и Р. Кори опубликовали серию блестящих работ, в которых окончательно была сформулирована теория вторичной структуры белков – теория α‑спирали. Наряду с этим стало также известно, что белки обладают еще третичной структурой: α‑спираль пептидной цепи может быть определенным образом сложена, образуя довольно компактную структуру.
Для понимания принципов сборки биологических структур существенное значение имели вирусологические исследования (см. главу 25).
Нерешенные проблемы.
Основные успехи в современной молекулярной биологии достигнуты в основном в результате изучения нуклеиновых кислот. Тем не менее, даже в этой области еще далеко не все проблемы разрешены. Больших усилий потребует, в частности, расшифровка всей нуклеотидной последовательности генома. Эта проблема в свою очередь неразрывно связана с проблемой гетерогенности ДНК и требует разработки новых совершенных методов фракционирования и выделения индивидуальных молекул из суммарного генетического материала клетки.
До сих пор усилия в основном были сосредоточены на раздельном изучении белков и нуклеиновых кислот. В клетке же эти биополимеры неразрывно связаны друг с другом и функционируют главным образом в форме нуклеопротеидов. Поэтому сейчас с особой остротой проявилась необходимость изучения взаимодействия белков и нуклеиновых кислот. На первый план выдвигается проблема узнавания белками определенных участков нуклеиновых кислот. Уже наметились шаги к изучению такого взаимодействия этих биополимеров, без которого немыслимо полное понимание структуры и функций хромосом, рибосом и других структур. Без этого невозможно также уяснить регуляцию активности генов и окончательно расшифровать принципы работы белоксинтезирующих механизмов.
После работ Жакоба и Моно появились некоторые новые данные о регуляторном значении мембран в синтезе ядерного материала. Это ставит задачу более глубокого исследования роли мембран в регуляции репликации ДНК. В целом проблема регуляции активности генов и клеточной активности вообще стала одной из важнейших проблем современной молекулярной биологии.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 157; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!