ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ

Занятие 8. Получение чистых культур и количественный учет микрофлоры воздуха

Факторы, действующие на микроорганизмы, довольно разнообразны. Поэтому для выяснения значимости каждого фактора и его специфического воздействия все их можно разделить на две группы: средообразующие и экологические.

Экологические факторы, в отличии от средообразующих, довольно не постоянны во времени и, следовательно, существенным образом могут ограничивать рост организмов.

Каждый экологический фактор характеризуется определенными количественными показателями и прежде всего амплитудой, которая выражается двумя точками – минимумом и максимумом. Таким образом, биологический процесс может осуществляться не при любых значениях фактора, а в пределах этих двух значений, которые представляют собой границы толерантности данного процесса относительно данного фактора. Эти границы определяются с одной стороны недостаточностью, а с другой - избыточностью данного фактора и яляются зонами наибольшего угнетения. Наилучшее развитие микроорганизмов идет при оптимальной интенсивности фактора. В природных условиях все экологические факторы тесно взаимосязаны друг с другом и изменение одного из них, как правило, ведет за собой изменение того или иного фактора; следует иметь в виду их взаимодействие. Для удобства все экологические факторы можно разделить на три группы:

1. абиотические – физические (магнитное поле, свет, ионизирующее излучение, температура) и химические (химический состав среды)

2. биотические – фитогенные (растения), зоогенные (животные) и микрогенные (грибы, водоросли, бактерии).

-41-

3. антропогенные – различные формы деятельности человека, влияющие на окружающую среду.

Средообразующие факторы всегда более или менее постоянны во времени, в количественном выражении они всегда находятся в избытке и не лимитируют жизнедеятельность микроорганизмов. Выделяют три вида средообразующих факторов – почва, вода и воздух.

Воздух – это не однородная среда, а совокупность нескольких газов и примесей и - как отмечал еще В.И. Вернадский - продукт жизнедеятельности организмов. Это, прежде всего, относится к основным газам атмосферы – кислороду (21,0%), азоту (78,06%), углекислому газу (0,03%). Кроме этих основных газов в воздухе содержатся такие как неон, криптон, ксенон, а также примеси – аммиак и сероводород.

Вопрос о наличии микроорганизмов в воздухе был впервые поставлен на научную основу Луи Пастером. В результате длительной дискуссии и проведенных им убедительных опытов, было установлено, что в воздухе в довольно больших количествах находятся жизнеспособные формы микроорганизмов.

Несмотря на то, что атмосфера является неблагоприятной средой обитания для микроорганизмов, они находятся в ней постоянно. В атмосфере действуют такие неблагоприятные факторы, как ультрафиолетовое облучение и высушивание, но существуют и благоприятные факторы – в воздухе постоянно присутствуют пылевые частицы, на которых адсорбируются водяные пары и различные соединения. Это может способствовать развитию микроорганизмов.

Все микроорганизмы, находящиеся во взвешенном состоянии и пассивно переносимые токами воздуха, объединяют понятием «аэропланктон». Эти микроорганизмы подчиняются целиком физическим законам, как и любая частица соответствующего размера.

Согласно соответствующим представлениям микроорганизмы могут находиться в воздухе в одной из трех фаз: капельной, капельно-ядерной и пылевой. В капельной фазе бактерии находятся внутри водно–солевой оболочки. По мере высыхания концентрация веществ, растворенных в капле, увеличивается, а на поверхности бактериальной клетки откладываются соли. Такие структуры представляют собой фазу капельных ядер. Связанные с пылевыми частицами клетки микроорганизмов представляют собой пылевую фазу. В этой фазе бактерии наиболее устойчивы к воздействию факторов окружающей среды.

Условия для существования микроорганизмов в воздухе во

-42-

взвешенном состоянии являются для них благоприятными. Это объясняется тем, что с одной стороны, в воздушной среде питательные вещества находятся в ограниченном количестве, а с другой - сами бактерии находятся главным образом в виде сухих частиц и реже - капель. В таком состоянии они подвергаются сильному воздействию обезвоживания, резкому перепаду температур, действию ультрафиолетового излучения. Это существенным образом ограничивает рост и размножение микроорганизмов. Однако нельзя полностью исключать такую возможность их существования в воздухе в виде популяций.

При сочетании высокой влажности воздуха, благоприятной температуры, отсутствия солнечных лучей, наличия питательных веществ могут создаваться условия для размножения отдельных видов бактерий. Такие условия могут быть в низко расположенных облаках. При проведении исследований было обнаружено более высокое содержание бактерий именно в облаках по сравнению с другими слоями воздуха. Колебания количественного и качественного составов микрофлоры воздуха наблюдаются при смене времен года и зависят от климатических зон. Наиболее высокие концентрации жизнеспособных бактерий выявляются в теплый период года, а наиболее низкие – в зимний. Последнее в первую очередь связано с наличием снежного покрова, который препятствует поступлению почвенной микрофлоры в воздух. Большое влияние на численность микроорганизмов оказывает выпадение осадков в виде дождя и снега, которые удаляют основную массу взвешенных микроорганизмов из воздуха. Другим важным источником поступления микроорганизмов в воздух является поверхность морей и океанов. Если с поверхности суши микроорганизмы поступают в воздух главным образом в виде пылевой фазы, то морская микрофлора в виде капельной.

Жизнедеятельность человека и его активная преобразующая роль оказывают существенное влияние на характер и численность микрофлоры воздуха. Урбанизация – создание крупных промышленных предприятий - приводит к существенному увеличению в составе воздуха различных веществ: сероводорода, аммиака, окислов азота и серы, органических веществ, что способствует созданию благоприятных условий для развития микрофлоры воздуха. С другой стороны трудовая деятельность человека - (микробиологическая промышленность) увеличивает разнообразие микрофлоры воздуха. Таким образом, под влиянием ряда факторов складывается микрофлора воздуха, характер которой может существенно различаться в разных районах,

-43-

но благодаря малым размерам микроорганизмов они способны с токами воздуха перемещаться на большие расстояния и в результате этого идет усреднение качественного и количественного составов микроорганизмов в воздухе.

Для определения общего количества микроорганизмов в различных субстратах применяют ряд методов: прямой подсчет клеток под микроскопом (в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках, на мембранных фильтрах), выделение и учет высевом на плотные (чашечный метод Коха) и в жидкие (метод предельных разведений) питательные среды. Методы прямого подсчета клеток под микроскопом дают возможность наиболее полно учесть численность микроорганизмов в субстрате. Однако при этом учитываются и живые, и мертвые клетки, поэтому результаты подсчета могут быть не вполне точными. Методами высева на плотные питательные среды учитываются только жизнеспособные клетки микроорганизмов. Для выделения и учета как можно более широкого круга микроорганизмов, населявших данный субстрат, используют метод Коха. Данный метод позволяет не только учесть численность микроорганизмов, но и оценить их разнообразие по морфологии колоний.

Чашечный метод учета микроорганизмов (метод Коха) заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии или осаждении микроорганизмов за определенный промежуток времени на плотную питательную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее из одной клетки. Установлено, что на площади 100 см²в течение 5 мин оседает столько микробных клеток, сколько их содержится в 10 л воздуха. Зная площадь чашки Петри, можно определить количество микроорганизмов в 1м³ воздуха.

Пример подсчета. В чашке Петри в результате 5 мин выдержки на воздухе выросло 25 колоний.

1. Поскольку радиус чашки Петри обычно составляет 5 см, определяют площадь питательной среды по формуле πr², которая равна 3,14х25=78,5см².

2. Вычисляют количество колоний на площади 1дм²= 100см²:

25 колоний – 78,5см² х= 25х100/78,5=32 колонии

х колоний - 100 см²

Перечисляют количество бактерий на 1м³ воздуха (1000 л), составляя пропорцию:

32 колонии – 10 л х = 32х1000/10=3200 колоний

-44-

х колоний – 1000 л

Следовательно, в 1 м³ воздуха содержится 3200 бактерий.

Описание колоний. Для описания колоний используются культуральные свойства микроорганизмов, к которым относятся, прежде всего характерные особенности роста на плотных питательных средах. В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне чашки), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием и является наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотном субстрате. При их описании учитываются следующие признаки:

Форма колонии – округлая, амебовидная, ризоидная;

размер колонии - диаметр, колонии в мм;

поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая;

блеск колоний - блестящая, матовая, тусклая, прозрачная;

цвет колонии - белая, желтая, красная, серая, фиолетовая;

Глубинные колонии, напротив, довольно однообразны. Чаще всего они по виду похожи на более или менее сплющенные чечевички, имеющие форму овалов с заостренными концами. Данные колонии имеют вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

Описание колоний часто дополняют описанием роста микробной популяции по штриху на поверхности скошенной плотной среды. Отмечают интенсивность роста по штриху: скудный, умеренный, обильный и его особенности: налет сплошной с ровными или волнистыми краями, четковидный в виде цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный (рис. 8). Характеризуют оптические свойства штриха, его цвет, поверхность и консистенцию. При описании колоний следует учитывать состав среды и возраст культуры, так как колонии одного и того же организма на различных средах и разные по возрасту могут отличаться рядом признаков.

Объекты исследования: Чистые культуры микроорганизмов, выросшие на чашках и на скошенном агаре в пробирках.

-45-

1 2 3 4 5 6

Рис. 8. Рост бактерий по штриху: 1 - сплошной с ровным краем; 2 - сплошной с волнистым краем; 3 - четковидный; 4 - диффузный; 5 - перистый; 6 - ризоидный

Задания:

1. Провести количественный учет микрофлоры воздуха.

2. Дать описание колоний выделенных микроорганизмов.

3. Определить морфологию бактерий, используя препарат «мазок».

4. Дать описание роста выделенных микроорганизмов по штриху.

Контрольные вопросы Методы количественного учета микроорганизмов.

Занятие 9. Микрофлора воды и почвы

Почва представляет собой наиболее благоприятную естественную среду обитания. Она содержит достаточное количество органических и минеральных веществ, защищает микроорганизмы от действия радиации и высыхания.

Наиболее обильно микроорганизмами заселен верхний слой почвы (10 см), в котором преимущественно развиваются бактерии, составляющие до 90% всей микрофлоры. Численность микроорганизмов в почве зависит от типа почвы и климатической зоны. Однако почва является не только средой обитания, но и объектом воздействия микроорганизмов.

Вода как и почва является благоприятной средой обитания для многих микроорганизмов. Их численность зависит от степени загрязнения водоема. Наибольшая численность микроорганизмов наблюдается в закрытых водоемах, расположенных в близи городов. Микроорганизмы, развиваясь в водной среде, оказывают и

-46-

существенное влияние на ее состав. Им принадлежит важная роль в очистке и продуктивности водоемов. Особенностью многих водоемов является их обогащение органическими веществами, поступающими со сточными водами. Микроорганизмы принимают активное участие в их разложении, а накопленная микробная биомасса является кормом для более высших организмов. Таким образом, роль микроорганизмов в продуктивности водоемов сводится к передаче энергии химических соединений в виде биомассы более высшим организмам. Наряду с положительной ролью микроорганизмы оказывают и вредное воздействие. Некоторые из них в процессе жизнедеятельности могут выделять в окружающую среду токсичные продукты, другие же могут быть патогенными.

Наиболее удобными для экологических исследований являются водные экосистемы, хорошо отграниченные и легко поддающиеся описанию, к таким относятся пруды и озера. В них имеются как аэробные, так и анаэробные зоны, которые можно обнаружить и в большинстве почв. Но если в почве они тесно сосредоточены и довольно легко поддаются исследованию. Поэтому есть основания полагать, что результаты исследований прудов и озер в какой-то степени можно перенести и на почву с ее микрогетерогенностью.

Озера довольно легко поддаются классификации. В основу ее может быть положена степень трофности, т. е. наличие питательных веществ, необходимых для развития микроорганизмов.

Озера, богатые элементами питания с дефицитом кислорода и обильным развитием фитопланктона, принято называть евтрофными, а бедными – олиготрофными. Было обнаружено большое разнообразие переходных форм, которые получили название мезотрофных. Поэтому понятия олиготрофия и евтрофия все более приобретают смысл не как основа классификации, а как понятия, характеризующие озеро в смысле богатства населением.

Профиль воды вводоемов закрытого типа неоднороден и имеет несколько слоев или зон, отличающихся рядом экологических параметров, т. е. обладает стратификацией. По наличию стратификации выделяют три типа озер:

1. голомиктические (с полным перемешиванием слоев),

2. меромиктические (с частичным перемешиванием),

3. амиктические (со стабильной слоистостью).

К перому типу относятся пресноводные озера умеренных

-47-

широт. В этих озерах весной холодная вода прогревается солнцем и верхний слой воды становится теплым, а его плотность уменьшается. Этот верхний теплый слой называется эпилимнионом, он лежит поверх более холодного слоя воды с большей плотностью – гиполимнионом. Эти слои разделены переходной зоной – металимнионом (хемоклином или термоклином). В глубоких озерах такое разделение – стратификация может сохраняться в течение всего лета. В результате процессов аэробного распада органических веществ растворенный в воде кислород, начиная с придонного слоя, расходуется и в гиполимнионе создаются анаэробные условия. Эпилимнион, соприкасается с кислородом воздуха, перемешивается ветром и поэтому остается аэробной зоной. Это создает градиент окислительно-восстановительного потенциала и химических градиентов в области термоклина, который называется также хемоклином, или металимнионом.

Осенью происходит охлаждение эпилимниона и более теплые слои воды гиполимниона поднимаются вверх. В результате этого происходит полное перемешивание всех слоев и нарушается стратификация. Вода по всей глубине равномерно обогащается кислородом и питательными веществами. В зимний период в таких озерах может устанавливаться обратная стратификация, которая вновь нарушается в весенний период. После перемешивания в весенний период создается летняя стратификация.

Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха). Метод широко применяется для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных питательных средах. Сущность его заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и подсчете выросших после инкубации колоний. Принято считать, что каждая колония – потомство одной клетки.

Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашках Петри и подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно достаточно велика. Поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных раз-

-48-

ведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или 0,85%-ном растворе NaCl, используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, так как это уменьшает вероятность ошибки. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды. Это первое разведение (10^-1). Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем этой же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во вторую пробирку – получают второе разведение (10^-2). Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата.

Проведение посева. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15-20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0, 1мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным, стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2-4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

Подсчет выросших колоний.

Колонии бактерий подсчитывают обычно через 3 суток инкубации в термостате.

Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки. При боль-

-49-

шом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, подсчитывают число колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на агаровой пластинке в чашке Петри вырастает от 50 до 100 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле М= а 10ⁿ/ V, где М – количество клеток в 1 мл, а – среднее число колоний при высеве данного разведения, 10 – коэффициент разведения, n – порядковый номер разведения, из которого сделан высев, V – объем суспензии, взятый для посева, в мл.

Дата добавления: 2019-09-02; просмотров: 231; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!