Результаты осеменения маток оттаявшей спермой в связи с содержанием витамина Е в рационе хряков (по данным В.П. Кононова, В.Я. Черных, А.Г. Нарижного, 1978)
| Содержание ви- тамина Е в су- точном рационе хряков (мг) | Коли- чество осеме- ненных маток | Из них опоросилось | Количество родившихся поросят | Количе- ство поросят в гнезде | Средняя масса по- росенка при рож- дении | |
| Число | % | |||||
| 100 (контроль) | 12 | 6 | 50±14 | 51 | 8,5 | 1,18 |
| 500 | 18 | 12 | 67±11 | 112 | 9,3 | 1,29 |
Однако все вместе взятые факторы означают, что увеличение содержания витамина Е в рационе хряков усиливает устойчи- вость спермиев, что выражается в лучшей выживаемости их вне организма, и при глубоком охлаждении. Остается пока неясным, как проявляется это положительное действие: прямым путем – за счет увеличения концентрации токоферола в структурах спермиев, или косвенно – через повышение в организме концен- трации витамина А. Несомненно одно, что резервом повышения результативности осеменения замороженной спермой хряка мо- жет быть совершенствование витаминного питания производи- телей. В этой связи необходимы дальнейшие более детальные исследования по уточнению дозировки витаминов А и Е в ра- ционах хряков, сперма которых подлежит замораживанию.
Таким образом, скармливая животным отдельные витамины или антиоксиданты, можно значительно повлиять на качество спермопродукции производителей. Вполне возможно, что эти компоненты рациона могут предотвратить накопление пере- окисленных продуктов в организме и в сперме, повысить как общую устойчивость спермиев, так и при замораживании.
|
|
|
Взятие спермы хряков для глубокого замораживания. Большой объем эякулята хряков усугубляет технологию замо- раживания спермы, а также требует больших затрат труда, хла- доагентов и др. Уменьшить объем эякулята хряков можно путем удаления секретов придаточных половых желез следующим об- разом: 1) получение всего эякулята (кроме секрета куперовых желез) с дальнейшим его центрифугированием и удалением на- досадочной плазмы; 2) получение концентрированной спермы;
3) отбор густой фракции спермы; 4) использование.
Весь эякулят (без куперовых желез) от хряков получают на чучело свиньи. В практике применяется много различных кон-
струкций чучела свиньи – от примитивных приспособлений до довольно сложных устройств. Профессором С.И. Сердюком и другими авторами разработано модернизированное чучело для садки хряков (ССХМ-2), которое уже выпускается серийно и применяется в большинстве свиноводческих комплексов. Спер- му от хряков получают с помощью искусственной вагины со спермоприемником.
За границей находит широкое применение мануальный (manus – кисть руки) метод получения спермы.
Получить концентрированную сперму у хряков можно с по- мощью инъекции атропина (К. Левин, 1976). Животным за 30– 60 мин перед получением спермы инъекцируют в виде 1%-ного водного раствора атропина подкожно в расчете 0,007–0,01 г су- хого вещества на 100 кг живой массы. Препарат способствует торможению секреции придаточных половых желез, но не влия- ет на выделение спермиев из придатка семенника в процессе эякуляции.
|
|
|
После получения спермы проводят ее оценку по объему, подвижности и концентрации по общепринятым методикам. Для этого нужно строго выполнять требования инструкции по искусственному осеменению свиней. Сперма допускается к за- мораживанию с подвижностью не ниже 8 баллов и концентра- цией половых клеток 150 млн/мл.
Отбор спермы хряков, предназначенной для заморажи- вания. Большая вариабельность результатов искусственного осеменения свиней оттаянной спермой после глубокого ее за- мораживания, констатированная советскими и зарубежными исследователями, обусловлена как индивидуальной, породной, так и сезонной изменчивостью спермы к замораживанию. Ре- зультативность осеменения маток оттаянной спермой в наших исследованиях колебалась от 29 до 83 %, в опытах Л. Г. Мороз и др. – от 12,5 до 85,7 %. Однако в практике свиноводства отбор высокоценных в племенном отношении хряков проводят для получения от них криорезистентной и полноценной спермы с целью дальнейшего ее замораживания.
|
|
|
В литературе имеются незначительные сведения в отноше- нии отбора как хряков, так и спермы для ее глубокого замора- живания. Критерии оценки замороженной спермы быков неэф- фективны для оценки спермиев хряков. Это связано с тем, что жизнеспособность спермиев (подвижность и живучесть) отра-
жает лишь состояние двигательного и энергетического аппара- тов и не характеризует состояние ядра и акросомы, определяю- щих их оплодотворяемость и дальнейшее развитие зародышей. Учитывая большую обводненность спермиев хряка, акросомы которых легко подвергаются повреждениям при заморажива- нии. Поэтому жизнеспособность спермиев – подвижность и живучесть оттаянной спермы – необходимо применять для предварительной оценки новой технологии криоконсервации, а окончательным показателем необходимо считать оплодотво- ряющую способность и опоросы. Практический опыт свиде- тельствует о том, что результативность осеменения маток с ис- пользованием глубокозамороженной спермы зависит от условий кормления и содержания маточного поголовья и ряда других факторов. Поэтому сейчас ведется поиск специфических тестов для оценки свежеполученной и замороженной спермы, связан- ных с прогнозированием ее оплодотворяемости после оттаива- ния.
|
|
|
Ряд исследователей считают эффективным показателем от- таянной спермы ее подвижность после 5 ч инкубации при тем- пературе 37°С. Из множества испытанных методов для опреде- ления состояния акросомы использовали фазово-контрастный микроскоп. Выяснено несколько форм повреждения акросомы. Процентное соотношение нормальных акросом в комплексе с оценкой подвижности половых клеток спермы после оттаива- ния служит эталоном ее качества.
Ленинградскими исследователями была изучена связь мор- фофизиологических и биохимических показателей свежевзятой и замороженной спермы хряков с ее оплодотворяемостью. Так, высокую связь с оплодотворяемостью из свежеполученной спермы после оттаивания имеет стимуляция дыхания разобщи- телем 2,4-ДНФ, которая характеризует сопряженность дыхания спермиев с синтезом АТФ и активностью гиалуронидазы, сви- детельствующая о повреждении акросом.
Исследователи, изучая выживаемость, сохранность акросом, времени редукции метиленового синего (РМС) и другие показа- тели спермиев хряков при воздействии холодового удара с оп- лодотворяемостью оттаянной спермы, считают, что названные показатели могут быть критериями криорезистентности спер- мы.
Положительная связь отмечена между оплодотворяемостью и стимуляцией дыхания 2,4-ДНФ оттаянных спермиев (ч=0,70, Р<0,01). Кроме того, с оплодотворяемостью коррелируют по- казатели сохранности ферментов – акрозина, гиалуронизы, лак- тат-дегидрогеназы – в спермиях после оттаивания (ч=0,76, ч=0,61 и ч=0,57 при Р<0,05).
На основании данных А. Д. Курбатова и др. установлено, что сперму для глубокого замораживания следует отбирать с подвижностью 8 баллов и более, концентрацией не менее 150 млн/мл и стимуляцией дыхания 2,4-ДНФ более 3. Процент по- врежденных акромос – не выше 5. Выживаемость спермиев по- сле воздействия холодовым ударом – более 5 ч, время РМС – менее 15 мин, сохранность акросом – более 80 %, стимуляция дыхания 2,4-ДНФ — выше 2.
Однако с целью получения оплодотворяемости более 50 % при использовании замороженной спермы необходимо строго отбирать эякуляты с подвижностью 3 балла и более, выживае- мостью 5 ч и более, стимуляцией дыхания 2,4-ДНФ – выше 1,8, сохранностью акросом — не ниже 70 %.
Для замораживания используют сперму от хряков- производителей в возрасте 1,5–5 лет. От более молодых живот- ных сперму брать нежелательно, так как она менее устойчива к замораживанию, а у старых часто отмечается увеличение числа патологических спермиев, их агглютинация. Получают сперму от хряков для замораживания в режиме один эякулят в 5–7 дней. Интенсивное использование хряков снижает концентрацию, криорезистенцию спермиев, их подвижность после оттаивания, что обусловлено повышением электролитов в плазме, которые усиливают окислительные процессы. Кроме того, ежедневные эякуляции также понижают биологическую характеристику спермиев, которая восстанавливается до первоначальных вели- чин после 20-суточного покоя (В.П. Кононов, А.Г. Нарижный, В.Я. Черных).
На устойчивость спермиев к замораживанию влияет и сезон года. Ленинградские исследователи установили, что весной снижается криорезистентность, вследствие чего увеличивается проницаемость мембран. Поэтому более благоприятным перио- дом времени в условиях Центрально-Черноземной зоны России
для замораживания спермы хряков считается осенне-зимний период.
Отмечены индивидуальные и породные особенности устой- чивости спермы к замораживанию.
Среды для глубокого замораживания спермы хряков
Эффективность замораживания спермы хряков в опреде- ленной степени зависит от состава применяемых синтетических сред. Они должны отвечать следующим требованиям: иметь достаточную буферную емкость; иметь оптимальную электро- проводность; предохранять спермии от вредного воздействия внешней среды, усугубляемого при замораживании действием низких температур.
Для криоконсервации спермы хряков применяются простые и сложные по составу компонентов среды (табл. 179). Простые синтетические среды для замораживания спермы хряков вклю- чают в себя три компонента – сахар, желток и глицерин. Анало- гичная среда используется в Великобритании. Ряд исследовате- лей усовершенствуют метод замораживания спермы хряков, ус- ложняя среды, упрощают или используют сложные или простые среды.
Таблица 179
Состав синтетических сред для глубокого замораживания спермы хряков
| Компонент | Масса вещества (г) | |||||||||||
| СаЖеМаК | Трис-натрий ЭДТА | Трис-ЭДТА натрий ЭДТАБОА | Трис-натрий ЭДТАБОТ | Трис -натрий ЭДТАБОТ БОАТ | ГХЦЖКУМ | БФ-5 | «Хюльзен- берг-8» | ТЭС – натрий- калий | Глюкоза жел- точная | Японская | Австралий- ская | |
| Вода дис- тиллиро- ванная (мл) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 80 | 1000 | 56 | 100 | 100 | до 8 |
| Глюкоза | — | 8,0 | 8,0 | 8,0 | 8,0 | 50 | 3,2 | 57,5 | 10 мл 5,5 % раст- вора | 5,67 | 5 | — |
| Сахароза | 60,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 | — | — | — | — | — | — | — |
| Лактоза | — | — | — | — | — | — | — | 2,5 | — | — | — | — |
| Фруктоза | — | 8,0 | 8,0 | 8,0 | 8,0 | — | — | — | — | — | 0,5 | 2,0 |
| Инозитол | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 0,5 | |
| ЭДТА | 12,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 1,0 | — | 3,5 | — | — | 0,5 | |
| Кальция окись | 0,6 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — |
| Магния окись | 0,4 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — |
| Натрия гидроксид | — | — | — | — | — | — | — | — | 10,5 мл раствора | 0,325 М | — | — |
| Калия гид- роксид | — | — | — | — | — | — | — | — | 3,5 мл раствора | 0,325 М | — | — |
| Аммоний сульфат | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 | — | — | — | — | — | — | — |
| Натрия цитрат, 3- замещен- ный | ||||||||||||
| 5,5-водный | 3,0 | 3,0 | 3,0 | 3,0 | 3,0 | 2,78 | — | — | — | — | — | — |
| Натрия цитрат, 2-водный | — | — | — | — | — | — | — | 4,5 | — | — | — | — |
| Калия цит- рат, 3-заме- щенный | — | — | — | — | — | 0,65 | — | — | — | — | — | — |
| Калия хлорид | — | — | — | — | — | — | — | 0,4 | — | — | — | — |
| Кислота лимонная | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 1,575 |
| Натрия би- карбонат | — | — | — | — | — | — | — | 1,2 | — | — | — | — |
| Трис (ок- симетил) аминометан | — | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | — | 0,2 | — | — | — | — | 2,725 |
| ТЭС | — | — | — | — | — | — | 1,2 | — | 4,7 | — | — | — |
| Унитиол | — | — | — | — | — | 0,21 | — | — | — | — | — | — |
| БОТ (мг%) | — | — | 60,0 | — | 36,0 | — | — | — | — | — | — | — |
| БОА (мг%) | — | — | — | 30,0 | 6,0 | — | — | — | — | — | — | — |
| AT (мг%) | — | — | — | — | 320,0 | — | — | — | — | — | — | — |
| Мочевина | — | — | — | — | — | 3,0 | — | — | — | — | — | — |
| ОЭП (мл) | — | — | — | — | — | — | 0,5 | 2,0 | 1,0 | — | — | — |
| Глицерин (мл) | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40-60 | 2,0 | 60 | 2,5 | 4,0 | 7,0 | 3,0 |
| Желток куриного яйца (мл) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 100 | 20 | 25 | 20 | 22,5 | 20 | 15 |
Сравнение простой трехкомпонентной среды с многокомпо- нентными не выявило преимуществ у сложных. Замораживание спермы хряков в простой среде вызывает значительно меньшую утечку ACT, чем в сложной среде. Простая трехкомпонентная среда по оплодотворяющей способности не уступала сложной БФ-5, включающей сложные компоненты. В основу синтетиче- ских сред для замораживания спермы хряков положен класси- ческий принцип (В.К. Милованов, 1962), то есть в нее входят неэлектролиты (сахара), электролиты, желток куриного яйца, криопротектор и буферные системы. Разработаны разбавители, состоящие из биологически активных веществ – антиоксидан-
тов, тиоловых соединений и других специфических компонен- тов.
Неэлектролиты. Моно- и полисахара (глюкоза, фруктоза, галактоза, сахароза, лактоза и др.) поддерживают в растворах осмотическое давление, сохраняют электрический заряд спер- миев, обладают защитным действием в процессе заморажива- ния. Это явление сахаров основано на их образовании связи с водой, что изменяет характер как внутри, так и внеклеточной кристаллизации и, соответственно, повреждения клеток. Если моносахариды образуют неустойчивые комплексы с белками, то дисахариды – прочные связи с водой, что не дает возможности их взаимодействию при замораживании. При этом часть воды, которая связана с дисахаридами, теряется, вследствие чего соз- даются предпосылки к взаимодействию между белками и диса- харидами (Н. Пушкарь, А. Белоус).
Опытами было установлено, что число подвижных сперми- ев после замораживания было выше с дисахаридами, чем с мо- но- и трисахаридами, хотя не установлено достоверной разницы между ними. В среде, содержащей фруктозу, подвижность отта- янных спермиев была выше, чем в среде с моно- и дисахарида- ми. Однако исследователи не установили преимущества моно- и трисахаридов перед глюкозой в концентрации 315 мм в разба- вителе, с содержанием 22,5 % желтка и 7,5 % глицерина.
Применение моносахарида фруктозы, дисахарида лактозы и их сочетания в исследованиях Г. Кичева и др. показало пре- имущество лактозы, что, по-видимому, связывают с изменением заряда белков желтка и, соответственно, плазмы, препятствуя их агрегации. Однако сахароза имеет ряд технологических пре- имуществ перед лактозой. Тем не менее в США первые порося- та были получены при искусственном осеменении свиноматок оттаянной спермой после ее замораживания с использованием глюкозы, а в нашей стране — сахарозы. Полученные нами дан- ные согласуются с исследованиями других ученых в том, что сочетание 2-х и 3-х сахаров оказывает более значительное крио- защитное действие, чем каждый из них в отдельности.
Использование различных редуцирующих веществ и ан- тиоксидантов для защиты спермиев хряка. Разработанная в ВИЖ технология замораживания спермы хряка предусматрива- ет ряд моментов, обеспечивающих выживаемость половых кле-
ток и сохранение ими оплодотворяющей способности. Защита половых клеток в этой технологии основана на положительно действующей анаэробной инкубации спермы перед глубоким ее охлаждением. Однако в этой технологии положительное дейст- вие определенных окислительно-восстановительных режимов на спермии полностью было бы исчерпано. Анаэробные усло- вия, создаваемые при помещении спермы в атмосферу водоро- да, могли предотвратить образование вредных продуктов пере- окисления, но не могли устранить отрицательного воздействия уже содержащихся. Вместе с тем продукты переокисления в сперме могут образоваться еще в организме самца, и не исклю- чена возможность внесения их до эякуляции, либо в процессе эякуляции. Очевидно, это происходит из-за кормления живот- ных кормами, содержащими перекиси липидов.
Они могут образовываться в процессе аэробной инкубации спермы (1 ч), предшествующей анаэробной. Известно, что при благоприятных условиях образование липидных переокисей в токсичной концентрации происходит в течение 0,5-часовой вы- держки спермы в аэробных условиях.
Они могут быть внесены с желтком среды, содержащей большое количество легкоокисляющегося липида лецитина, а также фермент лизолецитиназу, способствующий образованию лизолецитина. И наконец, они могут образоваться в сперме в процессе замораживания или после оттаивания как во внешней среде, так и в половых путях самок.
В пользу того, что основная защита спермиев при хранении вне организма состоит в предотвращении окисления отдельных компонентов, свидетельствует тот факт, что при разработке сред положительное действие всегда оказывали вещества, препятст- вующие окислению (лецитин, лимонно-кислый натрий, ЭДТА, унитол, БОТ, БОА, ДТБК, альфа-токоферол-ацетат). Установле- но, что защитное действие среды можно значительно усилить, если в нее ввести антиоксиданты.
Применительно к сперме хряка наилучший защитный эф- фект при замораживании был получен в средах, содержащих вместе с дисахаридами редуцирующие моносахара, а также ор- ганические катионы, трис- (оксиметил)-аминометан, аммоний, как известно, обладающий редуцирующими свойствами. И вме- сте с тем применение в средах пирувата натрия или бета-
глицерофосфата обеспечивало высокую подвижность и живу- честь спермиев после оттаивания и приводило к снижению ре- зультативности осеменения замороженной спермой (В. П. Ко- нонов и др.).
Защитная роль желтка при хранении спермы. Важным компонентом сред, применяемых при замораживании спермы, является желток. Он содержит много фосфолипидов и предо- храняет половые клетки от вредного воздействия низкой темпе- ратуры, повышает устойчивость клеток против действия токси- ческих веществ, гипо-и гипертонических растворов и других факторов внешней среды. Желток также способствует увеличе- нию буферности среды.
Выяснено, что плазма спермы хряков ухудшает защитное действие фосфолипидов желтка, так как она бедна кислыми белками, которые недостаточно образуют комплексы белков с фосфолипидами, что и способствует повышению устойчивости спермиев при охлаждении. Поэтому удаление плазмы спермы повышает защитное действие желтка.
Отделение спермиев от плазмы способствовало повышению связанного фосфатидилхолина. Другие констатировали об эф- фективности фосфатидилсерина для защиты спермиев хряка при охлаждении. Однако фосфатидилсерин в сочетании с холе- стерином также обладают защитным действием. Кроме того было установлено, что не только фосфолипиды яичного желтка обладают защитными свойствами, но и имеющиеся в нем белки. Например, при использовании замороженной спермы с желтком для искусственного осеменения свиноматок оплодотворяемость составила 36 %, с казеином – 15 %, а при сочетании казеина с фосфатидилсерином – 42 %. Введение фосфатидилсерина и хо- лина значительно усиливает защитный эффект казеина.
Эффективность защитного действия желтка зависит от его концентрации в среде. Подвергая разбавленную сперму с 20 и 30 % желтка холодовому удару, разницы в подвижности спер- миев не отмечали. Однако число спермиев с поврежденными акросомами увеличивается с повышением концентрации желт- ка. Так, уменьшение желтка в среде с 14 до 8 % способствовало увеличению оплодотворенности маток на 28,6 %.
Исследования показали, что оптимальная концентрация желтка в среде для глубокого замораживания спермы хряков со- ставляет 5–10 %.
Электролитные компоненты сред. Положительные ре- зультаты в технологии замораживания спермы хряков были достигнуты при применении амфионных и катионных буферов. Впервые опыт использования оттаянной спермы после ее замо- раживания был проведен с использованием среды с трисцит- ратным буфером.
Испытание амфионных, анионных и катионных буферов свидетельствует о том, что защиту при глубоком заморажива- нии спермы хряков обеспечивали амфионные буферы, особенно трис (гидроксиметил) аминометан + сульфоновая кислота. Эф- фективное действие амфионных и катионных буферов, возмож- но, связано с потребностью деионизации сильных электролитов плазмы спермы.
Отрицательное действие сильных электролитов связывают с тем, что при высокой ионной силе ионизируются белковые ком- поненты липопротеиновых комплексов, освобождая липиды в чистом виде. Это важно для спермы, так как липопротеиды по- верхности спермиев хряка неустойчивы к действию сильных электролитов в сравнении со спермиями других видов сельско- хозяйственных животных. В процессе замораживания спермы хряка было установлено, что разрушительное действие высокой ионной силы среды усиливается. Это связано с тем, что в про- цессе вымораживания воды при затвердевании спермы и оттаи- вании эвтетических смесей концентрация солевых компонентов в среде возрастает. Поэтому в опытах J. Senegacnik (1978) кон- статировано, что подвижность и выживаемость спермиев при замораживании зависит от электропроводности среды, и при ее понижении названные показатели оттаянной спермы повыша- ются. Живучесть свежеполученной спермы находится в анало- гической зависимости от ионной силы среды. Поэтому устой- чивость отдельных эякулятов хряка при глубоком заморажива- нии прямо связана с живучестью спермиев в 1%-ном водном растворе хлористого натрия.
Кроме электролитных компонентов среды, соотношения од- но- и двухвалентных ионов, ионная сила и рН определяют ус- тойчивость спермиев: степень гидратации белков и поверхност-
ный электрический заряд. В состав цитоплазматических мем- бран спермиев хряка входят кислые белки с поверхностным от- рицательным электрическим зарядом (К. Esbensade et al., 1976), который создается не только карбоксильными группами белков, но и сиаловыми кислотами, являющимися составной частью гликопротеидов. Общеизвестно, что величина заряда определя- ется не только ионной силой раствора, но и концентрацией во- дородных ионов. Ионизация карбоксильных групп минималь- ная при величине рН, которая для спермиев хряка соответствует 4—6. Однако при наименьшей ионизации гидратация мембран также минимальная, что делает максимальную их сохранность от образования кристаллизации при глубоком замораживании. Кроме того, смещение концентрации водородных ионов среды в щелочную сторону повышает выживаемость глубокозаморо- женной спермы.
В ВИЖ для глубокого замораживания спермы хряка были использованы кальциевый и магниевый комплексонаты ЭДТА. В отличие от ЭДТА применению названных комплексонатов препятствовали связанные Са++, Mg++, что, по-видимому, спо- собствует снижению отрицательного заряда при глубоком замо- раживании и вызывает разупорядочивание мембранных липи- дов. Применение комплексонатов способствует связыванию ка- тиона Zn++, избыток которого повреждает мембраны спермиев. Используя в составе среды магниевого и кальциевого комплек- соната ЭДТА, был проведен опыт по осеменению свиноматок оттаянной спермой с получением клинически здоровых и жиз- неспособных поросят.
Названные «электролитные компоненты сред» применяются для глубокого замораживания спермы хряка. Однако в отноше- нии криопротективного свойства названных компонентов не было единого мнения. Если в одних исследованиях есть мнение, что ЭДТА не обладает криопротективными свойствами и не влияет на подвижность оттаянной спермы, то в других повыша- ет ее живучесть при 37°С.
Установлено неравномерное защитное свойство желтка на цитоплазматические мембраны и функции спермиев. Так, в ис- следованиях Л. Мороза и др. установлено, что желток не защи- щает аэробные изоферменты лактатдегидрогеназ (ЛДГ1 и ЛДГ2) при замораживании, а анаэробные изоферменты (ЛГД3, ЛГД4 и
ЛГД5) хорошо сохраняют активность в спермиях при введении в среду желтка.
Имеются сообщения, что бутилатгидрокситолуол, как и желток, предохраняет спермии от вредного влияния низкой температуры и способствует разупорядочиванию липидных структур мембран, что повышает их устойчивость при глубоком замораживании.
Другие исследователи в качестве защитного ингредиента среды применяли поверхностно-активное вещество лаурил- сульфонат натрия и этаноламина (ОЭП). Эффективное действие ОЭП возможно лишь в сочетании с желтком. Предполагают, что ОЭП эмульгирует липиды желтка, увеличивая их нужную кон- центрацию.
Криопротекторы. Криопротекторы необходимы для кон- сервации в жизнеспособном состоянии и стабилизации в средах молекул воды, электролитов и других веществ в клетке. Меха- низмы действия криопротекторов и других консервантов сред изучены еще недостаточно. Поэтому для определения опти- мальных концентраций их в средах применяют эмпирический подход.
В качестве криопротекторов апробировано значительное число химических соединений — органические вещества, неор- ганические соли и др. В современных средах, используемых при глубоком замораживании спермы хряков, в качестве крио- протектора применяется глицерин. Он способствует мелкокри- сталлическому замерзанию среды, стекловидному замерзанию спермиев.
Однако в концентрации свыше 5 % глицерин отрицательно действует на спермии и соответственно снижает их оплодотво- ряющую способность. Выяснено, что глицерин способствует разрушению акросомы спермиев хряка, подавляет их дыхатель- ную активность и вызывает утечку ACT как до, так и после глу- бокого замораживания. Комплекс отрицательных воздействий на спермии усиливается в процессе технологии замораживания и оттаивания.
Отрицательное воздействие глицерина на спермии хряка за- висит не только от его концентрации, времени и температуры экспозиции, но и от нестабильности осмотического давления в процессе замораживания и оттаивания. Так, в исследованиях
J. Wilmut et al. оплодотворяемость спермы, выдержанной с 10 % глицерина при температуре плюс 5°С продолжительностью 5 ч, составляла 71 %, при температуре 20°С в течение 30 мин – 73 %, а при аналогичной температуре продолжительностью 6 ч оплодотворяемость свиноматок снижалась до 35 %. Оптималь- ная концентрация глицерина в среде при замораживании со- ставляет 4–5 %, которая сохраняет подвижность спермиев после оттаивания и снижает оплодотворяющую способность их вследствие повреждений акросомы. Снижение концентрации или отсутствие глицерина в среде ухудшает подвижность отта- янной спермы и оплодотворяющую способность маток.
Идентичные результаты получены в опытах Н. Корбан и др., где отмечалось снижение активности акросомальных фермен- тов при содержании глицерина в среде для замораживания спермы более 3 %. Однако максимальное увеличение подвиж- ности и выживаемости замороженно-оттаянных спермиев отме- чается при оптимальной концентрации глицерина в среде 5–6
%. Известны и технологии замораживания спермы хряков с удовлетворительными результатами по оплодоворяемости сви- ней без глицерина. Если в опытах одних исследователей высокая оплодотворяемость свиноматок была получена при использова- нии замороженной спермы с желтком и ОЭП (46 %), то в других
— с применением спермы, замороженной с 1%-ным глицерином (58 %).
Учитывая отрицательное воздействие глицерина на функ- циональное состояние спермы хряков, ведется поиск новых бо- лее эффективных криопротекторов. Так, при сравнительном ис- пытании 11 криопротекторов лучшим оказался глицерин.
Введение в среду с глицерином диэтиленгликоля или эти- ленгликоля не превышало ее криозащитных свойств. По другим источникам, эритриол в концентрации 1–1,5 заменял глицерин с аналогичными криопротективными свойствами среды. Однако в дальнейших своих исследованиях авторы заменили эритриол на глицерин, что, по-видимому, объясняется случайными результа- тами.
Установлено, что совместное применение глицерина с NN- ди-метилацетамидом в сочетании 1:1 было эффективнее, чем одного глицерина. В исследованиях других авторов глицерин обладает значительно лучшими криозащитными свойствами,
чем ДМСО, а совместное их использование было эффективнее, чем одного глицерина. Утечка ACT из спермиев при глубоком замораживании была аналогичной как при отдельном использо- вании криопротекторов глицерина, ДМСО, так и при их сочета- нии.
Из множества компонентов, связывающих воду, криозащит- ным действием обладали 1,3-бутанедиол, 1,4-бутанедиол, 2,3– бутанедиол, глицерин, ДМСО, диэтиленгликоль, 1,5-пентадиол, 1,2–пропанедиол, триэтиленгликоль, этиленгликоль. Однако лучшим из них был глицерин. В других опытах при сравнении 79 полимерных добавок защитным действием обладали лишь 5. А криозащитное их действие более эффективно усиливалось сочетанием с глицерином. Следует отметить, что из множества испытанных компонентов наиболее сильным криопротектив- ным действием обладает глицерин.
Есть предположение, что осмотическое действие глицерина способствует разрушению половых клеток в процессе оттаива- ния замороженной спермы. В процессе замораживания спермы глицерин из среды проникает в их структуры, что способствует выравниванию вне- и внутриклеточной осмотической концен- трации их. При ускоренном разбавлении оттаянной спермы изо- тонической средой или секретами половых путей самки после осеменения возможен выход глицерина из половых клеток, ко- торые оказываются в гипотонической среде, вследствие чего подвергаются разрушительному действию. Кроме того, гипото- ния отрицательно воздействует на структуру и метаболизм по- ловых клеток хряка.
Добавка глицерина в среду в концентрациях 0, 1, 2, 3, 4 и 5 % сохраняет подвижность оттаянных спермиев соответствен- но 5, 8, 16, 23, 25 и 22 %, а оплодотворяемость яйцеклеток соот-
ветствовала 18, 27, 50, 15, 8 и 21 %. Следовательно, повышение концентрации глицерина в среде (4 %) при глубоком заморажи- вании хорошо сохраняет подвижность (25 %) и снижает опло- дотворяющую способность спермиев хряка. Отсутствие глице- рина или низкая его концентрация в среде уменьшают оба эти показателя. Оптимальная концентрация глицерина в среде по подвижности и оплодотворяемости составляет 4 и 2 %.
Низкая результативность осеменения свиней указывает на несовершенство элементов метода замораживания, что контра-
стно выявило действие разных концентраций глицерина. В опыте было установлено, что подвижность оттаянной спермы с концентрацией глицерина 5 и 7,5% была аналогичной. Следова- тельно, чем меньше контакт спермиев с глицерином перед за- мораживанием, тем выше их подвижность (I. Wiltum et al., 1973). Однако данные других исследователей показывают, что оплодотворяющая способность спермы, замороженной с глице- рином, превосходит замороженную без глицерина. Противоре- чивые результаты, возможно, объясняются несовершенством элементов метода замораживания. Кроме того, в опытах крите- рием служила оплодотворяющая способность спермы, а обще- известно, что основным показателем в ее оценке является полу- чение полноценного потомства.
Таким образом, на основании многочисленных данных ус- тановлено, что оптимальная концентрация глицерина в разбав- ленной сперме соответствует 2 %, а контакт спермиев с глице- рином должен быть минимальным.
Другие компоненты среды, применяемые для защиты спермиев. Для замораживания спермы хряков применяют казе- ин, обезжиренное молоко с пониженным содержанием жира. В качестве криопротективного компонента среды ленинградские исследователи предложили мочевину. Являясь ингибитором мо- ноаминоксидазы, мочевина препятствует окислению аромати- ческих аминокислот, выходящих из половых клеток хряка при глубоком замораживании, и образованию перекиси водорода. Кроме того, для защиты от окисления субклеточных структур спермы, а также для связывания тяжелых металлов исследова- тели использовали сульфгидрильный восстановитель – унитиол. В биологических системах в качестве регуляторов, предот- вращающих избыточное накопление перекисей, активное уча- стие принимают естественные антиоксиданты (витамины С и Е), а также сульфгидрильные соединения – глютатион, эрготио- неин, серосодержащие аминокислоты – метионин, цистеин и
цистин.
Главным свойством аскорбиновой кислоты (АК) в организ- ме является ее окислительно-восстановительная функция. Про- цесс окисления АК катализируется рядом ферментов и метал- лами, такими как оксидаза АК, являющаяся белком, содержа- щим 0,26 % меди. Кроме того в этих процессах участвуют ци- тохромоксидаза, фенолаза, пероксидаза, лактоза и др. Они осу-
ществляют прямое и непрямое окисление АК. Содержание в тканях организма восстановительной и окисленной форм АК может служить показателем активности окислительно- восстановитель-ных процессов.
Витамин Е в организме выполняет роль антиоксиданта. Ес- ли АК функционирует на уровне тканевых структур, крови, лимфы, межтканевой жидкости, то токоферол является естест- венным антиоксидантом, включенным в структуры мембран.
Известно, что витамин Е принимает прямое участие в регу- ляции окисления и переокисления, происходящих в митохонд- риях. При этом было обнаружено, что в митохондриях содер- жится НЖК-оксилазная система, активируемая АТФ, АМФ, НАД и подавляемая АДФ коферментом А, цианидом, хелатами, актиномицином. Но основным регулятором в митохондриях служит витамин Е, так как обнаружено, что скорость накопле- ния перекисей целиком обусловлена концентрацией этого вита- мина. В процессе окислительного торможения НЖК эндоген- ные токоферолы сами окисляются до токоферилхионов, и толь- ко после полного израсходования токоферолов начинается на- копление перекисей в токсических концентрациях.
В последнее время стало известно, что синергистом токофе- рола в биологических объектах является селен, который подоб- но витамину Е связан липопротеидами (альфа- и бета- фрак- циями), угнетает образование перекисей, а также играет ре- шающую роль в формировании белков и в регуляции функций клеточных мембран.
Действие селена на процессы окисления липидов, вероятно, проявляется в ингибировании ферментов тканевого дыхания (при этом витамин Е может блокировать перекиси, снижая ау- тоокисление необходимых жирных кислот). Несмотря на то, что токоферолы имеют более специфические функции в организме животных (участие в синтезе гема, окислительно- восстанови- тельных реакциях, термоидной системе), их восстановительные свойства проявляются при более высоких концентрациях, чем селена. Кроме того, витамин Е и селен, по-видимому, способст- вуют синтезу энзима или улучшают его использование клетка- ми: а) селен предохраняет от окисления не только сульфгид- рильные группы белков, мембран эритродитов, но и митохонд- рий; б) селен связан в обменных процессах и с коэнзимом А и С
коферментом А; в) определенную роль играет соединение селе- на при повышенной степени гемолиза эритроцитов.
Существует мнение, что селен и альфа-токоферол функцио- нируют в окислительно-восстановительной системе клеточных мембран. Надо полагать, что при недостатке витамина Е в орга- низме увеличивается проницаемость мембран, которые разру- шаются под действием эндогенных фосфолипаз, а вне организ- ма исчезает чувствительность мембран к действию диаллуро- вой кислоты и перекиси.
Одна из точек приложения селена в организме животных состоит во включении его в глютатион пероксидазу, которая предотвращает переокисление в результате восстановления гидроперекисей липидов или удаления низкомолекулярных пе- рекисей. Полагают, что селен в глютатионпероксидазе является активным центром. Вероятно, быстрая комплексообразующая способность фермента с перекисью водорода или липопереки- сями обусловлена наличием атома селена. С точки зрения де- зоксикации перекисей это имеет огромное значение, так как не дает продуктам переокисления накапливаться в клетках.
Нейтрализация же свободных радикалов, появляющихся при окислении, может осуществляться за счет действия вита- мина Е. Еще в 1974 г. было доказано, что наиболее эффектив- ный способ предотвращения от перекисления субстратов — применение антиоксидантов. По своему действию, являясь вос- становителями, некоторые из них проявляют ингибирующее действие на различных стадиях окисления в субстратах, другие предотвращают окисление в неокисленных продуктах.
В настоящее время имеется значительный арсенал антиок- сидантов, большинство из которых широко применяются не только в СНГ, но и в других странах (НДГК, эфиры галловой кислоты, БОА, БОТ, ДТБК, дилудин и др.).
Повысить ингибирующее действие антиоксидантов можно с одновременным применением синергистов — винной, лимон- ной кислоты, малеиновой, фосфорной и фумаровой кислоты, а также сульфата натрия, ЭДТА и др. Они восстанавливают анти- оксиданты благодаря более высокому окислительно- восстанови-тельному потенциалу и ингибируют проксиданты. Наиболее сильным действием по отношению к другим ком- плексообразователям отличается ЭДТА.
Таким образом, одним из факторов, нейтрализующих воз- можное вредное действие перекисей на половые клетки, на их устойчивость при глубоком охлаждении, могут стать различные редуцирующие вещества и антиоксиданты.
Основные факторы криогенных повреждений половых клеток при глубоком охлаждении спермы. Достижения крио- биологии в последнее время позволяют понять механизм крио- генных повреждений клеток. Два интервала температур опреде- ляют физико-химические воздействия: охлаждение до затверде- вания и ниже температуры затвердевания.
Неблагоприятные факторы воздействий охлаждения на по- ловые клетки с отрицательными последствиями называют холо- довым ударом. Он возникает при быстром охлаждении спермы до 0°С и выражается в утрате подвижности у значительной час- ти половых клеток, в появлении у них морфологических изме- нений. Установлена аналогичная картина при быстром падении у них осмотического давления. Физико-химические процессы, происходящие при холодовом ударе, получили свое объяснение в теории В.К. Милованова и И.И. Соколовской (1959). Согласно этой теории, глубокие и необратимые изменения в спермиях происходят вследствие затвердевания фосфолипидов, находя- щихся в спермиях в виде тугоплавкого плазмалогена.
В последние годы было установлено, что затвердевание фос-фолипидного слоя биомембран является ничем иным, как пусковым фактором для других повреждений. У значительной части биообъектов затвердевание фосфолипидного слоя био- мембран происходит в интервале температур от 25 до 5°С.
Другие исследователи объясняют механизм и явления холо- дового удара по-разному. Предполагают, что быстрое охлажде- ние клеток вызывает желатинизацию золей их протоплазмы, за которой наступает сжатие гелия и выделение воды с последую- щей гибелью клеток. Ж. Солбери и др. выявили повышение в свежеполученной сперме концентрации ионов калия внутри спермиев, а также ионов Na и Са в плазме. Все это способствует проницаемости клеточной мембраны вследствие активного пе- реноса ионов. Было установлено разрушение клеточной мем- браны вследствие температурного шока, что способствует гибе- ли клеток. При этом концентрация ионов Са и Na в плазме спермы понижается, а ионов К – повышается.
Для предотвращения холодового удара В. И. Белькевич и др. (1959) вводили в разбавитель хелатные вещества, которые свя- зывали ионы кальция. Однако эта попытка была безуспешной. Хотя отмечалось повышение устойчивости спермиев к холодо- вому удару, что объясняется возрастанием стабильности плаз- матической мембраны половых клеток вследствие воздействия комплексонатами. Другие исследователи установили нарушение целостности клеточной оболочки и выход из протоплазмы в плазму значительного количества белков и аминокислот.
Фазовый переход липидов возможен в структуре мембран с образованием кластеров. Это короткоживущие образования близлежащих липидных молекул с характерным координиро- ванным движением. Кластеры возникают при приближении температуры к зоне фазового перехода липидов. Например, в биослоях диолеиллецитина при температуре 30°С кластеров нет, а при 2°С они представляют 50 % липидной массы.
В.К. Милованов и др. (1981), изучая механизм защитного действия кальциевого и магниевого соединений ЭДТА на спер- мии, испытали действие разных концентраций парамагнитного иона ферроцианида на ширину спектра ЭПР. Было установлено, что увеличение компонентов возможно лишь в том случае, ко- гда парамагнитные ионы проникают в ту часть структуры, где находится зонд. Ими установлено, что при средних величинах концентрации ферроцианида уширение компоненты больше в спермиях, глубокозамороженных в среде с комплексонатами. По-видимому, наличие ионов кальция и магния обеспечивает лучшее проникновение ферроцианида к зонду в липомембраны. Это означает, что свободные двухвалентные катионы образуют с карбоксильными группами белков и сиаловых кислот на по- верхности мембран слабодиссоциирующие соединения, ней- трализуя отрицательный заряд. Учитывая, что ферроцианид яв- ляется анионом, то ослабляется или устраняется препятствие для его проникновения в липиды мембран и взаимодействия с радикалом-зондом. Кроме того, сильное разупорядочивающее действие синтетической среды с комплексонатами кальция и магния указывает на наличие связи между поверхностным за- рядом и параметром упорядоченности мембранных липидов. Это объясняется тем, что значительная масса липидов мембран состоит из фосфолипидов, в состав которых входят холин, эта-
ноламин и другие органические основания. При этом гидро- фильный конец молекул заряжается положительно. Отрица- тельный поверхностный заряд, притягивая положительно заря- женные гидрофильные концы молекул, ориентирует их в плос- кости мембраны строго радиально, создавая жесткую жидкок- ристаллическую структуру. Потеря или снижение поверхност- ного заряда ослабляет натяжение липидных молекул и позволя- ет им за счет межмолекулярного взаимодействия принять более хаотическую структуру и придать в целом липидному слою бо- лее аморфное состояние.
Установлено, что оптимум рН среды при замораживании спермиев находится в зоне кислой реакции. Дополнительно бы- ло установлено, что при охлаждении рН спермы смещается в щелочную сторону вследствие неравномерного подавления кон- стант диссоциации кислот и щелочей, соли которых являются составной частью половых клеток. Таким образом, охлаждение половых клеток является фактором, повышающим упорядочен- ность мембранных липидов, которые повышают чувствитель- ность их к охлаждению.
В научно-производственных опытах на спермиях было ус- тановлено криоповреждение – разрушение белково- холестерино-вых комплексов. Кроме того, изменение скорости химической реакции Са-зависимой АТФ-азы не происходит без липидов и переход в кластеры липидов ингибирует ее, что не исключает нарушения функции избирательной проницаемости. С повышением температуры затвердевания липидов мембран усиливается противоречие между обменными процессами в клетке, так как выключаются функции мембран. В липидном слое мембран лецитин способствует снижению температуры плавления липидов мембраны. Снижается температура фазово- го перехода при увеличении количества в липидных компонен- тах холестерина, так как он оказывает влияние на упаковку фосфолипидов в мембране. Выяснено, что добавка холестерина в среду способствует выживаемости спермиев хряка при 0°С.
Защитное действие при холодовом ударе связывают в ос- новном с липопротеидами желтка. Сказанное не противоречит тому, что их защитное действие связано с лецитином. Однако связанные с лецитином белки могут облегчить проникновение его в липидный слой мембран. В.И. Белькевич и др. защитное действие желтка объясняют, по-видимому, связыванием ионов
кальция, которые освобождаются в корковом слое спермиев при резком понижении температуры до 0°С. Ф.И. Осташко указан- ный эффект объясняет свойством желтка создавать адсорбцион- ный слой на поверхности клетки и этим способствует уменьше- нию проницаемости оболочки спермиев, вследствие чего пре- дохраняет их от вредного действия концентрационного гради- ента.
Таким образом, существующие гипотезы и современные ис- следования, проведенные на молекулярном уровне, еще раз подтверждают мысль о важном значении затвердевания липи- дов в механизме повреждения спермиев, что подтверждает тео- рию холодового удара В.К. Милованова и И.И. Соколовской. Существующие теории явлений холодового удара в свете со- временных достижений криобиологии дополняют эту теорию или детализируют ее. Л. Тейльбрун утверждает, что важное ме- сто в механизме повреждения спермиев занимают нерегулируе- мое проникновение Са++ во внутренние слои клетки и перевод внутреннего содержимого из золя в гель, что является послед- ствием повреждения структуры и функции мембран.
Ф. И. Осташко холодовой удар объясняет с позиций осмо- тических явлений. При охлаждении спермы половые клетки имеют значительно выше температуру за счет внутренних и биохимических реакций, чем окружающая среда, вследствие чего они испытывают явление гипотонии.
Быстрое охлаждение спермы вызывает разобщение дыхания и фосфорилирования. При этом потребление кислорода мито- хондриями увеличивается, а АТФ не вырабатывается. У спер- миев этот процесс необратим, а в соматических клетках обра- тим, то есть после прекращения охлаждения фосфорилирование восстанавливается. Точный биохимический механизм указанно- го явления неизвестен. По-видимому, начальным пусковым фактором является затвердевание липидов мембран, а посколь- ку внутриклеточные ферменты выполняют фосфорилирование в митохондриях, функционируют лишь после присоединения к нерастворимым компонентам мембраны, в случае их разъеди- нения и растворения катализ утрачивается.
Таким образом, теория холодового удара В.К. Милованова и И.И. Соколовской (1959) заключается в следующем: затверде-
вание липидов мембран является главным пусковым моментом изменений и повреждений при снижении температуры.
Основной фактор криогенных повреждений биологических объектов ниже 0°С – кристаллизация воды и возникновение при этом гипертонической концентрации растворенных веществ. Большую опасность для биообъектов представляет образование внутриклеточных кристаллов при резком охлаждении.
По-видимому, наиболее эффективно медленное охлаждение, при котором клетки определенное время находятся в гиперто- нической среде, разрушительное действие которой очевидно. Поэтому при глубоком замораживании спермы разработан оп- тимум скорости охлаждения, где до предела сведено повреж- дающее действие гипертонии, вследствие чего исключается внутриклеточная кристаллизация.
При замораживании спермы существуют одновременно следующие формы затвердевания: кристаллизация и витрифи- кация (стекловидное затвердевание). Контролируя процесс за- твердевания флюорохромированной спермы с помощью люми- нисцентного микроскопа, было установлено, что при росте кри- сталлов спермии оттесняются в зону витрификации.
Кроме отрицательного действия кристаллизации криоген- ные повреждения также вызываются разным тепловым расши- рением при неодинаковой степени гидратированных соседних структур при охлаждении ниже 4°С. Общеизвестно, что вода, связанная с белками, в отличие от свободной при охлаждении ниже 4°С не расширяется. Поэтому коэффициент теплового расширения структур зависит лишь от содержания в ней сво- бодной воды.
При глубоком замораживании спермы половые клетки ми- нимальное время находятся в условиях высокой концентрации растворенных веществ, вследствие чего и проявляется действие. Проведенные исследования с применением ЭПР-спиновых зон- дов показывают, что объем спермы уменьшается в процессе технологии ее замораживания наполовину, что объясняется по- терей воды под действием гипертонической концентрации. В более ранних исследованиях показано, что в процессе техноло- гии замораживания, а затем оттаивания спермы некоторые структуры половых клеток значительно уменьшаются в разме- рах (В.П. Кононов), что способствует деформации мембран.
При разделении липидов понижается механическая прочность липидного слоя, вследствие чего деформация мембран является основной причиной механических повреждений (А.М. Белоус и др.).
Кроме того, гипертония растворенных веществ в среде влияет на состояние мембран, она разрушает липопротеиновые соединения. Причину действия связывают с концентрационным эффектом электролитов. Отрицательное действие гипертонии связано с их влиянием на белковые компоненты. При этом бел- ки могут денатурировать и выпадать в осадок. Растворимость других белков, наоборот, увеличивается, так как отдельные в нормальных условиях гидрофобные структуры могут раство- ряться в воде.
Исследованиями установлено, что некоторые ферменты спермы в процессе замораживания, а затем оттаивания снижают свою активность, а другие, наоборот, повышают ее. Например, активность фосфолипазы А2 возрастает, что объясняется физи- ко-химическими условиями, создающимися при заморажива- нии, что ведет к диссоциации комплекса фермент-ингибитор. Активизация фосфолипаз в процессе замораживания спермы будет способствовать окислению липидов с образованием лизо- децитина.
Таким образом, при глубоком замораживании спермы на половые клетки действуют физические, химические и другие разрушительные факторы, вызывая их повреждения на молеку- лярном и субмолекулярном уровнях.
Подготовка спермы к замораживанию. Сперму в процес- се технологической обработки перед замораживанием выдер- живают при плюсовых температурах в течение определенного периода времени, параметры которых варьируют. Так, имеются сообщения об эффективности инкубации свежеполученной спермы при комнатной температуре продолжительностью 2 ч перед разбавлением и замораживанием. С целью охлаждения спермы до комнатной температуры были использованы вакуум- ные термостаты.
Изучая влияние аэробной выдержки спермы на устойчи- вость к холодовому удару, ученые установили, что инкубация неразбавленной спермы при температуре 24–26°С от 1,5 до бо- лее 7 ч по сравнению с 15-минутной выдержкой перед разбав-
лением и охлаждением сохраняла акросомы и улучшала под- вижность спермиев при 5°С. Выдержка свежеполученной спер- мы при 30°С продолжительностью 2,5 и 4,5 ч увеличивала ус- тойчивость акросом к холодовому удару при 0, 5, 10 и 15°С в течение 10 мин. Установлено, что плазма является протектором против холодового удара. Общеизвестно, что густая фракция спермы менее восприимчива к холодовому удару, чем свежепо- лученная.
Эффективность инкубации свежеполученной спермы перед разбавлением продолжительностью 1–2 ч подтверждена многи- ми исследователями. Еще в ранних своих работах Л. Морозов (1938) доказал, что повышенная чувствительность спермиев к явлению холодового удара исчезает спустя некоторое время по- сле эякуляции.
Однако в более поздних работах Н. Moore et al. (1976–1977) доказано, что в процессе эякуляции со спермиями связываются протеины пузырьковидных желез, способствующих разруше- нию мембран спермиев при охлаждении. Замораживая сперму от интактных хряков и от хряков с удаленными пузырьковид- ными железами с разными средами, установили, что оплодо- творяемость спермы от хряков с удаленными железами выше (35 %), чем спермы интактных производителей (29 %). Это по- служило основанием авторам в дальнейших своих работах за- мораживать сперму хряков без секретов пузырьковидных желез. В.П. Кононов (1984) установил, что плазма спермы хряков обладает криопротективным действием на половые клетки, что объясняется ее высокомолекулярными компонентами. Они, ад- сорбируясь на половых клетках, изменяют липиды мембран, вследствие чего при замораживании их затвердение аморфно и, видимо, оказывает незначительное разрушающее воздействие
на мембраны.
Плазма спермы хряка усиливает обменные процессы поло- вых клеток и значительно сокращает их функционирование. Было изучено действие на них окислительно-восстановительно- го режима в процессе технологической обработки при замора- живании спермы. Анаэробные условия достигают откачиванием воздуха с последующим насыщением одного из инертных газов (азотом, водородом, гелием). Инкубация спермы при темпера- туре 16–20°С в анаэробных условиях вызвала устойчивость по-
ловых клеток к холодовому удару и глубокому замораживанию. Оптимум инкубации спермы – 4–6 ч в атмосфере водорода (Э. Хачапуридзе, 1984, 1975; В.К. Милованов и др., 1977). Ав- торами предложено свежеполученную сперму сразу насыщать водородом.
Разбавленную сперму заливают в бутылку емкостью 500 мл до половины объема, закрывают нетоксичной резиновой проб- кой с длинной и короткой трубками. Затем к одной из трубок подключают вакуумный насос, которым откачивают воздух до
«вскипения» спермы, трубку перекрывают зажимом. Бутылку переворачивают пробкой вверх и, открыв второй краник, мед- ленно впускают водород и закрывают краник. Емкость со спер- мой помещают в темное место и инкубируют при комнатной температуре 4–6 ч.
Анаэробиоз снижает обменные процессы в спермиях, что соответственно увеличивает их устойчивость к холодовому уда- ру, образованию лизолецитина и препятствует окислению суб- клеточных мембран спермиев.
Для регуляции окислительно-восстановительного режима спермы хряков перед ее замораживанием можно также вводить в среду липидные антиоксиданты. Существуют различные спосо- бы концентрирования спермиев: фильтрация, отстаивание и др.
С целью подготовки спермы к глубокому замораживанию для ее концентрирования чаще применяют центрифугирование при 700 g продолжительностью 10 мин. Ленинградскими иссле- дователями установлено, что указанная обработка свежеполу- ченной спермы не влияет отрицательно на оплодотворяемость. После центрифугирования свежеполученной спермы ее ресус- пендировали и разбавляли средой ГХЦЖКУМ в два раза и по- лучали 100 % опоросов при многоплодии 13,5 поросят. А уда- ление плазмы центрифугированием и замена ее аналогичным объемом среды ГХЦЖКУМ снижает оплодотворяющую спо- собность на 30 % и многоплодие на 21 %.
Таким образом, центрифугирование свежеполученной спермы не оказывает отрицательного влияния на ее оплодотво- ряемость. Однако центрифугирование при пониженных темпе- ратурах может оказывать на половые клетки повреждающее воздействие. Поэтому предварительно перед центрифугирова- нием сперму необходимо разбавлять средой с дисахарами, что
снижает отрицательное действие на половые клетки центро- бежной силы.
В.П. Кононов, А.Г. Нарижный выяснили оптимальные усло- вия центрифугирования, которые не зависели от состава среды, степени разбавления и других факторов и соответствовали 600 g продолжительностью 10 мин. Установлено, что максимальная выживаемость спермиев достигается в том случае, если цен- трифугированию подвергают предварительно разбавленную сперму при температуре 4–15°С.
Концентрирование спермиев с помощью центрифугирова- ния отрицательно действует на подвижность оттаянной спермы. К. Левиным (1976) был использован прием блокады выделения секретов добавочных половых желез перед эякуляцией атропи- ном. Это способствует выделению лишь содержимого эпиди- димиса, а концентрация спермиев достигает 1 млрд/мл и более. Было установлено, что замораживание спермы, полученной указанным путем, не влияет отрицательно на устойчивость по- ловых клеток.
Н. Корбан и др. предложили прием концентрирования спер- миев – отстаивание их в длительной воронке и охлаждение до 0°С. При этом в 2/3 части надосадочной жидкости теряется до 30 % спермиев. Производственное испытание метода показало хорошую результативность: было получено 70,6 % опоросов с величиной гнезда 9,1 поросенка. Однако имеются противоречи- вые данные, свидетельствующие о том, что ускоренное оседа- ние отражает отрицательные изменения в метаболизме сперми- ев, а медленное – их функциональную полноценность.
Получают концентрированную сперму также с помощью мануального (ручного) способа. После проявления полового рефлекса на чучело на кисть руки надевают разовую перчатку и массируют конец штопорообразного пениса. Во время эякуля- ции собирают в спермоприемник лишь густую фракцию спер- мы, а секреты уретральных и добавочных желез удаляют. Кон- центрация спермиев достигает 0,9 млн/мл и более.
Имеются сведения, что с увеличением степени разбавления повышается чувствительность спермиев к холодовому удару, что важно учитывать при подготовке спермы к глубокому замо- раживанию. Поэтому при концентрировании спермы для замо- раживания ее следует разбавлять минимальным объемом среды.
В связи с этим Н. Буга и др. (1978) предложили растворять ком- поненты среды в желтке куриного яйца.
На результативность глубокозамороженной спермы оказы- вают влияние режим ее охлаждения, состав среды, наличие плазмы и другие факторы. Выяснено, что при медленном (0,125°С/мин) охлаждении спермы от 30 до 0°С улучшается со- хранность липидов, чем при быстрой (3°С/мин) скорости охла- ждения. Достоверны различия, отмеченные в содержании фер- ментов кардиолипина и фосфатидилхолина. Режим оптимально- го охлаждения спермы от 30 до 15°С для стабилизации фосфо- липидов соответствует 4 ч.
Оптимальные режимы охлаждения и техника замора- живания спермы. Опытами В. К. Милованова (1962) было ус- тановлено, что инкубация спермы при температуре 16–20°С продолжительностью 1–2 ч с последующим быстрым охлажде- нием до 0°С повышает устойчивость спермиев. Позднее это бы- ло подтверждено на сперме хряка: 4–6-часовая инкубация при комнатной температуре не снижала подвижности после быстро- го ее охлаждения до 0°С.
В.П. Кононовым (1980) было выяснено положительное дей- ствие инкубации на сохранность подвижности и структуры ак- росомы спермиев при криоконсервации.
Другими исследователями также было установлено, что вы- держка способствует устойчивости спермиев хряка при быст- ром охлаждении до 0°С. Однако стабилизирующее действие выдержки усиливается при повышении температуры от 0 до 30°С при экспозиции от 0,5 до 4,5 ч. На устойчивость спермиев оказывает воздействие и состав среды. Максимальная сохран- ность акросом после воздействия холодового удара была после выдержки в трислактозной среде и в изотонических растворах цитрата и хлористого натрия. Слабое воздействие на устойчи- вость отмечалось в глюкозобикарбонатной среде и почти не от- мечалось в среде ИВТ.
Было установлено, что положительное действие инкубации при температуре 30°С усиливается, если продлить ее срок до 7,5 ч. При этом важное значение имеет рН среды, оптимум ко- торого соответствовал 6,6. При смещении реакции среды в ще- лочную сторону (рН 8,3) выдержка почти не предотвращала разрушения акросом при воздействии холодового удара с со- хранением подвижности.
Укрепляющее действие выдержки зависит от наличия в сре- де сахаров. Например, ди- и трисахариды защищали акросомы спермиев более эффективно, чем моносахариды, а кетосахара более эффективно, чем альдегидосахара. Хотя и установлено, что сахара обладают протективным действием при выдержке на подвижность спермиев от холодового удара, но это не оказыва- ло действия на сохранность акросом. При этом отмечалось улучшение подвижности после инкубации в среде с раффино- зой, а сохранность акросом – в среде с сахарозой.
Выяснено, что выдержка спермы при температуре 24–26°С продолжительностью 6 ч повышает устойчивость спермиев как при воздействии холодового удара, так и при хранении при тем- пературе 5°С, а часовая инкубация при комнатной температуре повышает оплодотворяемость спермы, сохраненной при темпе- ратуре выше 0°С. Другие исследователи в технологию замора- живания спермы хряка включали выдержку ее в течение 4 ч при температуре 15°С.
В следующих опытах охлаждение спермы с 25 до 5°С в те- чение 2,5 ч способствовало повышению выживаемости на 13,5 % по сравнению с 5-часовой инкубацией. Если сначала до- казано положительное действие выдержки на устойчивость спермиев при охлаждении спермы, то более поздние исследова- ния показали, что сохранность их акросом при глубоком замо- раживании не зависела от времени охлаждения (1,2–4 ч) при температуре от 30 до 0°С.
В.П. Кононов (1982) исследовал действие режима обработ- ки спермы и времени введения глицерина на устойчивость спермиев при замораживании и оттаивании. Им установлено, что выживаемость спермиев по структурным и функциональ- ным изменениям не зависела от времени введения его в сперму: до или после его инкубации при температуре плюс 15°С перед замораживанием. Кроме того, выдержка спермы перед замора- живанием в течение 2 ч при температуре 15°С или 3 ч при плюс 5°С аналогично повышала выживаемость спермиев.
Известно, что контакт спермиев с секретами половых желез активно адсорбирует катионные белки, которых много содер- жится в секрете пузырьковидных желез. Адсорбция их способ- ствует нейтрализации поверхностного отрицательного заряда, который создается диссоциацией карбоксильных групп белков и
сиаловых кислот. Это вызывает разупорядочивание мембран- ных липидов, что в целом способствует их прочности. Проти- воречивость полученных результатов, по-видимому, объясняет- ся разными условиями инкубации как в присутствии, так и в от- сутствии естественной плазмы.
В эффективности глубокого замораживания важную роль играет скорость падения температуры при криоконсервации спермы, что зависит от состава среды, концентрации криопро- тектора, объема спермы и других факторов.
W. Baier (1982) впервые получил поросят от глубокозамо- роженной спермы с применением медленного режима ее охла- ждения. Ряд исследователей установили, что ускоренный отвод тепла при медленном режиме замораживания спермы отрица- тельно действует на выживаемость половых клеток. Поэтому стабильные опоросы от глубокозамороженной спермы стали получать только после применения быстрого охлаждения.
Если глубокое охлаждение проводить при температуре от 5 до минус 196° в течение 2–3 мин, подвижность спермиев будет 66 %, а при увеличении этого периода до 30–40 мин – лишь 27 %. Кроме того, В.П. Кононовым и др. установлено, что чем ниже температура до переохлаждения спермы, тем ниже выжи- ваемость спермиев. Повышение выживаемости половых клеток наблюдалось в тех случаях, когда избегали переохлаждения. Отрицательное действие переохлаждения, по-видимому, объяс- няется тем, что независимо от режима замораживания кристал- лизация наступает быстро вследствие сверхбыстрой отдачи теп- ла при кристаллизации переохлажденной жидкостью. Это мо- жет вызвать внутриклеточную кристаллизацию, которая крайне нежелательна.
Режим быстрого замораживания спермы предусматривает использование сухого льда при охлажденной фторопластовой пластины в течение 2–3 мин. При этом исключается переохлаж- дение, так как на границе соприкосновения спермы с холодной поверхностью вследствие большого перепада температур еще до начала образования кристаллизации в сперме появляется прослойка льда, которая служит затравкой при последующем затвердевании. Если сперму замораживают гранулами, то ре- жим охлаждения регулируют изменением их объема. В опытах было установлено, что с уменьшением объема замораживаемых
гранул увеличивается подвижность оттаянной спермы. Однако при осеменении свиноматок спермой, замороженной с разным объемом гранул (0,1–1,0 мл), было получено одинаковое число опоросов. В опытах других исследователей также было под- тверждено, что выживаемость спермиев после замораживания на блоках сухого льда не зависела от объема гранул (0,1–0,5 мл) или 0,09, 0,18, 0,27 мл.
Большинство технологий криоконсервации (белтсвильская, ВИЖ, шведская и др.) предусматривает быстрое замораживание с использованием в качестве хладоагента блоков двуокиси угле- рода (минус 79°С) с дальнейшим хранением спермы в жидком азоте. Преимущество последней технологии в том, что жидкий азот менее токсичен, чем сухой лед, имеется возможность для создания более стерильных условий и значительно шире ис- пользовать диапазон температуры замораживания.
Н. Корбан и др., исследуя комплекс физиологических и био- химических показателей спермы в зависимости от применения хладоагента, установили, что сперму, разбавленную в трис-Nа- ЭДТА среде, необходимо замораживать на блоках сухого льда, а в ГХЦЖКУМ среде — на фторопластовой пластине, охлажден- ной в парах жидкого азота при температуре минус 85°С. При- менение в качестве криоагентов для замораживания льда с ГХЦЖКУМ средой и паров жидкого азота с трис-Nа-ЭДТА сре- дой было неоправдано. Следовательно, проведенные исследо- вания свидетельствуют о необходимости в любом случае подхо- дить к выбору оптимального хладоагента и режима заморажи- вания.
В.П. Кононовым в соавт. (1983) для замораживания спермы хряков было сконструировано специальное устройство, позво- ляющее создавать поточную систему замораживания спермы хряков.
Оттаивание спермы хряка. Впервые получено потомство от глубокозамороженной спермы хряка (W. Baier, 1962), где па- кеты с криоконсервированной спермой оттаивали в ледяной во- де. При этом кристаллы льда в сперме плавились медленно, вследствие чего половые клетки длительное время находились в гипертонической среде. По-видимому, во всех других исследо- ваниях применяли быстрое нагревание, где температура тепло-
носителя значительно превышала точку плавления жидкой фазы спермы (В. П. Кононов и др., 1973).
Известно, что способ и скорость оттаивания глубокозаморо- женной спермы имеют важное значение, как и скорость замора- живания для сохранения ее жизнедеятельности. Выявлено, что при оттаивании замороженной спермы повреждаются клетки вследствие развивающихся процессов рекристаллизации, дегид- ратации и воздействия гипертонических солей. Чем выше ско- рость нагрева спермы, тем меньше размеров бывают кристаллы льда. Однако медленное повышение температуры приводит к повреждению половых клеток в замороженной сперме при бы- стром режиме. Таким образом, при быстром режиме заморажи- вания спермы необходимо применять быстрый нагрев и наобо- рот.
С изменением температуры от минус 196°С до минус 80°С скорость нагрева незначительно влияет на сохранность сперми- ев, а от минус 80°С до 0°С — оказывает более сильное влияние. Однако опасной критической зоной при оттаивании заморожен- ной спермы является диапазон температур от минус 50°С до 0°С (А. Бугров и др., 1977). Рекристаллизацию половых клеток можно уменьшить применением криопротекторов, а воздейст- вие гипертонических растворов солей — повышением скорости оттаивания. Однако параметры температур от 45 до 90°С не- безопасны для перегрева жидкой фазы спермы.
Отечественные и зарубежные исследователи для оттаивания спермы применяют сухой способ: стакан или колбы, подогретые до 40°С с дальнейшим разбавлением средой и нагреванием до требуемой температуры. Ряд других авторов применяют для от- таивания замороженной спермы подогретую среду. Преимуще- ство этого способа оттаивания в том, что замороженная сперма сохраняется при минус 190°С в концентрированном виде, а при оттаивании одновременно происходит ее разбавление, процесс оттаивания спермы происходит быстрее, значительно повыша- ется выживаемость спермиев.
Для оттаивания гранулированной спермы В.П. Кононов и др. (1975) предложили специальное устройство, обеспечиваю- щее быстрый подвод тепла и отделение образующейся жидкой фазы от твердой. При использовании данного способа оттаива- ния спермы было получено 66 % опоросов. Скорость оттаива-
ния замороженной спермы сухим способом и в подогретой сре- де равна 80°С в 1 мин, а в устройстве – 100–120°С в 1 мин. Этот оптимальный режим оттаивания предотвращает повреждающее действие гипертонических растворов солей. Л. Мороз и др. (1985) показали, что при оттаивании спермы в устройстве с температурой 42°С подвижность и выживаемость половых кле- ток в концентрированной сперме была выше, чем с применени- ем других способов оттаивания.
Снижение температуры спермы от минус 196 до минус 80°С не оказывает отрицательного действия на ее выживаемость. Для увеличения скорости оттаивания спермы V. Pursel et al. (1974) предложили двухступенчатый режим оттаивания. Заморожен- ные гранулы помещали в пенопластовую коробку при темпера- туре 16–20°С и выдерживали в течение 1,5; 3,0 и 4,5 мин с по- следующим перенесением в теплую среду (50°С). Установлено, что предварительный отогрев гранул продолжительностью 3 мин снижает время оттаивания в теплой среде более чем на 50 % и повышает число спермиев с нормальными акросомами с 48 до 65 %, а подвижность – с 28 до 50 %. А Курбатов и др. от- мечают, что предварительный отогрев гранул от минус 196 до минус 80°С в термокриостате с дальнейшим оттаиванием в уст- ройстве при температуре 45°С усилило время оттаивания более чем в два раза и улучшило физиологические и биохимические показатели спермы.
Сперму, криоконсервированную по японскому методу, от- таивают, погружая пакеты в воду при 43–45°С, а замороженную по хюльзенбергскому методу — при температуре 50°С до пол- ного оттаивания содержимого.
Оплодотворяемость глубокозамороженной спермы не кор- релирует с ее активностью после оттаивания. Это зависит от то- го, что сперма хряка не всегда и не полностью выводится из со- стояния анабиоза. По данным В. К. Милованова и др., оксиген- ция оттаянной спермы повышает результативность осеменения маток почти в два раза.
Для разбавления оттаянной спермы хряков испытано мно- жество различных биологических жидкостей (молоко, обрат, плазма спермы) и синтетических сред (табл. 180).
Широкое применение получили среды БТС и ОЛЕП, состав которых приближен к нативной плазме спермы. Однако резуль-
таты испытания биологических жидкостей и сред разнообраз- ны. Так, в опытах замороженную концентрированную сперму в TES-Na-K-глюкозо-желточном разбавителе оттаивали в нагре- тых разных жидкостях (плазма спермы, обрат, плазма спермы+ обрат, фильтрат плазмы спермы), где наилучшие результаты по- лучены при использовании спермы и обрата.
Таблица 180
Дата добавления: 2019-07-17; просмотров: 189; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!