Иммуноферментный анализ. Принцип. область применения
Одним из наиболее часто используемых методов в клинической и экспериментальной биохимии, вирусологии, микробиологии, иммунологии, ветеринарии, контроле технологии производства в медицинской и микробиологической промышленности, охране окружающей среды является в настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты также выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы.
Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу коньюгата (антивидовото иммуноглобулина, меченного ферментом). Фермент вызывает разложение хромогеного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически.
Существует множество вариантов постановки ИФА. из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции.
Самым распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция – процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также с помощью образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые вые планшеты или полистироловые шарики.
|
|
|
Для ферментативной метки конъюгата могут быть применены разнообразные ферменты: поероксидаза хрена, щелочная фосфатза, бета-галактозидаза, глюкозооксидаза. Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного анализа. Принципиальная схема твердофазного неконкурентного иммуноферментного анализа состоит их нескольких стадий.
Стадия 1. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, и если в ней есть антитела (эти антитела называются первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело .
Стадия 2. После отмывки лунок от не связавшихся (а значит неспецифичных) субстанций в каждую лунку добавляются так называемые вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IqA, IqG, IqM). К этим вторым антителам химически пришит активный фермент. Такое комплексное соединение называется конъюгат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа«сэндвич.
|
|
|
Стадия 3. После отмывки не связавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент . В результате субстрат превращается в окрашенный продукт. Количество окрашенного продукта измеряется на фотометре при определенной длине волны.
Таким образом, количество цветного продукта прямо пропорционально количеству фермента в лунке, а значит и количеству конъюгата в «сэндвиче». Количество конъюгата прямо пропорционально тому количеству комплекса антиген — антитело, которое получается на стадии 1 ИФА. Следовательно, измерение развившейся цветной реакции на стадии З точно коррелирует с наличием специфических антител в анализируемой сыворотке. Время проведения анализа от 1-гo до 3-х часов.
В клинико-диагностических лабораториях иммуноферментный анализ применяется для следующих целей:
- диагностика инфекционных и паразитарных заболеваний:
- диагностика ин токсоплазмоза, герпеса, хламидиаза, трихомониаза, вирусов гепатитов С и В), коревой краснухи, лямбиоза, микоплаз- ВИЧ-инфекции.
|
|
|
- определение содержания гормонов и других биологически активных веществ: лютеинизирующий гормон, фолликулостимулирующий гормон, инсулин, пролактин, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, кортизол, тиреотропный гормон, трийодтиронин, тироксин (Т4), определение цитокинов и др.;
- диагностика ранних сроков беременности;
- пренатальная диагностика пороков развития плода;
- определение онкомаркеров: альфа-фетопротеина (для печени), раково-эмбриональный антиген (для кишечника), простатспецифический антиген, нейроспецифический антиген (маркер молочной железы), Ca-125 (для яичников).
Энзимотерапия. Применение препаратов ферментов и их ингибиторов в клинической практике.
Разработаны лекарственные формы ферментных препаратов. Широко распространена заместительная терапия заболеваний жеудочно-кишечного) тракта (фестал, панкреатин, мезим-форте).
Протеазы (трипсин, химотрипсин) широко Лечении:
• воспалительных заболеваний;
• раневого процесса;
• ожогов;
• обструктивных состояний дыхательной системы.
Ингибиторы протеаз (котрикал, гордокс. трасилол. ингитрил) занимает важное место в лечении деструктивных форм панкреатита, при чрезмерной активности системы фибринолиза; ингибиторы ангиотензииконвертирующего фермента (капотен эналаприл) - - в терапии артериальных гипертензий.
|
|
|
З 9.4. Понятие об иммобилизованных ферментах иммобилизованных ферментов. Получение иммобилизованных ферментов (искусственно полученного комплекса фермента нерастворимым в воде носителем), значительно расширило сферу применения биокатализаторов. Различают иммобилизацию ковалентную и нековалентную (иммобилизацию физическими методами).
Первый тип основан на ковалентном связывании фермента нерастворимым материалом или молекул фермента между собой с образованием нерастворимых полиферментных комплексов.
Нековалентная иммобилизация включает: адсорбцию включение в гели, микроинкапсулирование; в данном случае отметается способность фермента диссоциировать на субъединицы с последующим переходом в раствор не связанных с носителем субъединиц и падением активности фермента. В этом случае приходиться прибегать к дополнительным способам стабилизации - иммобилизованных ферментов:
• использованию «поперечно сшивающих» агентов с целью наложения межсубъединичных сшивок, вследствие чего фермент теряет способность к диссоциации;
• включению ферментов в гели с подбором таких размеров ор, который был бы меньше размеров субъединиц фермента.
При применении так называемой «мягкой» адсорбционнойиммобилизации , включающей предварительную обработку адсорбента липидами, изменяющими степень его гидрофобности, при последующей сорбции фермент связывается с «мягкой» поверхностью липидного слоя, а не с жесткой поверхностью адсорбента. Искусственно связанные с носителями, “иммобилизованные ферменты, сохраняющие свою каталитическую активность, отличаются повышенной термостабильностью и устойчивостью к протеиназам, а, следовательно, увеличением времени жизни и пролонгацией действия, антигенные свойства их значительно снижены.
Ряд иммобилизованных ферментов с успехом применяется в:
• использование тампонов, бинтов с иммобилизованными на них протеазами— для ускорения заживления ран и ожогов и предотвращения гнойных осложнений;
• создание протезов кровеносных сосудов и сердечных клапанов из тромборезистентного материала на основе полимеров с иммобилизованными на них тромболитическими ферментами;
• использование иммобилизованных терапевтических белков в экстракорпоральных реакторах (уреазы, фен илаланиламмиаклиазы — в лечении почечной недостаточности, фенилкетонурии).
Вариант 12
1. В настоящее время известно более 2400 ферментов. Каждый фермент, как правило, имеет две номенклатуры; одна из них рабочая (тривиальная), а другая - систематическая.
Рабочее наименоваие фермента составляют путем прибавления к корню слова латинского , греческого или химического названия субстрата, на который действует фермент, или к названию процесса, катализируемого данным ферментоа окончания “-аза”. Вещество, имеющее это окончание, принимают за фермент. Ферменты, действующие на крахмал (amylum), сахарозу, мочевину (urea), пептиды получили соответственно названия : амилаза, сахараза, уреаза,пептидаза; ферменты, катализирующие процессы гидролиза называют гидролазами, процессы окисления - оксидазами, перенос групп - трнсферазами и т.д. Для некоторых ферментов сохранены названия, неподчиняющиеся этому правилу: пепсин, трипсин, химотрипсин папин и др.
В названии ряда ферментов указывают как характер субстрата, так и тип катализируемой реакции. Фермент, катализирующий отнятие водорода от спирта, называют алкогольдегирогеназа.
Рабочим названием ферментов пользуются в повседневной практике.
В 1961 г. Международная комиссия по ферментам, созданная в 1956 г., предложила новую схему номенклатуры и классификации ферментов, которая была принята Международным биохимическим союзом. Согласно этой схемы каждый фермент имеет как рекомендуемое (рабочее) название, так и систематическое название, которое составляется в определенном порядке и подчеркивает тип катализируемой реакции (см. классы ферментов).
В принятой классификации все ферменты на основании катализируемых реакций разделены на шесть классов, расположенных в следующем порядке: 1) оксидоредуктазы, 2) трансферазы, 3) гидролазы, 4) лиазы, 5) изомеразы, 6) лигазы (синтетазы). Каждый класс подразделяется на подклассы, а каждый подкласс - на подподклассы. Индивидуальный фермент имеет кодовое число (шифр) со стоящими перед ним буквами КФ (англ. ЕС). Шифр каждого фермента содержит четыре числа, разделенных точками. Первое число указывает к какому из шести классов принадлежит данный фермент. Второе число обозначает подкласс. Третье число обозначает подподкласс, а четвертое - порядковый номер фермента в данном подподклассе. Например, фермент КФ.1.1.1.1 имеет рекомендуемое (рабочее) название алкогольдегидрогеназа, систематическое название алкоголь:НАД оксидоредуктаза. Этот фермент относится к классу оксидоредуктаз (1), действует на СН-ОН группу доноров (1.1), акцептором водорода служит НАД (1.1.1); четвертая цифра шифра - порядковый номер фермента в пределах подподкласса.
Систематическое название и шифр фермента используют в научных публикациях при первом упоминании о нем; при дальнейшем изложении материала пользуются рекомендуемым (рабочим) названием.
Дата добавления: 2019-07-17; просмотров: 609; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!