ЕГО БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
СОВРЕМЕННЫЕ ДАННЫЕ О ГЕПАРИНЕ И
ЕГО БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Гепарин - чрезвычайно важное соединение , синтезируемое в организме животных и человека . Это биологически активное вещество , антикоагулянт широкого спектра действия , регулятор многих биохимических и физиологических процессов , протекающих в животном организме , в настоящее время приковывает к себе пристальное внимание биологов , физиологов , фармакологов и клиницистов . Весьма эффективное использование гепарина в клинической практике выдвигает этот препарат в число перспективных фармакологических агентов .
ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ГЕПАРИНА
В исследованиях структуры гепарина большое значение имеет изучение типа гликозидной связи , определение содержания серы и сульфамидных карбоксиль- ных и других групп , количества ветвей в молекуле , а также выяснение природы уроновокислого компонента и т.д. Изучение молекулярной структуры гепарина очень важно , во-первых , с точки зрения сопоставления химической структуры этого вещества и его антикоагулянтных и других физиологических свойств , например , таких, как способность образовывать комплексы со многими веществами. Здесь можно указать на большую роль комплексных соединений гепарина с рядом тромбогенных белков плазмы крови и некоторыми биогенными аминами в регуляции жидкого состояния крови . Во-вторых , детальное выяснение структуры гепарина открывает определенные перспективы на пути исскуственного синтеза этогонезаменимого медикамента . По химическому строению гепарин представляет собой высокосульфированный мукополи-
|
|
|
сахарид , состоящий из последовательно чередующихся остатков -D-
- глюкороновой кислоты и 2-амино-2-дезокси - - D - глюкозы , соединенных связями 1—4 . Основная связь в гепарине — это 1—6 гекзоамин . Вольфром и соавторы (Wolfrom et al.,1966) обнаружили , что конфигурация 2-амино-2-дезокси--D - глюкороновокислотной связи представляет собой -D-связь. Наряду с этим отмечается существование и некоторой - конфигурации. В молекуле гепарина на тетрасахаратную единицу приходится по 5—6, 5 сульфатных групп . Остатки серной кислоты присоединены к ОН-группам глюкозамина . Высокое содержание сульфогрупп обусловливает значительный от рицательный заряд и , следовательно , большую подвижность в электрическом поле . Около 10% аминогрупп гепарина находится в свободном состоянии . Большинство же из них сульфатированны.
Сульфокислотные группы, вероятно, присоединены к аминогруппам с обра-
зованием аминосульфокислоты.
Молекулу гепарина принято рассматривать как протяженную, неразветв-
|
|
|
леннуюлинейную структуру. Так, электронно-микроскопические исследования
показали, что длина молекулы гепарина равна 160=40 А . Наряду с этим некоторые авторы высказываются в пользу разветвленной структуры.
По данным Вольфрома и Вэнга, гидроксильная группа с-6 2-амино-2-де-
зокси-D-глюкозной единицы гепарина сульфатированы. Видимо, в указанной выше единице гепарина существуют две сульфатные группы.
Причем остаток D-глюкуроновой кислоты не сультирован. Денишефски и
соавторы считают, что в гепарине сульфатировано по атому углерода в
положении 2 1/3 глюкуроновокислотного компонента и большая часть глю-
козаминов сульфатирована по атому углерода в положении 6.
До сих пор окончательно не решен вопрос о том,содержит ли гепарин
ацетильные группы. В то же время при исследовании бычьего, свиного и
китового гепарина установлено, что химическое строение и распреднление
остатков N-ацетилглюкозамина одинаково во всех препаратах.
Изучение структуры гепарина методом ЯМР показало,что гексуроновые
остатки находятся в молекуле в конформации С-1.
В содержании и составе гексуроновых кислот в гепаринах и гепарино-
вых фракциях различных млекопитающих обнаружены значительные раз-
|
|
|
личия. D-глюкуроновая кислота - основная уроновая кислота, входящая в состав гепарина. В гепарине также отмечено наличие кетуроновой и L-
идуроновой кислот и найдено, что их соотношение равно 2,6 1. Для ге-
парина характерно присутствие относительно большого количества ( до
1/3) L- идопираносилуровых остатков. Определение уровня уроновых кис-
лот ( идуроновой и D- глюкуроновой), входящих в различные гепарины и гепарансульфаты, показало, что содержание идуроновой кислоты не зависит от источника гепарина или гепарансульфатов и составляет соот-
ветственно 50-90 и 30-55 %. В исследуемых мукополисахаридах увеличивалась величина соотношения N- к О- сульфатам по мере возрастания в них уровня идуроновой кислоты. Величины отношений N-
сульфата к глюкозамину в гепарине и гепарансульфатах составляют 0,7-
1,0 и 0,3- 0,6. Отношение S- сульфата к глюкозамину изменяется в пределах 0,9- 1,5 для гепарина и 0,2- 0,8 для гепарансульфата. Видимо, это свидетельствует в пользу того, что гепарансульфаты представляют собой предшественники гепарина при его биосинтезе.
Изучение продуктов деградации гепарина под действием ферментов,
выделяемых из среды бактерий Flavobacterium heparinum, позволило сде-
|
|
|
лать вывод, что его молекула состоит из ряда последовательно распо-
ложенных стуктурных элементов, которые могут быть представлены как
1 - 4 связанные биозные остатки 2- сульфата 4-О-( a- L- идопираносульфу-
роновой кислоты) и 2-( дезокси- 2 - сульфамино-a-D- глюкопираносил-6-
сульфата). Повторяющиеся тетрасахаридные единицы, включающие в себя два уроновых и идуроновых остатка,-такова структура молекулы ге-
парина по представлениям Хелтинг и Линдал.
Данные о способе связей между повторяющимися единицами гепарина
весьма разноречивы. По ширине рентгеновских отражений установлено, что молекула гепарина содержит 10 тетрасахаридных поаторяющихся еди-
ниц.
При выделении гепарина из печени быка были получены три фракции, две из которых гомогенны. Биологическая активность этих фракций росла пропорционально молекулярному весу. Так, максимальная активность бы-
ла у фракции с молекулярным весом 16200, а минимальная - у фракции
7600. Установлено, что во фракциях с молекулярными весами 16200 и
15500 белковых примесей больше, чем во фракции 7600. Во всех фрак-
циях был обнаружен глюкозамин, галактозамин, гексуронат, сульфат, га-
лактоза и ксилоза в разных количествах. Некоторые незначительные отличия,наблюдаемые в структуре гепарина , видимо объясняются тем , что
исследуемые препараты получены из различных тканевых источников и мо-
гут быть обусловлены стабильными комплексами гепарина с белками , а
также наличием примесей . По разным данным , молекулярный вес гепарина
составляет от 4800 до 20000 . Метод низкого угла рассеяния Х-лучей дает
значение молекулярного веса в 12900 , что хорошо согласуется с результата-
ми , полученными с помощью равновесной седиментации и внутренней вяз-
кости : 12500 и 12600 соответственно . Методом гельфильтрации на сефа-
дексе G-200 показано, что молекулярные веса гепарина , полученного из
мукозы собаки и быка , а также из легких быка , равны 11000 - 12000 .
Как известно в ряду моносахарид ® олигосахарид ® полисахарид ИК-
- спектры поглощения упрощаются в связи с перекрыванием многих полос .
И хотя в настоящее время интерпретация ИК-спектров ВМС подобной слож-
ной структуры крайне затруднена и точный метод анализа еще не разработан,
полученный А.М.Ульяновым и др. ИК-спектр гепарина фирмы “СПОФА” (ЧССР)
позволил идентифицировать наличие максимумов поглощения , соответствую-
щих валентным колебаниям следующих групп : SO2N ,SO3 ,COO-, а также груп-
пировки С—С , ОН - и ряд других , присущих структуре молекулы гепарина .
В спектре поглощения гепарина в УФ-области области слабый максимум при
267 нм . возможно это обусловлено незначительными примесями белка или
аминокислот . Так , А.Ф.Алекперов (1972) пришел к выводу , что чистые образцы гепарина не дают полос поглощения в УФ-области спектра . Однако
при исследовании водных растворов ряда коммерческих препаратов гепарина
удалось выявить максимум поглощения при 258 нм . Автор отмечает ,что ука-
занную полосу поглощения дает фенилаланин . С помощью фотометрии и хроматографии на бумаге показано , что в препаратах гепарина в небольших
количествах присутствует белок : минимум в гепарине фирм “ПОЛЬФА” и
“РИХТЕР” (0,0026 и 0,0035 г) и максимум в гепарине фирмы “СПОФА “ и Бакин-
ского завода (0,0045 и 0,006 г ). Алекперов отмечает ,что полученные данные
могут служить критерием чистоты этих препаратов .
Седиментационный анализ гепарина дал коэффициент седиментации для
1% - ного водного раствора фирмы “СПОФА” 2,65 S.
Описаны различия в биологической активности между L- и b- гепаринами .
Это обусловлено тем , что у L-гепарина глюкозамин присоединен L-гликозид-
ной связью , b-гепарин имеет в своем составе галактозамин , соединенный
b-гликозидной связью . b-гепарин , имеющий в своем составе более низкое содержание серы и меньший молекулярный вес ,чем L- гепарин , обладает
и меньшей биологической активностью . По химической структуре он предста-
вляет собой хондроитинсерную кислоту с ацилированной аминогруппой и со-
держит галактозамин вместо глюкозамина .
ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ СТРУКТУРОЙ ГЕПАРИНА И
ЕГО БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Понятие биологической активности гепарина весьма широко , так как спектр
его физиологического действия очень велик . Сюда можно отнести анти -коагулянтную активность , антилипемическое , антимитотическое влияния,
регуляторное воздействие в отношении ряда ферментативных систем и т.д.
Однако наиболее изученным и имеющим большое практическое применение
является антикоагулянтный эффект гепарина . Поэтому говоря о биологическом действии гепарина, в основном говорят о его антикоагулянт-
ных свойствах .
Обнаружено , что антикоагулянтная активность гепарина связана с особенностями строения его молекулы . Так , антикоагулянтная активность зависит от содержания серы , степени сульфатированния , количества
и расположения О - сульфатных групп , а также от размера скелета молекулы
этого полисахарида . Активность выше в препаратах с большим содержанием
эфиросвязанной серы . С.В. Бычков и В.Н. Харламова (1975) показали , что
активность фракции , в которой на дисахаридную структурную единицу прихо-
дится четыре остатка серной кислоты , в 1,4 раза превышает активность фра-
кции гепарина с тремя остатками . Таким образом , антикоагулянтные актив -ность гепарина растет по мере увеличения содержания в молекуле остат-
ков серной кислоты. Видимо, данная активность зависит от положения остатков серной кислоты в молекуле гепарина , а также от длины цепи моле кулы . В экспериментах с плазмой крови кроликов получено , что максималь-
ная антикоагулянтная активность гепарина проявляется при рН плазмы
7,3—7,5 , а минимальная при рН 6,1—6,5.
Высказано утверждение , что биологическая активность гепарина опреде-
ляется степенью сульфатации , карбоксилации , а также размером , формой
молекулы и молекулярным весом . В частности , показано , что десульфирование , происходящее в результате мягкого гидролиза , сопро- вождается уменьшением биологической активности . При сильной щелочной
реакции среды гепарин разрушается , что выражается в быстрой потере им
в первую очередь антилипемической активности . С другой стороны , даже
низкая кислотность вызывает потерю гепарином антикоагулянтной активности.
Причем степень этой потери прямо пропорциональна степени появления в
молекуле гепарина свободных аминогрупп . Полная инактивация происходит
когда более половины азота присутствуют в форме свободных NH2 - групп .
Под действием горячей уксусной кислоты гепарин теряет значительную часть
антикоагулянтной активности при одновременном сохранении молекулярного
веса и содержания глюкозамина . При этом наблюдается увеличение кон- станты седиментации и степени полидисперсности параллельно с умень-
шением фрикционного соотношения . Предполагается , что аминный азот ,
который первым отщепляется в процессе рекристаллизации гепарина после
его обработки кислотой , играет важную роль в проявлении антикоагулянтной
активности . При рН среды 1—2 и 25° в течение 25 часов изменения биоло-
гической активности гепарина не происходит . Изменение активности наб-
людается после воздействия в течение 60 часов рН 4,4 и 23° . Видимо под влиянием кислоты в молекуле гепарина образуются внутренние эфиры , что объясняет наблюдаемые изменения молекулярного веса , внутренней
вязкости и состава молекулы .
Многочасовое воздействие на бычий a- и w- гепарин 40%-ной уксусной
кислотой при 37° сопровождалось потерей этими веществами 7—8% суль-
фатных групп и почти 100% антикоагулянтных свойств .
Гепарин не изменяет своих нативных свойств , в частности антикоагу-
лянтной активности , в процессе обработки его паром при 100° в течение
часа при рН 7 . Следовательно , гепарин можно стерилизовать .
Отмечена корреляция между антикоагулянтной активностью фракций
гепарина и его молекулярным весом . Так даже при незначительном уров- не сульфата (2,0 — 2,8 сульфатных групп на остаток глюкозы) у препара-
тов гепарина с низким молекулярным весом (степень полимеризации равна
9) отмечалась слабая активность . Интересно , что сульфатированные дек-
страны с высоким молекулярным весом также проявляют весьма высокую
антикоагулянтную активность . Активность низкомолекулярных фракций гепа-
рина мала . Антикоагулянтная активность гепарина с молекулярным весом
от 2500 до 15500 увеличивается по мере возрастания молекулярного веса
до 10000 , но дальнейшее возрастание не вызывает заметных сдвигов .
Уменьшение молекулярного веса гепарина при гидролизе в большей мере
обусловлено степенью десульфатации молекулы , чем ее деполимеризации.
При частичном гидролизе отмечено также падение молекулярного веса
и соотношения осей молекулы гепарина , а также снижение вязкости в
воде . С помощью дисперсии оптического вращения показано , что N -
- десульфатация гепарина не изменяет его естественной структуры , но
полная десульфатация вызывает исчезновение нативной конформации .
g-облучение вызывало деполимеризацию гепарина , но десульфатация при этом не наблюдалась . Воздействие УФ - излучения снижало антикоагулян-
тную активность и уменьшало потенциальную возможность связывания их
катионных красителей . Поток же электронов обусловливал деполиремиза-
цию гепарина .
Действие гепарина , ингибитора практически всех фаз процесса сверты-
вания крови , проявляется при наличии и участии кофактора гепарина ,
присутствующего в плазме крови . Кофактор гепарина , возможно , предста- вляет собой одну из фракций сывороточного альбумина .
Прежде всего необходимо подчеркнуть , что в настоящий момент нет пол-
ной ясности относительно механизмов биосинтеза гепарина . Исходные
вещества необходимые организму для образования гепарина , - глюкоза и
неорганический фосфат . Сульфатация происходит в тучных клетках сразуже вслед за полимеризацией .Напротив , Райс и соавторы (Rice et al.,1967)
считают , что перенос сульфата происходит на низкомолекулярные пред-
шественники . Предполагают также , что способность управлять переходом
сульфата в N - десульфированный гепарин проявляет микросомальная фракция из гомогената мастоцитов опухоли и что свободные аминогруппы
необходимы для энзиматической N - сульфатации гликозаминогликанов
На основании экспериментов , проводимых на ткани мастоцитомы мы - ши , по изучению биосинтеза специфического остатка глюкуроновой кис- лоты была предложена схема реакций биосинтеза в области связи ге-
парин - полипептид . Высказано предположение , что в процессе синтеза происходит ряд специфических гликозилтрансферазных реакций . При этом
продукт каждого предыдущего этапа служит субстратом для следующей
реакции . Для каждой реакции переноса необходим отдельный фермент .
наличие одного из таких ферментов - глюкуронозилтрансферазы обнаруже-
но в мембране тучных клеток .
Вопрос о точной локализации структур , связанных с биосинтезом
гепарина , до сих пор не решен . Однако есть многочисленные указания
на то , что непосредственное отношение к синтезу имеют тучные клетки
соединительной ткани , а также генетически родственные и функциональ-
но близкие им базофильные клетки крови , в связи с чем и те и другие
получили название “гепариноциты”. Доказано , что содержащие гепарин
гранулы тучных клеток выделяют это вещество в межклетники и кровь .
Также базофилы служат источником гепарина , выделяя в плазму крови
небольшие порции этого антикоагулянта . Но отмечая несоответствие между общим количеством гепарина в организме и его содержанием в
тучных клетках , предполагает возможность существования и других источ-
ников гепарина .
Известно , что тучные клетки , имеющиеся в организме не только выс-
ших животных , но и морских звезд , моллюсков , ракообразных и представляющие собой обязательную часть соединительной ткани , разви-
ваются из тканей мезенхимы . Предшественниками тучных клеток являют-
ся , очевидно , промакрофоги моноцитарного происхождения . Вероятно , кле-
точные элементы крови моноцитарного ряда , проникая в межклетники сое-
динительной ткани , дают начало тучным клеткам . Как считается , молодые
тучные клетки берут свое происхождение от клеток , подобных средним
лимфоцитам . последние также активно синтезируют гепарин и другие су-
льфатированные мукополисахариды .
Основанием для утверждения о непосредственном отношении тучных клеток к процессу свертывания крови послужило их расположение вблизи
кровеносных сосудов , а также то , что они являются носителями гепарина.
До 90% всей массы тучных клеток приходится на заполняющие цитоплаз-
му базофильные метахроматические гранулы диаметром 0,3 - 1,0 мк . На
1 мг тучных клеток крысы приходится 316 международных единиц гепарина,
который весьма прочно связан с гранулами , так что его можно выделить
лишь после их разрушения . Наряду с этим имеются указания на то , что
гепарин находится в цитоплазме в свободном состоянии .
В пользу того , что гепарин синтезируется в тучных клетках , говорит факт обнаружения в них ряда ферментов , обеспечиваюших образование
сульфатированных мукополисахаридов . Весьма важным доказательством
служит и то , что меченые предшественники включаются в гепарин гранул
тучных клеток , сам же предварительно меченый гепарин в них не обна-
руживается . Кроме гепарина в гранулах тучных клеток разных видов мле-
копитающих содержатся нейтральные мукополисахариды , гепарин - моно-
сульфат . Основу гранул представляет комплекс белок - гепарин . Гепарин
существует преимущественно в жесткой валентной комбинации с белками
и практически не обнаруживается в заметных количествах как экстрацел-
лулярный компонент соединительной ткани . Прочная связь гепарина и бел-
ка при этом обусловлена соединением сульфатных и карбоксильных групп
полисахарида с NH-группами аргинина белка . Менее прочно с этим ком-
плексом посредством свободных СОО - групп белка связан гистамин.
Относительно происхождения гранул тучных клеток существует и такая
точка зрения , согласно которой они являются производными аппарата Го-
льджи . С другой стороны считается , что они представляют собой специ-
фические структуры , дифференцировавшиеся из митохондрий .
Гепарин содержится во всех тканях млекопитающих , имеющих клеточные элементы : в печени , легких , селезенке , в стенках кровеносных
сосудов , в пищеварительном тракте , коже и др. Есть он и в муцине сви-
ньи , в крови , печени и мышцах рыб , в тканях ряда морских моллюсков .
Наиболее богаты гепарином легкие и печень млекопитающих . Гепарин
обнаружен также в потовой жидкости . Важнейшим источником для полу-
чения гепарина в фармакологических целях является ткань легких и капсу-
ла печени быка . Гепарин обнаружен в эритроцитах и лейкоцитах . Около
90% гепарина крови связано с форменными элементами . Известно большое
количество других источников гепарина и гепариноподобных веществ . Так
ткани многих морских животных содержат вешества с высокой антикоагу-
лянтной активностью . Гепарин также выделен из кожи крыс. Показано , что выделенное вещество представляет собой высокомолекулярное сое-
динение с разветвленной структурой , а не агрегат низкомолекулярных . Его молекулярный вес 1100000 , а коэффициент седиментации 12,8 S .
Препарат гепарина в 16 раз более вязок , чем гепарин из муцина свиньи
Китовый гепарин (w-гепарин) впервые был выделен из легких и кишечника
кита - полосатика . Отличительная особенность его структуры заключается
в том , что он содержит N - ацетилглюкозамин , к которому присоединены другие группы гепарина . Молекулярный вес w - гепарина близок к весу гепарина полученного из тканей крупного рогатого скота .
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 97; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!