Включение ферментов в волокна

Биотехнология как наука и сфера производства. Предмет, цели и задачи биотехнологии, связь с фундаментальными дисциплинами.

Биотехнология - это технологические процессы с использованием биотехнологических систем - живых организмов и компонентов живой клетки. Системы могут быть разными - от микробов и бактерий до ферментов и генов. Биотехнология - это производство, основанное на достижениях современной науки: генетической инженерии, физико-химии ферментов, молекулярной диагностики и молекулярной биологии, селекционной генетики, микробиологии, биохимии, химии антибиотиков.

В сфере производства лекарственных средств биотехнология вытесняет традиционные технологии, открывает принципиально новые возможности. Биотехнологическим способом производят генно-инженерные белки (интерфероны, интерлейкины, инсулин, вакцины против гепатита и т.п.), ферменты, диагностические средства (тест-системы на наркотики, лекарственные вещества, гормоны и т.п.), витамины, антибиотики, биодеградируемые пластмассы, биосовместимые материалы.

Иммунная биотехнология, с помощью которой распознают и выделяют из смесей одиночные клетки, может применяться не только непосредственно в медицине для диагностики и лечения, но и в научных исследованиях, в фармакологической, пищевой и других отраслях промышленности, а также использоваться для получения препаратов, синтезируемых клетками защитной системы организма.

В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в следующих отраслях:

• в промышленности (пищевая, фармацевтическая, химическая, нефтегазовая) — использование биосинтеза и биотрансформации новых веществ на основе сконструированных методами генной инженерии штаммов бактерий и дрожжей с заданными свойствами на основе микробиологического синтеза;

• в экологии — повышение эффективности экологизированной защиты растений, разработка экологически безопасных технологий очистки сточных вод, утилизация отходов агропромышленного комплекса, конструирование экосистем;

• в энергетике — применение новых источников биоэнергии, полученных на основе микробиологического синтеза и моделированных фотосинтетических процессов, биоконверсии биомассы в биогаз;

• в сельском хозяйстве — разработка в области растениеводства трансгенных агрокультур, биологических средств защиты растений, бактериальных удобрений, микробиологических методов, рекультивации почв; в области животноводства — создание эффективных кормовых препаратов из растительной, микробной биомассы и отходов сельского хозяйства, репродукция животных на основе эмбриогенетических методов;

• в медицине — разработка медицинских биопрепаратов, мо-ноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.

По сравнению с химической технологией биотехнология имеет следующие основные преимущества:

- возможность получения специфичных и уникальных природных веществ, часть из которых (например, белки, ДНК) еще не удается получать путем химического синтеза;

- проведение биотехнологических процессов при относительно невысоких температурах и давлениях;

- микроорганизмы имеют значительно более высокие скорости роста и накопления клеточной массы, чем другие организмы. Например, с помощью микроорганизмов в ферментере объемом 300 м³ за сутки можно выработать 1 т белка (365 т/год). Чтобы такое же количество белка в год выработать с помощью крупного рогатого скота, нужно иметь стадо 30 000 голов. Если же использовать для получения такой скорости производства белка бобовые растения, например горох, то потребуется иметь поле гороха площадью 5400 га;

- в качестве сырья в процессах биотехнологии можно использовать дешевые отходы сельского хозяйства и промышленности;

- биотехнологические процессы по сравнению с химическими обычно более экологичны, имеют меньше вредных отходов, близки к протекающим в природе естественным процессам;

- как правило, технология и аппаратура в биотехнологических производствах более просты и дешевы.

В качестве первоочередной задачи перед биотехнологией стоит создание и освоение производства лекарственных препаратов для медицины: интерферонов, инсулинов, гормонов, антибиотиков, вакцин, моноклональных антител и других, позволяющих осуществлять раннюю диагностику и лечение сердчено-сосудистых, злокачественных, наследственных, инфекционных, в том числе вирусных заболеваний.

Понятие "биотехнология" собирательное и охватывает такие области, как ферментационная технология, применение биофакторов с использованием иммобилизованных микроорганизмов или энзимов, генная инженерия, иммунная и белковая технологии, технология с использованием клеточных культур как животного, так и растительного происхождения.

Биотехнология — это совокупность технологических методов, в том числе и генной инженерии, использующих живые организмы и биологические процессы для производства лекарственных средств, или наука о разработке и применении живых систем, а также неживых систем биологического происхождения в рамках технологических процессов и индустриального производства.

Современная биотехнология — это химия, где изменение и превращение веществ происходит с помощью биологических процессов. В острой конкуренции успешно развиваются две химии: синтетическая и биологическая.

 

2. Биообъекты как средство производства лечебных, реабилитационных, профилактических и диагностических средств. Классификация и общая характеристика биообъектов.

Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы — микромицеты и макромицеты, протозойные организмы, клетки (ткани) растений, животных и человека, некоторые биогенные и функционалъно сходные с ними вещества (например, ферменты, простагландины, пектины, нуклеиновые кислоты и др.). Следовательно, объекты биотехнологии могут быть представлены организованными частицами (вирусы), клетками (тканями) или их метаболитами (первичными, вторичными). Даже при использовании биомолекулы как объекта биотехнологии исходный биосинтез ее осуществляется в большинстве случаев соответствующими клетками. В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии относятся либо к микробам, либо к растительным и животным организмам. В свою очередь организм можно образно характеризовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, саморегулируемого и, следовательно, целенаправленного биохимического производства, устойчиво и активно протекающего при оптимальном поддержании всех необходимых параметров. Из такого определения следует, что вирусы не являются организмами, но по содержанию молекул наследственности, приспособляемости, изменчивости и некоторым другим свойствам они относятся к представителям живой природы.

Как видно из приводимой схемы, объекты биотехнологии исключительно разнообразны, диапазон их распространяется от организованных частиц (вирусов) до человека.

В настоящее время большинство объектов биотехнологии составляют микробы, относящиеся к трем надцарствам (безъядерные, предъядерные, ядерные) и пяти царствам (вирусы, бактерии, грибы, растения и животные). Причем первые два надцарства состоят исключительно из микробов.

Микробами среди растений являются микроскопические водоросли (Аlgае), а среди животных.— микроскопические простейшие (Рrotozoa). Из эукариот к микробам относятся грибы и, при определенных оговорках, лишайники, которые являются природными симбиотическими ассоциациями микроскопических грибов и микроводорослей или грибов и цианобактерий.

Аcaryotа — безъядерные, Рrосаrуоtа — предъядерные и Еuсаrуоtа — ядерные (от греч. а — нет, рrо — до, еu — хорошо, полностью, саrуоn — ядро). К первому относятея организованные частицы — вирусы и вироиды, ко второму — бактерии, к третьему — все другие организмы (грибы, водоросли, растения, животные).

Микроорганизмы образуют огромное количество вторичных метаболитов, многие из которых также нашли применение, например, антибиотики и другие корректоры гомеостаза клеток млекопитающих.

Пробиотики — препараты на основе биомассы отдельных видов микроорганизмов используются при дисбактериозах для нормализации микрофлоры желудочнокишечного тракта. Микроорганизмы необходимы также при производстве вакцин. Наконец, микробные клетки методами генной инженерии могут быть превращены в продуценты видоспецифических для человека белковых гормонов, белковых факторов неспецифического иммунитета и т.д.

Высшие растения являются традиционным и к настоящему времени все еще наиболее обширным иеточником получения лекарственных средств. При использовании растений в качестве биообъектов основное внимание сосредоточено на вопросах культивирования растительных тканей на искусственных средах (каллусные и суспензионные культуры) и открывающихся при этом новых перспективах.

 

3. Макробиообъекты животного происхождения. Человек как донор и объект иммунизации. Млекопитающие, птицы, рептилии и др.

В последние годы в связи с развитием технологии рекомбинантной ДНК стремительно возрастает важность такого биообъекта как человек, хотя на первый взгляд это кажется парадоксальным.

Однако биообъектом с позиций биотехнологии (при использовании биореакторов) человек стал лишь после реализации возможности клонирования его ДНК (точнее ее экзонов) в клетках микроорганизмов. За счет такого подхода был ликвидирован дефицит сырья для получения видоспецифических белков человека.

Важное значение в биотехнологии имеют макрообъекты, к которым относятся различные животные и птицы. В случае производства иммунной плазмы человек выступает, кроме того, в качестве объекта иммунизации.

Для получения различных вакцин в качестве объектов для размножения вирусов используют органы и ткани, в том числе эмбриональные, различных животных и птиц: Необходимо отметить, что термином «донор» в данном случае обозначен биообъект, поставляющий материал для процесса производства лекарственного средства без ущерба для собственной жизнедеятельности, а термином «донатор» — биообъект, у которого забор материала для производства лекарственного средства оказывается несовместимым с продолжением жизнедеятельности.

Из эмбриональных тканей наиболее широко используемыми являются эмбриональные ткани цыпленка. Особенной выгодой отличаются куриные эмбрионы (по доступности) десяти-двенадцатисуточного возраста, используемые преимущественно для репродукции вирусов и последующего изготовления вирусных вакцин. Куриные эмбрионы введены в вирусологическую практику в 1931 г. Г. М. Вудруфом и Е. У. Гудпасчером. Такие эмбрионы рекомендуют также для выявления, идентификации и определения инфицирующей дозы вирусов, для получения антигенных препаратов, применяемых в серологических реакциях.

Инкубированные при 38°С куриные яйца овоскопируют (просвечивают), отбраковывают, "прозрачные" неоплодотворенные экземпляры и сохраняют оплодотворенные, в которых хорошо видны наполненные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки и движения эмбрионов.

Заражение эмбрионов можно проводить вручную и автоматизированно. Последний способ применяют в крупномасштабном производстве, например, противогриппозных вакцин. Материал, содержащий вирусы, вводят с помощью шприца (батареи шприцов) в различные части эмбриона (эмбрионов).

Все этапы работы с куриными эмбрионами после овоскопии проводят в асептичных условиях. Материалом для заражения могут быть суспензия растертой мозговой ткани (применительно к вирусу бешенства), печени, селезенки, почек (применительно к хламидиям орнитоза) и т. д. В целях деконтаминации вирусного материала от бактерий или в целях предотвращения его бактериального загрязнения можно использовать соответствующие антибиотики, например, пенициллин с каким-либо ами-ногликозидом порядка 150 МЕ каждого на 1 мл суспензии виру-сосодержащего материала. Для борьбы с грибковым заражением эмбрионов целесообразно воспользоваться некоторыми антибио-тиками-полиенами (нистатин, амфотерицин В) или отдельными производными бензимидазола (например дактарин и др.).

Чаще всего суспензию вирусного материала вводят в аллантоисную полость или, реже, на хорионаллантоисную оболочку в количестве 0,05-0,1 мл, прокалывая продезинфицированную скорлупу (например, иодированным этанолом) на расчетную глубину. После этого отверстие закрывают расплавленным парафином и эмбрионы помещают в термостат, в котором поддерживается оптимальная температура для репродукции вируса, например 36-37,5°С. Продолжительность инкубации зависит от типа и активности вируса. Обычно через 2-4 суток можно наблюдать изменение оболочек с последующей гибелью эмбрионов. Зараженные эмбрионы контролируют ежедневно 1-2 раза (овоскопируют, поворачивают другой стороной). Погибшие эмбрионы затем передают в отделение сбора вирусного материала. Там их дезинфицируют, аллантоисную жидкость с вирусом отсасывают и переносят в стерильные емкости. Инактивацию вирусов при определенной температуре проводят обычно с помощью формалина, фенола или других веществ. Применяя высокоскоростное центрифугирование или афинную хроматографию (см.), удается получать высокоочищенные вирусные частицы.

Собранный вирусный материал, прошедший соответствующий контроль, подвергают лиофильной сушке. Контролю подлежат следующие показатели: стерильность, безвредность и специфическая активность. Применительно к стерильности имеют в виду отсутствие: живого гомологичного вируса в убитой вакцине, бактерий и грибов. Безвредность и специфическую активность оценивают на животных и только после этого вакцину разрешают испытывать на волонтерах или добровольцах; после успешного проведения клинической апробации вакцину разрешают применять в широкой медицинской практике.

На куриных эмбрионах получают, например, живую противогриппозную вакцину. Она предназначается для интраназального введения (лицам старше 16 лет и детям от 3 до 15 лет). Вакцина представляет собой высушенную аллантоисную жидкость, взятую от зараженных вирусом куриных эмбрионов. Тип вируса подбирают согласно эпидемиологической ситуации и прогнозам. Поэтому препараты могут выпускаться в виде моновакцины или дивакцины (напрмер, включающая вирусы А2 и В) в ампулах с 20 и 8 прививочными дозами для соответствующих групп населения. Высушенная масса в ампулах обычно имеет светло-желтый цвет, который сохраняется и после растворения содержимого ампулы в прокипяченой остуженной воде.

Живые противогриппозные вакцины для взрослых и детей готовят и для приема через рот. Такие вакцины представляют собой специальные вакцинные штаммы, репродукция которых происходила в течение 5-15 пассажей (не менее и не более) на культуре почечной ткани куриных эмбрионов. Их выпускают в сухом виде во флаконах. При растворении в воде цвет из светло-желтого переходит в красноватый.

Из других вирусных вакцин, получаемых на куриных эмбрионах, можно назвать противопаротитную, против желтой лихорадки.

Из прочих эмбриональных тканей используют эмбрионы мышей или других млекопитающих животных, а также абортированные плоды человека.

Эмбриональные перевиваемые ткани доступны после обработки трипсином, поскольку в таких тканях еще не формируется большого количества межклеточных веществ (в том числе небелковой природы). Клетки разделяются и после необходимых обработок их культивируют в специальных средах в монослое или в суспендированном состоянии.

Ткани, изолируемые от животных после рождения, относятся к разряду зрелых. Чем их возраст больше, тем с большим трудом они культивируются. Однако после успешного выращивания они затем "выравниваются" и мало чем отличаются от эмбриональных клеток.

Кроме полиомиелита специфическую профилактику живыми вакцинами проводят при кори. Противокоревую живую сухую вакцину изготавливают из вакцинного штамма, репродукция которого осуществлялась на клеточных культурах почек морских свинок или фибробластах японских перепелок.

 

4. Биообъекты растительного происхождения. Дикорастущие растения и культуры растительных клеток.

Для растений характерны: способность к фотосинтезу, наличие целлюлозы, биосинтез крахмала.

Водоросли — важный источник различных полисахаридов и других биологичоски активных веществ. Размножаются оии вегетативио, бесполым и половым путями. Как биообъекты используются недостаточно, хотя, например, ламинария под названием морской капусты производится промышленностью разлнчных стран. Хоро-шо известны агар-агар и альгинаты, получаемые из водорослей.

Клетки высших растеиий. Высшие растения (порядка 300 000 видов) — зто дифференцированные многоклеточные, преимущественно наземные организмы. Из всех тканей лишь меристематические способны к делению и за их счет образуются все другие ткани. Это важно для получения клеток, которые затем должны быть включены в биотехнологический процесс.

Клетки меристемы, задерживающиеся на эмбриоиальной стадии развития в течение всей жизни растения, называготся инициальными, другие постепенно дифференцируются и превращаются в клетки различных постоянных тканей — конечные клетки.

В зависимости от топологии в растении меристемы подразделяют на верхушечные, или апикальные (отлат. арех — верхушка), боковые, или латеральные (от лат. lateralis — боковой) и промежуточные, или интеркалярные (от лат. Intercalaris — промежугочный, вставной.

Тотипотентность — это свойство соматических клеток растений полностью реализовать свой потенциал развития вплоть до образования целого растения.

Любой вид растения может дать в соответствующих условиях неорганизованную массу делящихся клеток — каллус (отлат. callus — мозоль), особенно при индуцирующем влиянии растительных гормонов. Массовое производство каллусов с дальнейшей регенерацией побегов пригодно для крупномасштабного производства растений. Вообще каллус представляет собой основной тип культивируемой на питательной среде растительной клетки. Каллусная ткань из любого расгения может длительно рекультивироваться. При этом первоначальные растения (в том числе и меристематические), дифференцируются и деспециализируются, но индуцируются к делению, формируя первичный каллус.

Кроме выращивания каллусов удается культивировать клетки некоторых растений в суспензионных культурах. Важными биообъектами представляются также и протопласты растительных клеток. Методы их получения принципиально сходны с методами получения бактериальных и грибных протопласгов. Последующие клеточно-иижснерныс эксперименты с ними заманчивы по возможным ценным результатам.

 

5. Биообъекты - микроорганизмы. Основные группы получаемых биологически активных веществ.

Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы — микромицсты и макромицеты, протозойные организмы, клетки (ткани) растений, животных и человека, некоторые биогенные и функционалъно сходные с ними вещества (например, ферменты, простагландины, лектины, нуклеиновые кислоты и др.). Следовательно, объекты биотехнологии могут быть представлены организованными частицами (вирусы), клетками (тканями) или их метаболитами (первичными, вторичными). Даже при использовании биомолекулы как объекта биотехнологии исходный биосинтез ее осуществляется в большинстве случаев соответствующими клетками. В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии относятся либо к микробам, либо к растительным и животным организмам. В свою очередь организм можно образно характеризовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, само-регулируемого и, следовательно, целенаправленного биохимиче-ского производства, устойчиво и активно протекающего при оптимальном поддержании всех необходимых параметров. Из такого определения следует, что вирусы не являются организмами, но по содержанию молекул наследственности, приспособляемости, изменчивости и некоторым другим свойствам они относятся к представителям живой природы.

В настоящее время большинство объектов биотехнологии составляют микробы, относящиеся к трем надцарствам (безъядерные, предъядерные, ядерные) и пяти царствам (вирусы, бактерии, грибы, растения и животные). Причем первые два надцарства состоят исключительно из микробов,.

Бактерии имеют клеточную организацию и у них имеются нуклеиновые кислоты обоих типов — РНК и ДНК, из которых ДНК представлена в виде одиночной (кольцевидной) хромосомы. Большинство из них размножается на питательных средах (вне орга-низма), а если среди бактерий и есть безусловные (облигатные) паразиты, приближающиеся по данному признаку к вирусам (хламидии, спироплазмы, риккетсии), то паразитизм их отличается по своему механизму — его можно назвать клеточным. Паразитизм вирусов развивается на генетическом уровне. Таким образом, бактерии — это организмы, состоящие из функционально связанных структур, в том числе, генетических. Несмотря на то, что генетические структуры бактериальной клетки функционируют полноценно, они не сгруппированы в форме отграниченного ядра, и поэтому бактерии отнесены к предъядерным (прокариотическим) организмам.

Клетки грибов, водорослей, растений и животных имеют настоящее, отграниченное от цитоплазмы, ядро и поэтому их относят к эукариотам.

 

6. Биообъекты - макромолекулы с ферментативной активностью. Использование в биотехнологических процессах.

В последнее время группа ферментных препаратов получила новое направление применения - это инженерная энзимология, которая является разделом биотехнологии, где биообъектом выступает фермент.

Органотерапия, т.е. лечение органами и препаратами из органов, тканей и выделений животных, долгое время покоилась на глубоком эмпиризме и противоречивых представлениях, занимая видное место в медицине всех времен и народов. Лишь во второй половине XIX столетия в результате успехов, достигнутых биологической и органической химией, и развития экспериментальной физиологии органотерапия становится на научную основу. Это связано с именем французского физиолога Броун-Секара. Особое внимание привлекали работы Броун-Секара связанные с введением в организм человека вытяжек из семенников быка, оказавших положительное влияние на работоспособность и самочувствие.

Первыми официнальными препаратами (ГФ VII) были адреналин, инсулин, питуитрин, пепсин и панкреатин. В дальнейшем в результате обширных исследований, проведенных советскими эндокринологами и фармакологами, оказалось возможным последовательно расширить круг официнальных и неофицинальных органопрепаратов.

Тем не менее, некоторые аминокислоты получают химическим синтезом, например глицин, а также D-, L-метионин, D-изомер которого малотоксичен, поэтому медицинский препарат на основе метионина содержит D- и L-формы, хотя за рубежом в медицине используется препарат, содержащий только L-форму метионина. Там рацемическую смесь метионина разделяют биоконверсией D-формы в L-форму под влиянием специальных ферментов живых клеток микроорганизмов.

Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками. Во-первых, гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что дает возможность: а) остановить в нужный момент реакцию; б) использовать катализатор повторно; в) получать продукт, не загрязненный ферментом. Последнее особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств.

Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов позволяет проводить ферментативный процесс непрерывно, например в проточных колоннах, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукта путем изменения скорости потока.

В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макромолекулярным субстратам), зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям. Отметим, что крупный вклад в разработку общих принципов стабилизации ферментов был сделан советскими исследователями.

В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под действием некоторых физических факторов, таких, как свет или звук. На этой основе создаются механо- и звукочувствительные датчики, усилители слабых сигналов и бессеребряные фотографические процессы.

В результате внедрения нового класса биоорганических катализаторов — иммобилизованных ферментов, перед прикладной энзимологией открылись новые, ранее недоступные пути развития. Одно лишь перечисление областей, в которых находят применение иммобилизованные ферменты, могло бы занять немало места.

 

 

7. Направления совершенствования биообъектов методами селекции и мутагенеза. Мутагены. Классификация. Характеристика. Механизм их действия.

Что мутации — это первоисточник изменчивости организмов, создающий основу для эволюции. Однако во второй половине XIX в. для микроорганизмов был открыт еще один источник изменчивости — перенос чужеродных генов — своего рода «генная инженерия природы».

Долгое время понятие мутации относили только к хромосомам у прокариот и хромосомам (ядру) у эукариот. В настоящее время кроме хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических (плазмидных — у прокариот, митохондриальных и плазмидных — у эукариот).

Мутации могут быть обусловлены как перестройкой репликона (изменением в нем числа и порядка расположения генов), так и изменениями внутри индивидуального гена.

Применительно к любым биообъектам, но особенно часто в случае микроорганизмов, выявляются так называемые спонтанные мутации, обнаруживаемые в популяции клеток без специального воздействия на нее.

По выраженности почти любого признака клетки в микробной популяции составляют вариационный ряд. Большинство клеток имеют среднюю выраженность признака. Отклонения «+» и «–» от среднего значения встречаются в популяции тем реже, чем больше величина отклонения в любую сторону (рис. I). Первоначальный, самый простой подход к совершенствованию биообъекта заключался в отборе отклонений «+» (предполагая, что именно эти отклонения соответствуют интересам производства). В новом клоне (генетически однородное потомство одной клетки; на твердой среде — колония), полученном из клетки с отклонением «+» вновь проводился отбор по тому же принципу. Однако такая процедура при ее неоднократном повторении довольно быстро теряет эффективность, т. е. отклонения «+» становятся в новых клонах все меньше по величине.

Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами. В первом случае, как правило, это ультрафиолетовые, гамма, рентгеновские лучи; во втором — нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители, некоторые природные вещества (например, из ДНК–тропных антибиотиков вследствие их токсичности не применяемых в клинике инфекционных заболеваний). Механизм активности как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным действием на ДНК (прежде всего на азотистые основания ДНК, что выражается в сшивках, димеризации, алкилировании последних, интеркаляции между ними).

Подразумевается, естественно, что повреждения не приводят к летальному исходу. Таким образом, после обработки биообъекта мутагенами (физическими или химическими) их воздействие на ДНК приводит к частому наследственному изменению уже на уровне фенотипа (тех или иных его свойств). Последующей задачей является отбор и оценка именно нужных биотехнологу мутаций. Для их выявления обработанную культуру высеивают на твердые питательные среды разных составов, предварительно разведя ее с таким расчетом, чтобы на твердой среде не было сплошнбго роста, а формировались отдельные колонии, образуемые при размножении именно отдельных клеток. Затем каждую колонию пересеивают и полученную культуру (клон) проверяют по тем или иным признакам в сравнении с исходной. Эта селекционная часть работы в целом весьма трудоемка, хотя приемы, позволяющие повысить ее эффективность, постоянно совершенствуются.

Так, изменяя состав твердых питательных сред, на которых вырастают колонии, можно сразу получить первоначальные сведения о свойствах клеток этой колонии в сравнении с клетками исходной культуры. Для высеивания клонов с разными особенностями метаболизма используют так называемый «метод отпечатков», разработанный Дж. Ледербергом и Э.Ледерберг. Популяцию микробных клеток разводят так, чтобы на чашке Петри с питательной средой вырастало около ста колоний и они были бы четко разделены. На металлический цилиндр диаметром, близким к диаметру чашки Петри, надевают бархат; затем все стерилизуют, создавая, таким образом, «стерильное бархатное дно» цилиндра. Далее прикладывают это дно к поверхности среды в чашке с выросшими на ней колониями. При этом колонии как бы «отпечатываются» на бархате. Затем этот бархат прикладывают к поверхности сред разного состава. Таким образом можно установить: какая из колоний в исходной чашке (на бархате расположение колоний отражает их расположение на поверхности твердой среды в исходной чашке) соответствует, например, мутанту, нуждающемуся в конкретном витамине, или конкретной аминокислоте; или какая колония соетоит из мутантных клеток, способных к образованию фермента, окисляюшего определенный субстрат; или какая колония состоит из клеток, получивших резистентность к тому или иному антибиотику и т.п.

В первую очередь биотехнолога интересуют мутантные культуры, обладающие повышенной способностью к образованию целевого продукта. Продуцент целевого вещества, наиболее перспективный в практическом отношении, может многократно обрабатываться разными мутагенами. Новые мутантные штаммы, получаемые в научных лабораториях разных стран мира, служат предметом обмена при творческом сотрудничестве, лицензионной продажи и т.п.

Потенциальные возможности мутагенеза (с последующей селекцией) обусловлены зависимостью биосинтеза целевого продукта от многих метаболических процессов в организме продуцента. Например, повышенную активность организма, образующего целевой продукт, можно ожидать, если мутация привела к дупликации (удвоению) или амплификации (умножению) структурных генов, включенных в систему синтеза целевого продукта. Далее активность можно повысить, если за счет разных типов мутаций будут подавлены функции репрессорных генов, регулирующих синтез целевого продукта. Весьма эффективный путь увеличения образования целевого продукта — нарушение системы ретроингибирования. Повысить активность продуцента можно также, изменив (за счет мутаций) систему транспорта предшественников целевого продукта в клетку. Наконец, иногда целевой продукт при резком увеличении его образования отрицательно влияет на жизнеспособность собственного продуцента (так называемый суицидный эффект). Повышение резистентности продуцента к образуемому им же веществу часто необходимо для получения, например, суперпродуцентов антибиотиков.

Помимо дупликации и амплификации структурных генов мутации могут носить характер делеции — «стирания», т.е. «выпадения» части генетического материала. Мутации могут быть обусловлены транспозицией (вставкой участка хромосомы в новое место) или инверсией (изменением порядка расположения генов в хромосоме). При этом геном мутантного организма претерпевает изменения, ведущие в одних случаях к потере мутантом определенного признака, а в других — к возникновению у него нового признака. Гены на новых местах оказываются под контролем иных регуляторных систем. Кроме того, в клетках мутанта могут появиться несвойственные исходному организму гибридные белки за счет того, что под контролем одного промотора оказываются полинуклеотидные цепи двух (или более) структурных генов, ранее отдаленных один от другого.

Немалое значение для биотехнологического производства могут иметь и так называемые «точечные» мутации. В этом случае изменения происходят впределах только одного гена. Например, выпадение или вставка одного или нескольких оснований, К «точечным» мутациям относятся трансверсия (когда происходит замена пурина на пиримидин) и транзиция (замена одного пурина на другой пурин или одного пиримидина на другой пиримидин). Замены в одной паре нуклеотидов (минимальные замены) при передаче генетического кода на стадии трансляции ведут к появлению в кодируемом белке вместо одной аминокислоты другой. Это может резко изменить конформацию данного белка и, соответственно, его функциональную активность, особенно в случае замены аминокислотного остатка в активном или аллостерическом центре.

Одним из самых блестящих примеров эффективности мутагенеза с последующей селекцией по признаку увеличения образования целевого продукта является история создания современных суперпродуцентов пенициллина. Работа с исходными биообъектами — штаммами (штамм — клоновая культура, однородность которой по определенным признакам поддерживается отбором) гриба Penicillium chrysogenum, выделенными из природных источников, велась с 1940х гг. в течение нескольких десгятилетий во многих лабораториях. Вначале некоторый успех был достигнут при отборе мутантов, появившихся в результате спонтанных мутаций. Затем перешли к индуцированию мутаций физическими и химическими мутагенами. В результате ряда удачных мутаций и ступенчатого отбора все более продуктивных мутантов активность штаммов Penicillium chrysogenum, используемых в промышленности стран, где производят пенициллин, сейчас в 100 тыс. раз выше, чем у обнаруженного А.Флемингом исходного штамма, с которого и началась история открытия пенициллина.

Производственные штаммы (применительно к биотехнологическому производству) с такой высокой продуктивностью (это относится не только к пенициллину, но и к другим целевым продуктам) крайне нестабильны вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности этих клеток положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении: популяцию клеток высеивают на твердую среду и полученные из отдельных колоний культуры проверяют на продуктивность. При этом ревертанты — культуры с пониженной активностью отбрасывают. Реверсия объясняется обратными спонтанными мутациями, ведущими к возвращению участка генома (конкретного фрагмента ДНК) в его первоначальное состояние. Специальные ферментные системы репарации участвуют в реверсии к норме — в эволюционном механизме поддержания постоянства вида.

Совершенствование биообъектов применительно к производству не исчерпывается только повышением их продуктивности. Хотя это направление, несомненно, является главным, но оно не может быть единственным: успешная работа биотехнологического производства определяется многими факторами. С экономической точки зрения весьма важно получение мутантов, способных использовать более дешевые и менее дефицитные питательные среды. Если для работы в исследовательской лаборатории дорогие среды не создают особых финансовых проблем, то при крупнотоннажном производстве понижение их стоимости (хотя и без увеличения уровня активности продуцента) крайне важно.

Другой пример: в случае некоторых биообъектов культуральная жидкость после окончания ферментации имеет неблагоприятные в технологическом отношении реологические свойства. Поэтому в цехе выделения и очистки целевого продукта, работая с культуральной жидкостью повышенной вязкости, сталкиваются с трудностями при использовании сепараторов, фильтрпрессов и т.д. Мутации, соответствующим образом меняющие метаболизм биообъекта, в значительной мере снимают эти трудности.

Большое значение в отношении гарантии надежности производства приобретает получение фагоустойчивых биообъектов. Соблюдение асептических условий при проведении ферментации прежде всего касается предотвращения попадания в посевной материал (а также в ферментационный аппарат) клеток и спор посторонних бактерий и фибов (в более редких случаях водорослей и простейших). Предотвратить проникновение в ферментер фагов вместе с технологическим воздухом, стерилизуемым путем фильтрации, крайне трудно. Не случайно вирусы в первые годы после их открытия именовали «фильтрующимися». Поэтому основной путь борьбы с бактериофагами, актинофагами и фагами, поражающими грибы, — получение устойчивых к ним мутантных форм биообъектов.

Не касаясь специальных случаев работы с биообъектами–патогенами, следует подчеркнуть, что иногда задача совершенствования биообъектов исходит из требований промышленной гигиены. Например, выделенный из природного источника продуцент одного из важных беталактамных антибиотиков в значительном количестве образовывал летучие вешества с неприятным запахом гниющих овощей.

Мутации, ведущие к удалению генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе этих летучих веществ, приобрели в данном случае практическое значение для производства.

Из всего изложенного следует, что современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, — это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма не по одному, а, как правило, по нескольким показателям. Хранение таких штаммов–суперпродуцентов представляет серьезную самостоятельную проблему. При всех способах хранения их необходимо периодическй пересеивать и проверять как на продуктивность, так и на другие важные для производства свойства.

В случае применения высших растений и животных в качестве биообъектов для получения лекарственных средств возможности использования мутагенеза и селекции для их совершенствования ограничены. Однако в принципе мутагенез и селекция здесь не исключены. Особенно это относится к растениям, образующим вторичные метаболиты, которые используются как лекарственные вещества.

 

8. Направления создания новых биообъектов методами генетической инженерии. Основные уровни генетической инженерии. Характеристика.

С помощью методов генетической инженерии можно конструировать по определенному плану новые формы микроорганизмов, способных синтезировать самые различные продукты, в том числе продукты животного и растительного происхождения, При этом следует учитывать высокие скорости роста и продуктивность микроорганизмов, их способность к утилизации разнообразных видов сырья. Широкие перспективы перед биотехнологией открывает возможность микробиологического синтеза белков человека: таким способом получены соматостатин, интерфероны, инсулин, гормон роста.

Основные проблемы на пути конструирования новых микроорганизмов-продуцентов сводятся к следующему.

1. Продукты генов растительного, животного и человеческого происхождения попадают в чуждую для них внутриклеточную среду, где они подвергаются разрушению микробными протеаза-ми. Особенно быстро, за несколько минут, гидролизуются короткие пептиды типа соматостатина. Стратегия защиты генноинженерных белков в микробной клетке сводится к: а) использованию ингибиторов протеаз; так, выход человеческого интерферона возрастал в 4 раза при введении в плазмиду, несущую интерфе-роновый ген, фрагмента ДНК фага Т4 с геном pin, отвечающим за синтез ингибитора протеаз; б) получению интересующего пептида в составе гибридной белковой молекулы, для этого ген пептида сшивают с природным геном организма-реципиента; чаще всего используют ген белка А Staphylococcus aureus\ в) амплификации (увеличению числа копий) генов; многократное повторение гена человеческого проинсулина в составе плазмиды привело к синтезу в клетке Е. coli мультимера этого белка, который оказался значительно стабильнее к действию внутриклеточных протеаз, чем мономерный проинсулин. Проблема стабилизации чужеродных белков в клетках исследована еще недостаточно (В. И. Таняшин, 1985).

2. В большинстве случаев продукт трансплантированного гена не высвобождается в культуральную среду и накапливается внутри клетки, что существенно затрудняет его выделение. Так, принятый метод получения инсулина с помощью Е. coli предполагает разрушение клеток и последующую очистку инсулина. В связи с этим большое значение придается трансплантации генов, отвечающих за экскрецию белков из клеток. Имеются сведения о новом способе генноинженерного синтеза инсулина, который выделяется в культуральную среду (М. Sun, 1983).

Оправдана также переориентация биотехнологов с излюбленного объекта генетической инженерии Е. coli на другие биообъекты. Е. coli экскретирует сравнительно мало белков. Кроме того, клеточная стенка этой бактерии содержит токсическое вещество эндокотин, которое необходимо тщательно отделять от продуктов, используемых в фармакологических целях. Как объекты генетической инженерии перспективны поэтому грамположительные бактерии (представители родов Bacillus, Staphylococcus, Streptomyces). В частности Bas. subtilis выделяет более 50 различных белков в культуральную среду (С. Vard, 1984). В их число входят ферменты, инсектициды, а также антибиотики. Перспективны также эукариотические организмы. Они обладают рядом преимуществ, в частности, дрожжевой интерферон синтезируется в гликолизированной форме, как и нативный человеческий белок (в отличие от интерферона, синтезируемого в клетках Е. coti).

3. Большинство наследственных признаков кодируется несколькими генами, и генноинженерная разработка должна включать стадии последовательной трансплантации каждого из генов. Примером реализованного многогенного проекта является создание штамма Pseudomonas sp., способного утилизировать сырую нефть. С помощью плазмид штамм последовательно обогащался генами ферментов, расщепляющих октан, камфору, ксилол, нафталин (В. Г. Дебабов, 1982). В некоторых случаях возможна не последовательная, а одновременная трансплантация целых блоков генов с помощью одной плазмиды. В составе одной плазмиды может быть перенесен в клетку-реципиент nif-оперон Klebsiella pneumonia, отвечающий за фиксацию азота. Способность организма к фиксации азота определяется наличием по меньшей мере 17 различных генов, отвечающих как за структурные компоненты нитрогеназного комплекса, так и за регуляцию их синтеза.

Генетическая инженерия растений осуществляется на орга-низменном, тканевом и клеточном уровнях. Показанная, пусть для немногих видов (для томатов, табака, люцерны), возможность регенерации целого организма из одиночной клетки резко повысила интерес к генетической инженерии растений. Однако здесь, помимо чисто технических, предстоит решить проблемы, связанные с нарушениями структуры генома (изменения плоид-ности, хромосомные перестройки) культивируемых клеток растений. Примером реализованного генноинженерного проекта является синтез фазеолина, запасного белка фасоли, в регенерированных растениях табака. Трансплантация гена, отвечающего за синтез фазеолина, была проведена с использованием Ti-плазмиды в качестве вектора. С помощью Ti-плазмиды трансплантирован также ген устойчивости к антибиотику неомицину в растения табака, а с помощью CMV-вируса — ген устойчивости к ингибитору дигидрофолатредуктазы метотрексату в растения репы.

Генетическая инженерия растений включает манипуляции не только с ядерным геномом клеток, но также с геномом хлоро-пластов и митохондрий. Именно в хлоропластный геном наиболее целесообразно вводить ген азотфиксации для устранения потребности растений в азотных удобрениях. В митохондриях кукурузы найдены две плазмиды (S-1 и S-2), обусловливающие цитоплаз-матическую мужскую стерильность. Если селекционерам необходимо «запретить» самоопыление кукурузы и допустить лишь перекрестное опыление, они могут не заботиться об удалении тычинок вручную, если берут для оплодотворения растения с цитоплазматической мужской стерильностью. Такие растения могут быть выведены путем длительной селекции, однако генетическая инженерия предлагает более быстрый и целенаправленный метод — прямое введение плазмид в митохондрии клеток кукурузы. К разработкам в области генетической инженерии растений следует отнести также генетическую модификацию симбионтов растений — клубеньковых бактерий рода Rhizobium. В клетки этих бактерий с помощью плазмид предполагается вводить hup (hydrogen uptake)-ген, в природе существующий лишь у некоторых штаммов R. japonicum и R. l eguminosarum. Нир-ген обусловливает поглощение и утилизацию газообразного водорода, высвобождаемого при функционировании азотфиксирующего ферментного комплекса клубеньковых бактерий. Рециклизаиия водорода позволяет избежать потерь восстановительных эквивалентов при симбиотической азотфиксации в клубеньках бобовых растений и значительно повысить продуктивность этих растений.

Отдаленной задачей пока остается применение методов генетической инженерии для улучшения пород сельскохозяйственных животных. Речь идет об увеличении эффективности использования кормов, повышении плодовитости, выхода молока и яиц, устойчивости животных к заболеваниям, ускорении их роста, улучшении качества мяса. Однако до сих пор не выяснена генетика всех этих признаков сельскохозяйственных животных, что препятствует попыткам генетических манипуляций в этой области.

 

9. Клеточная инженерия и ее использование в создании микроорганизмов и клеток растений. Метод слияния протопластов.

Клеточная инженерия — одно из наиболее важных направлений в биотехнологии. Она основана на использовании принципиально нового объекта — изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности — уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. При решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения зна чительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.

В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового класса фитогормонов — цитокининов — оказалось, что при совместном их действии с другим классом фитогормонов — ауксинами — появилась возможность стимулировать деление клеток, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в контролируемых условиях.

В 1959 г. был предложен метод выращивания больших масс клеточных суспензий. Важным событием стала разработка Е. Коккингом (Ноттингемский университет, Великобритания) в 1960 г. метода получения изолированных протопластов. Это послужило толчком к получению соматических гибридов, введению в протопласты вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морелом и Р. Г. Бутенко был предложен метод клонального микроразмножения, который сразу же нашел широкое практическое применение. Весьма важным достижением в развитии технологий культивирования изолированных тканей и клеток стало культивирование одиночной клетки с помощью ткани«няньки». Этот мстод был разработан в России в 1969 г. в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН под руководством Р. Г. Бутенко. В последние десятилетия продолжается быстрый прогресс технологий клеточной инженерии, позволяющих значительно облегчить селекционную работу. Большие успехи достигнуты в развитии методов получения трансгенных растений, технологий использования изолированных тканей и клеток травянистых растений, начато культивирование тканей древесных растений.

Впервые термин «изолированные протопласты» был предложен Д. Ханстейном в 1880 г. Протопласт в целой клетке можно наблю-дать во время плазмолиза. Изолированный протопласт — это содержимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой. Целлюлозная стенка у данного образования отсутствует. Изолированные протопласты — одни из наиболее ценных объектов в биотехнологии. Они позволяют исследовать различные свойства мембран, а также транспорт веществ через плазмалемму. Главное их преиму-щество состоит в том, что в изолированные протопласты достаточно легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и из клеток животных. Е. Коккинг установил, что изолированный протопласт благодаря механизму пиноцитоза способен поглощать из окружающей среды не только низкомолекулярные вещества, но и крупные моле-кулы, частицы (вирусы) и даже изолированные органеллы.

Большое значение в создании новых форм растений для изуче-ния взаимодействия ядерного генома и геномов органелл имеет способность изолированных протопластов сливаться, образуя гибридные клетки. Таким способом можно добиться получения гибридов от растений с разной степенью таксономической удален-ности, но обладающих ценными хозяйственными качествами.

Впервые протопласты были выделены Дж. Клернером в 1892 г. при изучении плазмолиза в клетках листа телореза {Stratiotes aloides) во время механического повреждения ткани. Поэтому этот метод назван механическим. Он позволяет выделить лишь небольшое количество протопластов (вьщеление возможно не из всех видов тканей); сам метод длительный и трудоемкий. Современный метод выделения протопластов заключается в удалении клеточной стенки с помощью поэтапного использования ферментов для ее разрушения: целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы. Этот метод получил название ферментативного.

Первое успешное выделение протопластов из клеток высших растений данным методом сделано Е. Коккингом в 1960 г. По сравнению с механическим ферментативный метод имеет ряд преимуществ. Он позволяет сравнительно легко и быстро выделять большое количество протопластов, причем они не испытывают сильного осмотического шока. После действия ферментов смесь протопластов пропускают через фильтр и центрифугируют для удаления неразрушенных клеток и их осколков.

Выделить протопласты можно из клеток растительных тканей, культуры каллусов и суспензионной культуры. Оптимальные условия для изоляции протопластов для разных объектов индивидуальны, что требует кропотливой предварительной работы по подбору концентраций ферментов, их соотношения, времени обработки. Очень важным фактором, позволяющим выделять целые жизнеспособные протопласты, является подбор осмотического стабилизатора. В качестве стабилизаторов обычно используют различные сахара, иногда ионные осмотики (растворы солей СаС1₂, Na₂HP0₄, КСІ). Концентрация осмотиков должна быть немного гипертонична, чтобы протопласты находились в состоянии слабого плазмолиза. В этом случае тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки.

Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же среды, на которых растут изолированные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у протопластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолированная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов сопряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбриогенез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией последовательного образования корней и побегов (органогенез) добились регенерации растений табака, петунии и некоторых других растений. Следует отметить, что протопласты, изолированные из генетически стабильной клеточной культуры, чаще регенерируют растения и с большим успехом используются при исследованиях генетической модификации протопластов.

 

10. Методы клеточной инженерии применительно к животным клеткам. Гибридомная технология и ее использование в биотехнологических процессах.

В 1975 г. Г. Келер и К. Мильштейн сумели впервые выделить клоны клеток, способные секретировать только один тип молекул антител и в то же время расти в культуре. Эти клоны клеток были получены слиянием антителообразующих и опухолевых клеток — клеток–химер, названных гибридомами, так как, с одной стороны, они наследовали способность к практически неограниченному росту в культуре, а с другой стороны, способность к продукции антител определенной специфичности (моноклональных антител).

Весьма существенно для биотехнолога то, что отобранные клоны могут длительно храниться в замороженном состоянии, поэтому в случае необходимости можно взять определенную дозу такого клона и ввести животному, у которого будет развиваться опухоль, продуцирующая моноклональные антитела заданной специфичности. Вскоре в сыворотке животного будут обнаружены антитела в очень высокой концентрации от 10 до 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела получатъ из культуральной жидкости.

Создание гибридом, которые можно хранить в замороженном состоянии (криоконсервирование), позволило организовать целые гибридомные банки, что в свою очередь открыло большие перспективы по применению моноклональных антител. Сфера их применения помимо количественного определения разных веществ включает самую разнообразную диагностику, например идентификацию определенного гормона, вирусных или бактериальных антигенов, антигенов группы крови и тканевых антигенов.

Этапы получения гибридных клеток. Слиянию клеток предшествует установление тесного контакта между плазматическими мембранами. Этому препятствует наличие поверхностного заряда на природных мембранах, обусловленного отрицательно заряженными группами белков и липидов. Деполяризация мембран переменным электрическим или магнитным полем, нейтрализация отрицательного заряда мембран с помощью катионов способствует слиянию клеток. На практике широко используются ионами Са2+, хлорпромазином. Эффективным «сливающим» (фузогенным) агентом служит полиэтиленгликоль.

По отношению к животным клеткам применяют также вирус Сендай, действие которого как сливающего агента, по-видимому, связано с частичным гидролизом белков цитоплазматической мембраны. Участок субъединицы FI вируса обладает протеолитической активностью (С. Nicolau et al., 1984). Растительные, грибные и бактериальные клетки перед слиянием освобождают от клеточной стенки, при этом получаются протопласты. Клеточную стенку подвергают ферментативному гидролизу, применяя лизоцим (для бактериальных клеток), зимолиазу улитки (для клеток грибов), комплекс циллюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ, продуцируемый грибами (для клеток растений). Набухание и последующее разрушение протопластов предотвращается созданием повышенной осмолярности среды. Подбор гидролитических ферментов и концентрации солей в среде с целью обеспечения максимального выхода протопластов представляет собой сложную задачу, решаемую в каждом случае отдельно.

Для скрининга полученных гибридных клеток используют различные подходы: 1) учет фенотипических признаков; 2) создание селективных условий, в которых выживают лишь гибриды, объединившие геномы родительских клеток.

Возможности метода слияния клеток. Метод слияния соматических клеток открывает перед биотехнологией значительные перспективы.

1. Возможность скрещивания филогенетически отдаленных форм живого. Путем слияния клеток растений получены плодовитые, фенотипически нормальные межвидовые гибриды табака, картофеля, капусты с турнепсом (эквивалентные природному рапсу), петунии. Имеются стерильные межродовые гибриды картофеля и томата, стерильные межтрибные гибриды арабидопсиса и турнепса, табака и картофеля, табака и беладонны, которые образуют морфологически ненормальные стебли и растения. Получены клеточные гибриды между представителями различных семейств, существующие, однако, лишь как неорганизованно растущие клетки (табака и гороха, табака и сои, табака и конских бобов). Получены межвидовые (Saccharomyces uvarum и S. diastalicus) и межродовые (Kluyveromyces lactis и S. cerevisiae) гибриды дрожжей. Имеются данные о слиянии клеток различных видов грибов и бактерий.

Несколько курьезными представляются опыты по слиянию клеток организмов, относящихся к различным царствам, например клеток лягушек Xenopus taevis и протопластов моркови. Гибридная растительно-животная клетка постепенно одевается клеточной стенкой и растет на средах, на которых культивируют растительные клетки. Ядро животной клетки, по-видимому, достаточно быстро теряет свою активность (Е. С. Cocking, 1984).

2. Получение асимметричных гибридов, несущих полный набор генов одного из родителей и частичный набор другого родителя. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клеток, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей.

Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос из клетки в клетку нужной хромосомы. Представляет также интерес получение клеток, у которых гибридной является только цитоплазма. Цитоплазматические гибриды образуются, когда после слияния клеток ядра сохраняют свою автономию и при последующем делении гибридной клетки оказываются в разных дочерних клетках. Скрининг таких клеток проводится по генам-маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов.

Клетки со слившейся цитоплазмой (но не ядрами) содержат ядерный геном одного из родителей и в то же время совмещают Цитоплазматические гены слившихся клеток. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках.

Получение гибридов путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут быть выращены растения (грибы)-регенеранты.

Гибридизация клеток, несущих различные программы развития, — слияние клеток различных тканей или органов, слияние нормальных клеток с клетками, программа развития которых изменена в результате злокачественного перерождения. В этом случае получаются так называемые гибридомные клетки, или гибридомы, наследующие от нормальной родительской клетки способность к синтезу того или иного полезного соединения, а от злокачественной — способность к быстрому и неограниченному росту.

Гибридомная технология. Получение гибридом на сегодняшний день — наиболее перспективное направление клеточной инженерии. Основная цель — «обессмертить» клетку, продуцирующую ценные вещества путем слияния с раковой клеткой и клонирования полученной гибридомной клеточной линии. Гибридомы получены на основе клеток — представителей различных царств живого. Слияние клеток растений, растущих в культуре обычно медленно, с клетками растительных опухолей позволяет получить клоны быстрорастущих клеток — продуцентов нужных соединений. Многообразны применения гибридомной технологии к животным клеткам, где с ее помощью планируется получение неограниченно размножающихся продуцентов гормонов и белковых факторов крови, Наибольшее практическое значение имеют гибридомы — продукты слияния клеток злокачественных опухолей иммунной системы (миелом) с нормальными клетками той же системы—лимфоцитами.

При попадании в организм животного или человека чужеродного агента — бактерий, вирусов, «чужих» клеток или просто сложных органических соединений — лимфоциты мобилизуются для обезвреживания введенного агента. Имеется несколько популяций лимфоцитов, функции которых различаются. Существуют так называемые Т-лимфоциты, среди которых выделяются Т-киллеры («убийцы»), непосредственно атакующие чужеродный агент с целью его инактивации, и В-лимфоциты, основная функция которых состоит в продукции иммунных белков (иммуноглобулинов), обезвреживающих чужеродный агент путем связывания с его поверхностными участками (антигенными детерминантами), иными словами, В-лимфоциты вырабатывают иммунные белки, представляющие собой антитела к чужеродному агенту — антигену.

Слияние Т-лимфоцита-киллера с опухолевой клеткой дает клон неограниченно размножающихся клеток, выслеживающих определенный антиген — тот, к которому был специфичен взятый Т-лимфоцит. Подобные Т-киллерные гибридомные клоны пытаются использовать для борьбы с раковыми клетками непосредственно в организме больного (Б. Фукс и др., 1981; 1983),

При слиянии В-лимфоцита с миеломной клеткой получаются В-гибридомные клоны, широко применяемые как продуценты антител, нацеленных на тот же антиген, что и антитела, синтезируемые породившим клон В-лимфоцитом, т. е. моноклопальных антител. Моноклональные антитела однородны по своим свойствам, они обладают одинаковым сродством к антигену и связываются с. одной единственной антигенной детерминантой. В этом состоит важное преимущество моноклональных антител — продуктов В-гибридом, по сравнению с антителами, получаемыми без применения клеточной инженерии, путем иммунизации лабораторного животного избранным антигеном с последующим выделением антител из сыворотки его крови или в результате непосредственного взаимодействия антигена с популяцией лимфоцитов в культуре ткани. Подобные традиционные методы дают смесь антител, различных по специфичности и сродству к антигену, что объясняется участием в выработке антител многих различных клонов В-лимфоцитов и наличием у антигена нескольких детерминант, каждая из которых соответствует особому типу антител. Таким образом, моноклональные антитела избирательно связываются лишь с одним антигеном, инактивируя его, что имеет большое практическое значение для распознавания и лечения заболеваний, вызываемых чужеродными агентами — бактериями, грибками, вирусами, токсинами, аллергенами и трансформированными собственными клетками (раковые опухоли), Моноклональные антитела успешно применяют в аналитических целях для изучения клеточных органелл, их структуры или отдельных биомолекул.

До недавнего времени для гибридизации использовали исключительно миеломные клетки и В-лимфоциты мыши и крысы. Продуцируемые ими моноклональные антитела имеют ограниченное терапевтическое применение, так как они сами представляют чужеродный белок для человеческого организма. Освоение технологии получения гибридом на основе иммунных клеток человека связано со значительными трудностями: человеческие гиб-ридомы растут медленно, сравнительно мало стабильны. Однако уже получены гибридомы человека — продуценты моноклональ-ных антител. Оказалось, что и человеческие моноклональные антитела в некоторых случаях вызывают иммунные реакции, и их клиническая эффективность зависит от правильного подбора класса антител, гибридомных линий, подходящих для данного больного. К достоинствам человеческих моноклональных антител относится способность распознавать тонкие различия в структуре антигена, которые не распознаются моноклональными антителами мыши или крысы. Предприняты попытки получения химерных гибридом, сочетающих мышиные миеломные клетки и человеческие В-лимфоциты; такие гибридомы находят пока лишь ограниченное применение tK- Haron, 1984).

Наряду с несомненными преимуществами моноклональные антитела имеют и недостатки, порождающие проблемы при их практическом использовании. Они не стабильны при хранении в высушенном состоянии, в то же время в смеси обычных (поли-клональных) антител всегда присутствует группа антител, устойчивая при избранных условиях хранения. Таким образом, неоднородность обычных антител дает им дополнительный резерв стабильности при изменении внешних условий, что соответствует одному из основных принципов повышения надежности систем. Моноклональные антитела нередко имеют слишком низкое сродство к антигену и чрезмерно узкую специфичность, что препятствует их применению против изменчивых антигенов, характерных для инфекционных агентов и опухолевых клеток. Необходимо отметить также очень высокую стоимость моноклональных антител на международном рынке.

Общая схема получения гибридом на основе миеломных клеток и иммунных лимфоцитов включает следующие этапы.

1. Получение мутантных опухолевых клеток, погибающих при последующей селекции гибридомных клеток. Стандартным подходом является выведение линий миеломных клеток, не способных к синтезу ферментов запасных путей биосинтеза пуринов и пиримидинов из гипоксантина и тимидина соответственно (рис 6). Отбор таких мутантов опухолевых клеток проводят с применением токсических аналогов гипоксантина и тимидина. В среде, содержащей эти аналоги, выживают только мутантные клетки, которые лишены ферментов гипоксантингуанинфосфори-бозилтрансферазы и тимидинкиназы, необходимых для запасных путей биосинтеза нуклеотидов.

Получение лифмоцитов — продуцентов антител к заданным антигенам. Животное (мышь, реже крысу, кролика) иммунизируют введением антигена в брюшную полость, внутривенно или подкожно. Для получения человеческих гибридом прибегают к иммунизации лимфоцитов человека в культуре ткани, что является более сложной и многоэтапной процедурой.

Слияние лимфоцитов с опухолевыми клетками: сливающим агентом служит полиэтиленгликоль, реже лизолецитин или вирус Сендай, а также мощное электрическое поле. Для успешного слияния клеток мышей и человека последние предварительно обрабатывают проназой, нейраминидазой или диспазой.

Скрининг гибридомных клеток. Применяют селективную среду НАТ, содержащую аминоптерин, блокирующий синтез нуклеотидов по основным путям, и предшественники запасных путей биосинтеза — гипоксантин и тимидин (рис. 6). На этой среде родительские миеломные клетки погибают как генетически дефектные по ферментам запасных путей биосинтеза нуклеотидов. Родители-лимфоциты, не слившиеся с миеломными клетками, тоже погибают, поскольку они не способны расти вне организма в заданных условиях. Гибридомные клетки сочетают в себе способность к неограниченному росту и к синтезу нуклеотидов по запасным путям и поэтому накапливаются в культуре.

Проверка способности гибридомных клеток продуцировать моноклональные антитела к заданному антигену. Для этого используют метод иммуносорбентов. Образец культуральной жидкости с гибридомными клетками вводят в реакцию с соответствующим антигеном, прочно закрепленным на носителе. Для распознавания комплекса антиген — антитело к используемым антителам получают вторые антитела путем иммунизации этими иммуноглобулинами животного (например, иммуноглобулины мыши вводят в организм козы). Эти вторые антитела ковалентно связывают с каким-либо ферментом (например, с щелочной фосфатазой или пероксидазой). Если вырабатываемые гибридомой антитела действительно связывают заданный антиген, то добавление к ним вторых антител с пришитым ферментом ведет к образованию комплекса антиген — моноклональное антитело — антитело к моноклональному антителу — фермент. Последующее добавление субстрата, соответствующего ферменту, запускает ферментативную реакцию, протекание которой регистрируется по образованию ярко окрашенного продукта.

Существуют радиоиммунный и иммунофлуоресцентный варианты метода. Здесь антитела к иммуноглобулинам несут не фермент, а радиоактивную или флуоресцирующую метку.

Клонирование гибридомных клеток, прошедших проверку на образование моноклональных антител, с постоянным контролем на стабильность их иммунных свойств.

Массовое культивирование гибридомы, выделение, концентрирование и очистка продуцируемых антител. Помимо выращивания гибридомных клеток в культуре, для получния больших количеств моноклональных антител используют внутрибрю-шинное заражение мышей гибридомными клетками.

Ряд других приложений метода слияния клеток относится к растениям и микроорганизмам, для которых освоена технология выращивания новых полноценных особей из слившихся протопластов.

 

11. Понятие вектора в генетической инженерии. Плазмиды, транспозоны и фаговые ДНК. Их значение при конструировании продуцентов.

Вектор – вирус, плазмида или иная частица, с помощью которой осуществляется перенос ДНК.

Для введения рекомбинантной ДНК применяют два основных вектора:

1) Плазмиды.

2) Бактериофаги.

Плазмиды представляют собой внехромосомный генетический элемент в виде кольцевых молекул ДНК, содержащих 13% генома бактериальной клетки. Плазмиды есть у всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (Рплазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (Кплазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию метаболитов (плазмиды деградации). Каждая плазмида содержит сайт начала репликащи, без которого репликация плазмиды в клеткехозяине невозможна. Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной клетке обнаружено до 10 разных плазмид, каждая из которых выполняла свои функции и относилась к своей группе несовместимости. Репликация плазмид идет независимо от репликации хромосом. Количество копий определяется регуляторной системой клетки.

Таким образом, плазмиды обладают свойствами, позволяющими использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента.

Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инженерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественного вектора» свойств:

• небольшого размера, так как эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. соіі снижается при длине плазмиды более 15 тысяч пар нуклеотидов;

• наличия сайта рестрикции, в который осуществлена вставка;

• наличия одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42 °С в теченйе 1,5 мин. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации 1000, т.е. на каждую тысячу клеток приходится одна трансформированная. Частота трансформации не бывает 100%й, затем используют схемы отбора, позволяющие идентифицировать трансформированные клетки.

В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (донорного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличать трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки.

Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность. к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клеткихозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям:

1) Наличию нескольких сайтов для клонирования;

2) Возможности достаточно простой идентификации клеток с рекомбинантными ДНК.

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используется Е. соіі в качестве клеткихозяина. Кпетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетентность Е.соlі повышают, используя специальные условия культивирования. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов Е. соlі была сконструирована плазмида, содержащая сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов — полилинкер.

Эффективными методами трансформации Е. соlі плазмидами является электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим током для увеличения их проницаемости). Для введения клонированных генов в соматические клетки также применяют микроинъекциии микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).

Использование бактериофагов в качестве носителей генетической информации основано на том, что рекомбинантный ген встраивается в геном вируса и в последующем реплицируется с генами вируса при размножении в инфицированной клетке хозяина. С этой целью применяют бактериофаг –вирус с двухцепочечной ДНК, которая после проникновения в клетку смыкается в кольцо. Бактериофаг М13 вирус нитевидной формы с кольцевой замкнутой ДНК, которая в клетке превращается в двухцепочечную и реплицируется в клетках потомках. В поисках эукариотических систем экспрессии, для получения биологически активных белков, созданы бакмиды экспрессцрующие векторы на основе бакуловирусов для Е. соlі и клеток насекомых. Выход рекомбинантных бакуловирусов в такой системе повысился до 99%. Клетки насекомого, инфицированные бакуловирусами, синтезировали гетерологичный белок. Векторы на основе фага удобны для создания клонеток (банка генов), но не для тонких манипуляций с фрагментом ДНК. Для детального изучения и преобразования фрагменты ДНК переклонируют в плазмиды.

Кроме указанных векторов в генной инженерии применяют космиды плазмиды, несущие созучасток (комплементарные липкие концы) ДНК фага X. Наличие созучастка позволяет производить упаковку ДНК в головку фага in vitro, что обеспечивает возможность их введения в клетку путем инфекции, а не трансформации. Фазмиды . гибриды между фагами и плазмидами — способны развиваться как фаг и как плазмида. Уступая космидам по клонирующей емкости, фазмиды дают возможность отказаться от переклонирования генов из фаговых в плазмидные векторы.

Таким образом, для получения любого белкового продукта необходимо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей мРНК. Для инициации транскрипции (синтеза РНК) в нужном сайте необходим промотор, для ее остановки терминирующий кодон.

Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, интенсивно используют обычные дрожжи S. сеrеѵіsіае; генетика, этих одноклеточных организмов хорошо изучена. Рекомбинантные белки, синтезированные в системах экспрессии S. сеrеѵіsіае, применяют в качестве вакцин и лекарственных препаратов

Придавать новые свойства существующим белкам, создавать уникальные ферменты возможно, производя специфические изменения с помощью плазмид или ПЦР. Клонированные гены позволяют получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящие к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом.

Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «липким» концам, т.е. взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4 —6 пар нуклео-тидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лига-зой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами:

При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшивамых фрагментов их достраивают; т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем. Для этой цели применяют так называемые линкеры (или «переходники») — короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы.

Линкерные фрагменты не толъко обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.

Возможно сшивание фрагментов и по тупым концам, когда концы фрагментов двунитевые.

В этом случае реакция лигирования имеет биохимические особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по «липким» концам.

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, ее разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептироватъ чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями:

1.Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции.

2.Иметь свойства репликона.

3.Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора.

В частности, для бактериальных векторов в качестве маркерных генов чаще всего используются гены, вызывающие устойчивость клеток к некоторым антибиотикам.

Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроен-ных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д.

Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов используют плазмиды.

Плазмидные векторы в настоящее время чрезвычайно разнообразны за счет следующих свойств:

– уменьшения размеров плазмиды вследствие изъятия участков, не обязательных для репликации (чем больше плазмида содержит уникальных участков узнавания для рестриктаз, тем она универ-сальнее);

– гибридизации векторов одного рода с другими векторами или природными плазмидами (например, получены гибридные векторы комбинацией плазмиды и фага X (при этом вновь сконструированная рекомбинантная ДНК должна сохранить репликационные свойства исходной плазмиды);

– использования новых плазмид;

– применения транспозонов;

– создания векторов с генетическими маркерами, позволяющими вести отбор рекомбинантных клонов.

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное применение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы — дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, например бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве векторов применяют сконструированные производные фага X и фагов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага X используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке. Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага X в качестве вектора.

Фаг М13 — это одноцепочечная циклическая ДНК длиной около 1 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки I одноцепочечная ДНК фага превращается в двуцепочечную репликативную форму (RF), которая подобна плазмиде. Фаговая ДНК содержит, кроме того, короткий участок из 500 нуклеотидов, названный как МП (межгенная последовательность), не существен-ный для ее жизнедеятельности. Именно в этот участок МП репли-кативной формы ДНК после расщепления ее с помощью лигазы вставляют чужеродную ДНК. Введение рекомбинантной двуцепо-чечной молекулы в клетку Е. со l і приводит к ее репликации, синтезу (+) цепи, упаковке последней в белковый чехол и выделению фага в среду. Инфицированная нитевидным фагом клетка продолжает делиться, выделяя в окружающую среду большое коли-чество фага. Этот фаг содержит в вирионе одноцепочечную циклическую ДНК, в которую встроена-одна из цепей чужеродной ДНК.

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чу-жеродными генами часто называют гибридными (или химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинант-ных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обра-ботку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком.

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий СаС1₂ их мембрана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от общей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бакте-рий на 1 см² поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации. С этой целью бактериальные колонии выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой. Далее приготовляют реплики: к фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцеллюлозный фильтр, который затем переносят на чашку Петри с плотной питательной средой, где образуются колонии, идентичные первым.

Затем фильтр-реплику подвергают щелочной обработке, при этом клетки в колониях лизируют и денатурированная ДНК из клеток связывается с нитроцеллюлозой в том участке, где была расположена соответствующая колония. При радиоактивной ДНК или РНК (меченной ³²Р или ¹²⁵J) выдерживание фильтра в растворе, содержащем радиоактивный полинуклеотид, приводит к гибридизации с комплементарными последовательностями. В итоге те участки фильтра, в которых находились рекомбинантные клоны с требуемой вставкой, оказываются радиоактивными и идентифицируются радиоавтографически.

 

12. Инженерная энзимология и повышение эффективности биообъектов. Иммобилизированные биообъекты и их преимущества.

Развитие приклaдной энзимологии долгое время сдерживалось доpоговизной чистых фермeнтных пpeпаратoв, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использования. Принципиaльнo нoвыe перспeктивы Oткрылись перед прикладной энзимологией в 60-e годы ХХ в. в peзультате появления на стыке химии и биологии новой отрасли - инжeнерной энзимологии. Ее зaдачи заключаются в развитии прогрессивных методов выделeния ферментов, их стабилизации и иммобилизации; конструировании катaлизатoрoв c нужными свойствaми и разработке наyчных основ их применения.

В частности, методами белковой инженерии, сущность которых состоит в изменении первичной стpyктyры природной молекулы фeрмeнта посрeдством химичecкой модификации само энзима или его гeна, удается принципиaльно трансформировать cтруктурy активного центpa и егo фyнкцию, модулиpовать субстратную специфичность и физико-химические cвойства фермента. Так, замена остатка глутамина-102 в молекyле лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малатдегидрогеназу. Описанным спoсoбом полyчены термостабильные формы лизоцима T-4 и субтилизина (каталитическая константа субтилизина изменeна в 100 paз), созданы гибридные фоpмы ферментной системы, цeнной в иммуноферментном анaлизе, сочетающие в себе свойства β–галактозидазы и β-галактокиназы.

Многие проблемы технологии синтеза opгaничecкиx соединений, пищевой и медицинской промышленности, мониторинга человека и oкрyжaющeй сpедь, зaщиты окрyжающей среды, энергетики не могyт быть решeны бeз иcпользования методов современной инженерной энзимологии.

Вaжным этапом развития инженеpной энзимологии стaла разработка способoв полyчения и использования иммобилизованных ферментов.

Известно широкое использование иммобилизованных ферментов в качестве стабильных биокатализаторов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов способны относительно долго осуществлять характерные для них биохимические процессы. Иммобилизованные клетки бактерий, грибов способны синтезировать соответствующие антибиотики; главное - подбор метода иммобилизации клеток - продуцентов антибиотиков, позволяющего сохранить способность клеток синтезировать большое количество того или иного антибиотика длительное время.

Растительные клетки весьма чувствительны к изменениям окружающей среды, и для их иммобилизации могут быть использованы только наиболее мягкие методы, например включение в гель кальция альгината. С помощью иммобилизации растительных клеток частично или полностью удаётся решить проблемы, связанные с использованием культур растительных тканей для получения сложных органических соединений. Например, иммобилизованные клетки Digitalis lanata спoсобны осуществлять 1-2-Р-гидроксилирование производного дигоксина с образованием дигитоксина - единственного препарата наперстянки, который используется во всём мире.

Разработана технология получения биологически активных веществ из биомассы растительных клеток, культивируемых в ферментерах различной вместимости суспензионным способом. Созданы коммерческие препараты (женьшень, шиконин и др.) Получен патент на штамм женьшеня ДАН-25.

Иммобилизованные клетки используют при трансформации стероидных соединений, так как некоторые стероидтрансформирующие ферменты, особенно гидроксилазы и дегидрогеназы, - весьма лабильные белки. В качестве носителей используют ПАА, ПВС, каррагенины, агар, кальция альгинат.

 

13. Иммобилизация биообъектов. Носители, используемые для иммобилизации.

Идея заключения фермента или какого-нибудь другого биологически активного вещества в полупроницаемую оболочку и использование такой микрокапсулы в различных отраслях медицины была высказана канадским исследователем Т.М.С. Чангом в конце 50-десятых годов. Микрокапсулированный фермент имеет много преимуществ по сравнению ферментом, находящемся в растворе. Повышается стабильность и соответственно срок действия микрокапсулированного фермента. Поэтому весьма важно для успешного практического использования микрокапсул, чтобы оболочка мембраны была легкопроницаемой для низкомолекулярных субстратов и продуктов реакции, а также атромбогенной, биосовместимой и биодеградирующей.

Поиск материалов для формирования микрокапсул идет по двум паправлениям:

1. Испытание синтетических материалов, часть из которых является био-деградируемыми;

2. Испытание биодеградируемых природных материалов. Синтетические материалы: нитрат целлюлозы, нейлон. силастик, полиакриламидный гель и др.

Из природных биодеградируемых материалов используются попе-речно сшитые белки, гепариновые комплексы, нейтральные липиды, мембраны эритроцитов.

В настоящее время микрокапсулируют не только отдельные ферменты, но и также сложные комплексы как гемолизат эритроцитов, мышечный экстракт, уреаза, вакцины, гормоны, антитела, при чем можно это делать совместно с магнитным материалом.

Использование микрокапсулированных ферментов можно осуществлять по двум направлениям:

1. Введение интеркорпорально в кровяное русло,

2. Применение в экстракорпоральных шунтах, когда через определенный объем микрокапсул перегоняется кровь больного человека (аппарат "искусственная почка")

Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной, а другое — в органической фазе. Примером может служить образование на поверхности раздела фаз микрокапсулы, получаемой путем поликонденсации гексаметилендиамина-1,6 (водная фаза) и галогенангидрида себациновой кислоты (органическая фаза):

Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни микрометров, а толщина мембраны — сотые доли микрометра.

Достоинства метода микрокапсулирования — простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования). Особенно существенно, что методом микрокапсулирования могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Методы двойного эмульгирования. Применим для капсулирования жидких веществ.

Обычно этот способ технологически осуществляется следующим образом. Нагретую эмульсию масляного раствора лекарственного вещества, стабилизированную желатином (эмульсия типа М/В), дисперги-руют в охлажденном жидком парафине с помощью мешалки. В результате охлаждения мельчайшие капельки покрываются быстро застудневающей желатиновой оболочкой. Застывшие шарики отделяют от жидкого парафина, промывают органическим растворителем и сушат. Размер микрокапсул, получаемых таким способом, обычно колеблется в пределах 100—150 мкм.

Включение ферментов в волокна

Фермент, включенный в волокно, может существоватъ в растворе, находясь непосредственно в окружении самого волокна (обычные волокна) или в ограниченной его части - полой области (полые волокна). Для получения волокон первого типа различные полимеры (целлюлоза, триацетат целлюлозы, нитроцеллюлоза, этилцеллюлоза, поливинилхлорид) растворяют в органическом растворителе, эмульгируют с раствором или суспензией фермента, затем продавливают между мелкое сито в коагулирующую жидкость. Образуюшиеся волокна представляют собой полимерные гели, которые содержат в своей структуре водный раствор фермента. Уровень активности фермента. включенного в волокна, ниже чем в нативном состоянии. С другой стороны, стабильность фермента. заключенного в волокно выше, чем фермента в растворе.

Волокна второго типа, так называемые полые волокна, изготовляются из природных или синтетических полимеров, и имеют внутреннюю полую область. Полая область заполняется ферментом, который удерживается за счёт физической иммобилизации или химической связи между активными группами фермента и группами, находящимися на внутренней поверхности волокна. Полые волокна большого размера называют трубками.

Каталитические свойства ферментов, включенных в волокна, используются в медицине в экстракорпоральных шунтах для детоксикации организма при различных патологических состояниях: в ферментных реакторах, для диагностических целей.

Включение в липосомы. Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

Липосомы - искусственно полученные, замкнутые, сферические частипы, образованиые бимолекулярными липидными слоями, чаще всего фосфолипидами, в пространстве, между которыми содержится среда формирования. Благодаря особенностям структуры липосомы могут использоваться для доставки как гидрофильных (заключённые в водное пространство бислои), так и гидрофобных (заключённые в липидные бислои) лекарственных веществ.

Разработкой липосомальных форм Лекарственных препаратов занимаются в настоящее время более 10 западных фирм. Ведущими в этой области являются три американские фирмы:

"Le Liposome compani",

"Liposome Thechnology tne" ct

"Vestor"

Фосфолипиды, имеющие гидрофильные и гидрофобные группировки, образуют в водных растворах при высокой концентраиии замкнутые сферические бислойные структуры, внутрь которых могут быть заключены лекарственные вещества, что и легло в основу технологии липосом. Структура липосом напоминает клеточную мембрану. Поэтому липосомы являются физиологическим материалом, который организм легко может утилизировать, они легко проникают через различные физиологические барьеры и усиливают процесс адсорбции препарата в организме, заключённые внутрь липосом препараты не диффундируют , поэтому при введении таких препаратов не наблюдаются иммунные и другие системные реакции организма. Распадаются липосомы естественным путём, высвобождая заключённое в них лекарственное ве-щество. Они, таким образом, обеспечивают контролируемое высвобожде-ние лекарственного вещества и позволяют применять более высокие дози-ровки препаратов. Кроме того, липосомы имеют тенденцию накапливаться в определённых тканях (например, в печени, селезёнке, лёгких и пр.), что позволяетосуществлять целенаправленный транспорт лекарственных веществ к органам-мишеням,

В зависимости от способа получения размер липосом может быть от 1000 А° до 2 - 10 мкм. Для доставки лекарственных веществ обычно применяются липосомы размером от 25 нм до нескольких микрометров. Способ получения определяет и структуру везикул - они могут быть однослойными (моноламиллярными) или многослойными (мультиламиллярными).

Липосомы можно вводить как перорально, так и парентерально. При этом в большинстве случаев отмечено повышение терапевтического эффекта и пролонгированное действие лекарственных веществ, что обусловлено их задержкой в системе циркуляции и замедленным разрушением ферментами плазмы.

При этом фосфолипиды липосомальной мембраны используются организмом как компоненты клеточных мембран или вовлекаются в метаболизм. Наличие мембраны. сходной по составу и структуре с цитоплазматической облегчает проникновение в клетки посредством диффузии. слияния или пиноцитоза.

Заключение лекарственных вешеств в липосомы позволяет также снизить побочные действия токсичных препаратов.

Известно, что липосомы усиливают проникающую способность активных ингредиентов в кожу и, поэтому, перспективно их использование в дерматологии.

Включают в липосомы обычные, хорошо известные препараты, в частности противоопухолевые антибиотики, противогрибковые, а также вакцины и ферменты.

В качестве активных компонентов, включённых в липосомы, из-вестны и витамины А, Е, С, а также растительные экстракты - женьшеня, алоэ и др.

Получен липосомальный инсулин и установлен выраженный ги-погликемический эффект на белых беспородных крысах с индуцированным сахарным диабетом. Снижение уровня глюкозы в крови начиналось через 1 час после введения препарата, через 4 часа достигало максимального значения, действие продолжалось в течение 24 часов.

Учитывая сведения об избирательности захвата органами ретикулоэндотелиальной системы липосом, а также лимфоидномакрофильный характер туберкулёзных гранул, предложено использовать для химиотерапии туберкулёза липосомальные формы противотуберкулёзных препаратов - изониазида, стрептомицина.

Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран, поэтому изучение липосом имеет большое значение для понимания закономерностей процессов жизнедеятельности в клетке.

 

14. Микрокапсулирование биообъектов как один из методов их иммобилизации. Микрокапсулы. Характеристика. Вспомогательные вещества. Виды оболочек.

Этот способ иммобилизации ферментов разработан Т. Чангом (1964). Суть его состоит в том, что водный раствор фермента включают внутрь микрокапсул. представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембраной). В зависимости от условий получения размер микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров, а толщина мембраны составляет сотые — десятые доли микрометра, при диаметре пор порядка несколькнх нанометров. Существует два огновных способа получения микро-капсул. В первом из них водный раствор фермента сначала диспсргируется нри энергичном перемешивании в диэтиловом эфире, содержащем ПЛВ, которое выступает в роли эмульгатора. К полученной эмульсии, не прекращая перемешивания, добавляют эфирный раствор полимера, обычно нитрата целлю-лозы. При соприкосновснии с поверхностью эмульсионных капель этот полнмер, будучи нерастворимым в воде, образует тонкую оболочку-микрокапсулу. Готовые микрокапсулы отдсляют центрифугированием или фильтрованнем и промывают.

При втором способе микрокапсулирования образованне мембраны на поверхности водных микрокапель достигается за счет реакции межфазной поликонденсации двух компонентов, один из которых растворен в водных каплях эмульсии, а другой - в объеме органнческой фазы. Наиболее распространенными яв-ляются полиамндные микрокаисулы, получаемые, например, путем пбликонденсации 1,6-гексаметиленднамина (воднан фаза) и хлорангидрнда себаиновой кислоты (органическан фаза). Этот сиособ применим только для тех фсрмснтов, которые не инактивируютси при высоких значеннях рН, существующих в водных растворах диамина.

Водный раствор фермента, использующийся для получения микрокапсул, должен содержать инертный белок (обычно гемоглобин) в концентрации около 10%, который обсспсчивает в микрокапсулах нсобходимое внутрсннсе давление н стабилнзирует фермент. Для повышения стабильности микрокапсулированного фермента его нередко иодвергают также обработке глутаровым альдегндом, приводящсй к образованию внутри микрокапсул белковых полимеров. Кроме того, более высокой стабилыюсти можно добиться, если перед микрокапсулированием фермент предварительно иммобилизовать путем адсорбции на носителе, включения в гель или другим способом.

В некоторых случаях для иммобилизации применяются микрокапсулы, мембрана которых образоваиа ковалентно сшитыми между собой молекулами инертного белка. Такие микро-капсулы можно получить, если в методе с применением поликонденсации в систсму не вводить диамин. Тогда хлорангидрид дикарбоновой кнслоты (или другой используемый органорастворимый бнфункциональный сшивающий агент) будет образовывать ковалентные сшивки между молекулами инертиого белка, располагающимися на поверхности водной микрокапли.

 

15. Методы получения микрокапсул. Классификация. Характеристика. Технологические схемы производства.

Методы микрокапсулирования подразделяются на 3 группы:

• физические;

• физико-химические;

• химические.

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Суть физических методов заключается в механическом нанесении оболочки на твердые или жидкие частицы лекарственного вещества путем: дражирования; распыления; напыления в псевдоожиженном слое; напыления в вакууме; диспергирования в системе жидкость-жидкость; электростатического микрокапсулирования; микрокапсулирования с помощью центрифуги (экструзионный метод).

Физические методы выгодно отличаются от других методов микрокапсулирования тем, что в них капсулируемое вещество и раствор (или расплав) материала оболочки не контактируют до самого момента капсулирования.

Наиболее простым физическим методом микрокапсулирования является метод дражирования. При этом методе однородные фракции кристаллов загружают во вращающийся дражировочный котел, и они из форсунки покрываются раствором пленкообразователя. Образующиеся микрокапсулы высыхают в токе нагретого воздуха. Толщина оболочки в данном случае зависит от концентрации полимера, скорости распыления раствора полимера и температуры.

Получение микрокапсул с твердым ядром и жировой оболочкой проводится методом распыления. При этом методе твердое вещество суспендируют в растворе или расплаве жирового компонента (воск, цетиловый спирт, стеариновая кислота и др.) с последующим распылением раствора или суспензии в распылительной сушилке. В результате этого частицы капсулируемого вещества покрываются жидкими оболочками, которые затем затвердевают в результате исцарения растворителя или охлаждения расплава.

Процесс распыления при охлаждении считают удобным, но дорогим, его используют при получении микрокапсул витаминов, ферментов, антибиотиков. Метод сушки при распылении является одним из первых методов микрокапсулирования.

Метод диспергирования в несмешивающихся жидкостях можно использовать для жидких и твердых лекарственных веществ. Технология микрокапсул заключается в следующем:

• получают раствор пленкообразователя (водный, спиртовый или используют другой органический растворитель);

• в растворе пленкообразователя диспергируют лекарственное вещество, получая эмульсию или суспензию, или растворяют, получая гомогенную систему;

• раствор пленкообразователя с лекарственным веществом в виде тонкой струйки или капель подается в сосуд с работающей мешалкой и несмешивающейся жидкостью, часто с парафиновым маслом.

Попадающий в масло водный раствор пленкообразователя с распределенным в нем лекарственным веществом диспергируется на мелкие капельки, которые охлаждаются и затвердевают. Полученные микрокапсулы отделяют от масла, промывают и сушат.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОКАПСУЛ

Физико-химические методы микрокапсулирования основаны на разделении фаз и отличаются относительной простотой аппаратурного оформления, высокой производительностью, способностью заключать в оболочку лекарственное вещество в любом агрегатном состоянии.

Физико-химические методы можно подразделить на следующие: выделение новой фазы (простая и сложная коацерва-ция); испарение легколетучего растворителя в жидкой среде; затвердевание при охлаждении в жидкой среде и др.

Метод выделения новой фазы из раствора пленкообразующего вещества можно осуществлять как в водной среде, так и в среде органического растворителя. В основе водно-фазового разделения лежит явление коацервации — расслоение двух жидких фаз в растворах полимеров.

В определенных условиях однородные прозрачные растворы липидов, белков, нуклеиновых кислот, углеводов и других соединений могут расслаиваться на две жидкие фазы: фазу обедненную и фазу обогащенную этими веществами. Отделение более концентрированной фазы может происходить в виде слоя и в форме капель. Процесс фазового расслоения получил название коацервации, а вся система — коацерват (от лат. coacervare — сгребать в кучу). Коацервация начинается при изменении хотя бы одного из параметров дисперсной системы: температуры, состава рН, введение химических добавок и др.

Различают простую и сложную коацервацию. Простая коа-цервация имеет место при взаимодействии одного полимера и лекарственного вещества. Сложная коацервация — при взаимодействии двух полимеров, имеющих отрицательный и положительный заряд.

Процесс образования микрокапсул простой коацервацией может быть представлен следующей схемой, приведенной на рис. 63. Процесс протекает следующим образом. Капсулируе-мое вещество эмульгируют в растворе желатина. В качестве капсулируемого продукта берут растительные масла или масляные растворы витаминов (а). К раствору пленкообразователя добавляют 20% водный раствор натрия сульфата, который вызывает коацервацию желатина. Происходит образование двух жидких фаз — фазы с низким содержанием полимера и фазы с высоким содержанием полимера (б). Образование вокруг капсулируемого вещества «ожерелья» из коацерватов (в). Капли из «ожерелья» сливаются и образуют сплошную оболочку из полимера вокруг лекарственного вещества. Размер микрокапсул составляет 2—5 мкм (г). Для затвердения оболочек микрокапсул смесь быстро выливают в холодный раствор натрия сульфата. Затем микрокапсулы отфильтровывают и промывают водой для удаления раствора натрия сульфата.

Полученные микрокапсулы сушат в сушилках или водоот-нимающими средствами (этанол, формалин и др.).

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Основаны на образовании защитных покрытий вокруг ядер микрокапсулируемого вещества в результате реакций полимеризации или поликонденсации пленкообразующих компонентов.

Реакция полимеризации идет на границе жидкость — жидкость, жидкость — газ, твердое вещество — жидкость, твердое вещество — газ. Химические методы микрокапсуляции применяются для микрокапсулирования как твердых, так и жидких веществ. Процесс получения микрокапсул протекает в жидкой среде. Размеры получаемых микрокапсул можно изменять в широком диапазоне — от нескольких микрон до нескольких миллиметров, с содержанием микрокапсулирован-ного вещества до 99 %. Материал оболочки должен легко адсорбироваться на поверхности диспергированных частичек капсулируемого вещества, иначе полимер и капсулируемое вещество будут находиться в дисперсионной среде в виде отдельных составляющих.

Начальной стадией химических методов микрокапсулирования является получение эмульсий и суспензий. Выбор растворителя, материала оболочки микрокапсул определяется плотностью растворителя, его отношением к капсулируемому веществу и компонентам оболочки. Плотность дисперсионной среды должны быть близкой к плотности капсулируемого вещества (капсулируемое вещество не должно растворяться в дисперсионной среде), во избежание либо оседания, либо всплывания капсулируемого вещества. Этими методами можно получать нанокапсулы.

 

16.Липосомы. Определение. Характеристика. Использование в биотехнологических процессах и для создания инновационных лекарственных форм.

Впервые липосомы были использованы для включения ферментов Дж. Сесса и Дж. Вайсманом (1970). Значительный вклад в развитие этого направления принадлежит также Г. Грегориадису. Сушествует несколько способов получения липосом, содержаших включенный фермент. В олном из них раствор липида (обычно лецитина) в органнческом растворителе (напрнмер. в хлороформе) упарнвается в вакууме, и липид остается на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят водный раствор фермснта, встряхивают до полного удаления пленки липида со стенок колбы и оставляют иа некоторое времи. В полученной таким образом дисперсии липида происходит самопроизвольнос образование (самосборка) мультиламеллярных липосом, содержаших включенный фермент. Во избежанне окисления липида все операции необходимо проводить в атмосфере инертного газа.

В другом варианте метода раствор липида в органическом растворителе наслаивают на поверхность водного раствора фермента, после чего органический растворитель удаляют путем испарения в токе инертного газа, а образовавшуюся лнпидную пленку диспергируют в водном растооре. Недостаток этого способа состоит в том, что контакт с органическим растворителем может вызвать инактивацию фермента.

Для удалеиия невключившегося фермснта липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе. В случае моноламеллярных липосом, получаемых путем ультразвуковой обработки, разделение проводят методом гель-фильтрации на колонке.

Ферменты, иммобилизонанные путем включения в липосомы, применяются главным образом в медицинских целнх, а также при проведении фундаментальных исследований, поскольку такие системы близки к природным мембранам и их изучение может дать полезную информацию о ферментативных процессах в клетках.

Недавно был предложен новый способ иммобилизации ферментов путем включсния их в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу кратной связи. После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированного липида обычным способом, их подвсргают облучению ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора. При этом происходит полимернзацня мономерных молекул липида с обраэованием ковалентно сшитой замкнутой липидной бислойной мембраны. ГІолнмерные липосомы обладают гораздо более высокой стабильностью по сравнению с обычными.

 

17.Слагаемые технологического процесса. Структура биотехнологического производства.

Биотехнология как наука базируется на использовании биологических процессов в технике и промьпнленном производстве. Эти процессы - как совокупность последовательных действий специалистов направлены на достижение соответствуюпщх результатов при эксплуатации биообъектов.

Биотехнологические процесеы можно подразделить на биологические, биохимические и биоаналогичные. К первым относят те из ких, которые основываются на использовании акариот, прокариот и эукариот, вторые – на использовании ферментов и третьи (биоаналогичные) - на химическом синтезе или полусинтезе веществ, функционально близких или эквивалентных первичным или вторичным метаболитам живых организмов (получение производных пеницнллина и цефалоспорина, тетраниклина, нуклеиновых оснований и др.).

Процессы биотехнологии подразделяют по стадиям производства:

– подготовка оборудования и питательных сред,

– стерилизания.

– посев биообъекта,

– ферментация,

– выделение целевого продукта,

– очистка целевого продукта,

– сушка и упаковка целевого продукта,

Целевыми продуктами могут быть кормовые дрожжи, первичные и вторичные метабсдиты, Подготовка оборудования, питательных сред и все другие этапы получения целевого продукта различны по многим показателям. Процесс ферменгации осуществляется в герметизированных биореакторах.

После завершения ферментации отделяют либо клетки (клеточную массу), содержащие целевой продукт, либо жидкость. Культуральная жидкость содержит биообъект, недоиспользованные компоненты питательной среды, продукты метаболизма, включая ожидаемый конечный (целевой) продукт. Полученный разбавденный раствор подвергается концентрированию путем мембранной фильтрации и вакуум–упаривания.

Основной стадией является собственно биотехнологическая стадия, на которой с использованием того или иного биологического агента (микроорганизмов, изолированных клеток, ферментов или клеточных органелл) происходит преобразование сырья в тот или иной целевой продукт.

Обычно главной задачей биотехнологической стадии является получение определенного органического вещества.

Однако биотехнологическая стадия, как правило, включает в себя не только синтез новых органических соединений, но и ряд других биотехнологических процессов, перечисленных далее.

Ферментация — процесс, осуществляемый спомощью культивирования микроорганизмов.

Биотрансформация — процесс изменения химической структуры вещества под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов. В этом процессе обыч-но не происходит накопления клеток микроорганизмов, а химическая структура вещества меняется незначительно. Вещество как бы уже в основном готово, биотрансформация осуществляет его химическую модификацию: добавляет или отнимает радикалы, гидроксильные ионы, дегидрирует и т. п.

Биокатализ — химические превращения вещества, протекающие с использованием биокатализаторов-ферментов.

Биоокисление — потребление загрязняющих веществ с помощью микроорганизмов или ассоциации микроорганизмов в аэробных условиях.

Метановое брожение — переработка органических отходов с помощью ассоциации метаногенных микроорганизмов в анаэробных условиях.

Биокомпостирование — снижение содержания вредных органических веществ ассоциацией микроорганизмов в твердых отходах, которым придана специальная взрыхленная структура для обеспечения доступа воздуха и равномерного увлажнения.

Биосорбция — сорбция вредных примесей из газов или жидкостей микроорганизмами, обычно закрепленными на специальных твердых носителях.

Бактериальное выщелачивание — процесс перевода нерастворимых в воде соединений металлов в растворенное состояние под действием специальных микроорганизмов.

Биодеградация — деструкция вредных соединений под воздействием микроорганизмов-биодеструкторов.

Обычно биотехнологическая стадия имеет в качестве выходных потоков один жидкостной поток и один газовый, иногда только один — жидкостной. В случае, если процесс протекает в твердой фазе (например, созревание сыра или биокомпостирование отхо-дов), выходом является поток переработанного твердого продукта.

Подготовительные стадии

Подготовительные стадии служат для приготовления и подготовки необходимых видов сырья биотехнологической стадии.

На стадии подготовки могут быть использованы следующие процессы.

Приготовление среды, обычно жидкой, включающей необходимые компоненты питания для биотехнологической стадии.

Стерилизация среды —для асептических биотехнологических процессов, где нежелательно попадание посторонней микрофлоры.

Подготовка и стерилизация газов (обычно воздуха), необходимых для протекания биотехнологического процесса. Чаще всего подготовка воздуха заключается в очистке его от пыли и влаги, обеспечении требуемой температуры и очистке от присутствующих в воздухе микроорганизмов, включая споры.

Подготовка посевного материала. Очевидно, что для проведения микробиологического процесса или процесса культивирования изолированных клеток растений или животных необходимо подготовить и посевной материал — предварительно выращенное малое по сравнению с основной стадией количество биологического агента.

Подготовка биокатализатора. Для процессов биотрансформации или биокатализа необходимо предварительно подготовить биокатализатор — либо фермент в свободном или закрепленном на носителе виде, либо биомассу микроорганизмов, выращенную предварительно до состояния, в котором проявляется ее ферментативная активность.

Предварительная обработка сырья. Если сырье поступает в производство в виде, непригодном для непосредственного использования в биотехнологическом процессе, то проводят операцию по предварительной подготовке сырья. Например, при получении спирта пшеницу сначала дробят, а затем подвергают ферментатив-ному процессу «осахаривания», после чего осахаренное сусло на биотехнологической стадии путем ферментации превращается в спирт.

Другой пример — использование древесины для получения дрожжей. Древесину сначала измельчают, а затем подвергают нагреву до 200°С в кислой среде. В результате такого процесса кислотного гидролиза происходит превращение древесины в раствор глюкозы и лигнин. Раствор глюкозы (гидролизат) как раз и используется в биотехнологическом процессе для получения кормовых дрожжей.

---

Дата добавления: 2019-02-12; просмотров: 232; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!