Тема: Митохондриальный и хлоропластный геном эукариот

Занятие 1

Тема: Структура и функции белков

I . Первичная структура белков.

1. Аминокислотные остатки как мономеры белковых цепей. Различные типы аминокислот и их строение. С чем связан эволюционный отбор на преимущественное сохранение α-аминокислот?

2. Образование пептидной связи. Транс- и цис-пептидные связи.

3. Расскажите о значении изучения природных пептидов для решения проблем эволюции, систематики организмов, причин генетически детерминированных заболеваний человека.

4. Методы изучения первичной структуры белков:

· динитрофторбензольный метод Ф. Сангера (ДНФ-метод);

· метод Эдмана;

· гидролитическое расщепление белка с помощью протеолитических ферментов;

· расщепление белковой цепи по метиониновому остатку бромистым цианом;

· изучение нуклеотидной последовательности кДНК.

II . Вторичная структура белков.

5. Образование α-спирали белков и β-складчатых листов в глобулярных белках.

6. Связь вторичной структуры с аминокислотной последовательностью. Образование сверхвторичных структур. Белковые домены.

III . Третичная структура белков.

1. За счет каких сил происходит стабилизация трехмерной структуры белков? (гидрофобные взаимодействия, ионные и водородные связи, Ван-дер-ваальсовы взаимодействия)

2. Дайте определение процессам денатурация, ренатурация. Назовите факторы, влияющие на них.

3. Расскажите об опытах К. Анфинсена по ренатурации молекулы рибонуклеазы.

4. Что обозначают термины фолдинг, молекулярные шапероны, шаперонины.

IV . Четвертичная структура белков.

1. Назовите типы взаимодействия между субъединицами, стабилизирующие четвертичную структуру.

2. Расскажите о стехиометрии и геометрии четвертичной структуры белка (белки гетеро- и гомомерные, четное и нечетное число субъединиц)

3. Сравните строение молекул гемоглобина и инсулина.

4. В чем биологическое преимущество крупного белка, составленного из субъединиц, перед крупным мономерным белком?

Таблица 1-1

Особенности строения и свойств аминокислот живых организмов

Аминокислота	Структура боковой цепи	Особенности и свойства аминокислот в связи с их строением
алифатические
Глицин (Aly, A)	– H	Не имеет хирального С, Увеличивает подвижность полипептидной цепи в белках и способствует ее плотной упаковке
Аланин (Ala, A)	– CH₃	Самая распространенная в природе аминокислота, очевидно, в результате простоты строения и доступности для синтеза

Таблица 1-2

Особенности строения и функции белковых молекул

Структура (определение)	Особенности строения; связи, образующие структуру	Функциональное значение

Занятие 2

Тема: Нуклеиновые кислоты

1. Охарактеризуйте химический состав ДНК и РНК, укажите на сходство и различия этих полимеров.

2. Охарактеризуйте методы определения первичной структуры ДНК (химический метод Гилберта, метод дидезокситерминаторов Сангера, компьютерный анализ) и РНК.

3. На чем основана двунитевая структура молекулы ДНК?

4. Какие особенности структуры позволяют говорить о полиморфизме двойной спирали ДНК?

5. Какие формы ДНК выделяют?

6. Назовите ферменты, изменяющие топологию ДНК.

7. Назовите особенности макромолекулярной структуры РНК.

8. Какие виды РНК выделены? Дайте характеристику их пространственной структуры, назовите их функции.

9. Каково значение РНК в природе?

10. На основе учебного материала в тетради записать:

· структурные формулы нуклеотидов (рис.34 А,Б и из В некоторые формулы);

· анти- и син-конформации в нуклеотидах (рис.40), С3' эндо- и С2' эндоконформации углеводных остатков ДНК (рис.38)

11. Заполните таблицы:

Таблица 2-1

Характеристика ДНК-топомераз

Тип (подтип) ДНК-топомеразы	Влияние на мДНК	Особенности

Таблица 2-2

Структура и функции нуклеиновых кислот клетки

Нуклеиновых кислоты	Особенности строения	Функции

Занятие 3

Тема: Геном вирусов, прокариот и эукариот

1. Заполните пропуски в следующих утверждениях.

А. Вирусы, инфицирующие бактерии, называются _______________.

Б. Размножение вирусов летально для клетки-хозяина, если для того, чтобы образовавшиеся вирусные частицы вышли наружу, она должна _______________.

В. Белковая оболочка, окружающая вирусный геном, называется _______.

Г. Самый внешний покров у вирусов, ___________, – это типичная мембрана, обычно приобретаемая вирусными частицами в процессе отпочковывания от плазматической мембраны.

Д. Поскольку в нормальных клетках нет ферментов, которые непосредственно копировали бы РНК на матрице РНК, то вирусы с РНК-геномом должны кодировать _________ или ____________, чтобы реплицироваться.

Е. Если вирусная РНК выполняет роль непосредственно мРНК, то вирус называется ___________; если в роли мРНК выступает РНК, комплементарная вирусной, то вирус называется ______________.

Ж. ____________бактерии несут в своих хромосомах «дремлющий», но потенциально активный вирусный геном: интегрированный вирусный геном называют ____________; этот термин используется также при описании аналогичных вирусных геномов в клетках млекопитающих.

З. Вирусы, которые могут встраивать свою ДНК в бактериальные хромосомы, называются ______________.

И. Животные клетки, в которых не развивается литическая инфекция, вызванная ДНК-содержащими вирусами, называются _____________ клетками.

К. О животных клетках, которые вследствие вирусной инфекции из нормальных стали раковыми, говорят, что они подверглись ____________ , вызванной вирусом.

Л. Стабильные генетические изменения, вызываемые _____________, объясняются активностью фермента ___________, который транскрибирует цепи РНК с образованием комплементарных молекул ДНК.

М. ____________ генома перемещаются с места на место в геноме хозяина, используя свои собственные ферменты сайт-специфической рекомбинации, называемые _____________.

Н. Элемент Ту1 в геноме дрожжей служит примером _____________, для перемещения которого требуется синтез полного РНК-транскрипта; последний копируется с образованием двуспиральной ДНК и только затем встраивается в новый локус хромосомы.

О. Независимо реплицирующиеся элементы, называемые _________, могут реплицироваться произвольно вне хромосомы клетки-хозяина.

П. ____________, являющиеся возбудителями болезней растений, представляют собой мелкие одноцепочечные кольцевые молекулы РНК, которые не кодируют какой-либо белок.

Р. Вирусы захватывают иногда последовательности ДНК в одной клетке-хозяине и переносят их в другую клетку в процессе ____________ ДНК. (Этот процесс не следует путать с трансфекцией ДНК, при которой в клетку вводится свободная ДНК.)

2. Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие – нет. Если утверждение неверно, объясните почему.

А. Поскольку бактериофаг Т4 кодирует по крайней мере 30 разных ферментов, участвующих в репликации и транскрипции генома, то он совершенно не зависит от ДНК- и РНК-полимераз клетки-хозяина, хотя должен, конечно, пользоваться механизмом синтеза белка хозяина.

Б. Репликация мелких ДНК-содержащих вирусов, таких, как SV40 и φХ174, полностью зависит от механизма репликации клетки-хозяина.

В. Вирусы с негативным геномом не содержат генов, кодирующих какие-либо белки.

Г. У аденовируса имеются белки, присоединенные ковалентно к 5'-концам его генома; они играют роль затравки для инициации репликации, благодаря чему концы линейного генома полностью реплицируются.

Д. Когда бактериофаг лямбда заражает клетку Е. со li , он обычно вызывает литическую инфекцию, в процессе которой из клетки-хозяина выходит несколько сотен потомков этого вируса; гораздо реже вирус встраивается в хромосому клетки-хозяина, в результате чего образуется лизогенная бактерия, несущая хромосому с провирусом фага лямбда.

Е. Заражение ретровирусами часто приводит одновременно к нелетальному для клеток выходу потомства вируса и стабильному генетическому изменению инфицированной клетки, делающему ее раковой.

Ж. Вирусы, размножение которых связано с отпочковыванием от клеточных мембран клеток-хозяев, вызывают рак вследствие тех изменений, которые при этом отпочковывании происходят на клеточной поверхности.

3. Один из простых способов определить принадлежность вируса к РНК- или ДНК-содержащим вирусам – это выявить его отношение к актиномицину D: если его рост ингибируется этим антибиотиком, который блокирует синтез РНК, зависимый от ДНК, но не затрагивает репликаз, зависящих от РНК, то вирус должен содержать ДНК.

И. Транспозазы узнают достаточно обширные последовательности, окружающие сайты встраивания, так что транспозон не включается в середину гена и не вызывает его разрушения, которое могло бы стать летальным событием для клетки.

К. От подвижных элементов плазмиды отличаются своей способностью к репликации вне связи с хромосомой клетки-хозяина.

Л. Крупные вирусы с большей вероятностью, чем мелкие, должны иметь перекрывающиеся гены, потому что генов у них гораздо больше.

М. Вироиды являются необычными образованиями, потому что они не кодируют белки, но способны к репликации и вызывают ряд болезней у растений.

3. Вы выделили из животных клеток 3 разных вируса. Каждый из них содержит одноцепочечную РНК в качестве генома. Чтобы охарактеризовать, вы исследуете их с помощью двух тестов. Во-первых, вы очищаете РНК-геномы этих вирусов и определяете их способность служить мРНК в бесклеточной системе синтеза белка. Во-вторых, вы измеряете активность их эндогенных полимераз, для чего разрушаете мягким способом интактные вирусные частицы, затем инкубируете их либо с радиоактивными рибо-нуклеозидтрифосфатами, чтобы определить синтез РНК, либо с радиоактивными дезоксирибонуклеозидтрифосфатами, чтобы определить синтез ДНК. Результаты этого исследования представлены в табл. 3-1. Попробуйте на их основе кратко описать жизненный цикл каждого вируса и назовите какой-либо известный вирус с таким же циклом развития.

Таблица 3-1

	Синтез белка	Эндогенная полимераза
	Синтез белка	РНК	ДНК
Вирус 1	–	+	–
Вирус 2	+	–	–
Вирус 3	+	–	+

4. Заполните пропуски в следующих утверждениях.

А. Тандемные повторы простой последовательности называют ____________, поскольку впервые обнаруженные ДНК такого типа имели необычное соотношение нуклеотидов, что позволило выделить их из суммарной клеточной ДНК как минорные компоненты.

Б. Некоторые ___________ перемещаются в хромосомах с места на место в виде ДНК, тогда как многие другие перемещаются в форме промежуточной РНК.

В. Почти одновременное перемещение транспозонов нескольких типов, которое называется ____________, может приводить к катастрофическим изменениям в геноме.

Г. Две перемещаемые последовательности ДНК, образно говоря, наводнили геном человека: более длинный _______________, составляющий около 4% нашей ДНК, и более короткая ______________, составляющая около 5% нашей ДНК.

5. Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие – нет. Если утверждение неверно, объясните почему.

А. У любого конкретного вида функции большинства генов, вероятно, уже оптимизированы в отношении изменчивости, вызываемой точковыми мутациями.

Б. Тандемно повторяющиеся функциональные гены в основном остаются неизменными благодаря неравному кроссинговеру и конверсии генов, однако нефункциональная спейсерная ДНК, расположенная между ними, подвержена быстрой дивергенции.

В. Разделение дуплицированных генов с различающимися функциями, вероятно, способствует их стабилизации, предохраняя эти гены от процессов гомогенизации, которым подвергаются тесно сцепленные гены со сходными последовательностями.

Г. Длинные интроны, расположенные между экзонами, повышают вероятность рекомбинации, приводящей к дупликации экзонов или соединению экзонов разных генов.

Д. Отсутствие интронов в генах прокариот свидетельствует о том, что интроны возникли у эукариот через некоторое время после эволюционного разделения на линии эукариот и прокариот.

Е. Последовательности сателлитной ДНК обычно не транскрибируются и чаще всего локализованы в гетерохроматине, расположенном в области центромеры.

Ж. Подвижные элементы часто встречаются в геномах высших эукариот, но перемещаются они столь редко, что вносят весьма незначительный вклад в вариабельность видов.

3. Организация генома у высших эукариот – некодирующие участки длинные, кодирующие области короткие, а также регуляция транскрипции с большого расстояния способствуют тому, что передвижение подвижных элементов не разрушает кодирующие последовательности, но влияет на экспрессию генов.

И. Изменяя одновременно несколько свойств организма, транспозиционные взрывы повышают вероятность того, что два новых признака, комбинация которых может оказаться выгодной, проявятся у одной и той же особи в какой-либо популяции.

К. Поскольку Alu-последовательности транскрибируются РНК-полимеразой II, их передвижение по геному связано со встраиванием поблизости от промотора, узнаваемого полимеразой II.

6. Вы изучаете транспозон Тn10, существующий в прокариотических клетках, и придумали изящный эксперимент, с помощью которого можно выяснить, реплицируется ли Тn10 во время транспозиции или перемещается безотносительно к репликации ДНК. Ваша идея основана на ключевом различии между этими двумя механизмами: если транспозиция нерепликативная, то должны перемещаться обе родительские цепи Тn10, если же транспозиция репликативная, то должна перемещаться только одна родительская цепь (рис. 3-1). Вы собираетесь пометить отдельные цепи денатурированными цепями из двух различных Тn10. Чтобы эффективно вводить эти гетеродуплексные Тn10 в бактерии, вы используете ДНК бакте риофага лямбда, содержащую Тn10. Такая ДНК может быть приготовлена in vitro, а затем упакована в капсиды, чтобы образовался фаг, способный инфицировать клетки. Вы используете неактивный (по причине других мутаций) фаговый геном, так что он не может реплицироваться или встраиваться и в конце концов разрушается; таким образом, вкладом этого фагового генома можно пренебречь.

ДНК фага несет два слабо различающихся варианта Тn10, встроенные в один и тот же сайт. Оба Тn10 содержат ген устойчивости к тетрациклину и ген метаболизма лактозы (1асZ), но в одном из вариантов ген 1асZ инактивирован в результате мутации. Благодаря этому различию можно следить за двумя транспозонами Тn10, так как колонии бактерий с геном 1ас Z ⁺(если они инкубируются с соответствующим субстратом) становятся синими, а колонии бактерий с геном 1асZˉ остаются белыми. Вы денатурируете и затем ренатурируете смесь двух фаговых ДНК, в результате чего образуется смесь равных количеств гетеродуплексов и гомодуплексов (рис. 3-2). Затем вы осуществляете упаковку этой смеси в фаговые капсиды, заражаете 1асZˉ-бактерии и производите посев инфицированных бактерий в чашки Петри на среду, содержащую тетрациклин и субстрат, дающий окраску.

Если фаговая ДНК оказывается внутри бактерии, транспозон может встраиваться (с очень низкой частотой) в бактериальный геном, которому он передает свойство устойчивости к тетрациклину. Те немногие клетки, которые приобретают Тn10, выживают в селективных условиях и дают колонии. Когда вы подсчитываете большое число таких колоний, то устанавливаете, что примерно 25% из них – белые, 25% – синие и 50% – смешанные, с одним синим и одним белым секторами.

А. Объясните происхождение каждого вида бактериальных колоний и сделайте заключение о том, на какой тип транспозиции указывают приведенные выше наблюдения – репликативный или нерепликативный.

Б. Для своих экспериментов вы использовали реципиентный штамм бактерий, который не обладал способностью к репарации повреждений ДНК. Каким образом отличались бы результаты, если бы вы использовали штамм бактерий, способных исправлять повреждения в ДНК?

В. Интегрирование ДНК бактериофага лямбда в геном бактерий с помощью сайт-специфической рекомбинации происходит гораздо чаще, чем транспозиция. Как отличались бы результаты от рассмотренных выше, если бы вы использовали мутант бактериофага лямбда, который не может реплицироваться, но может встраиваться?

Рис. 3-1. Репликативная и нерепликативная транспозиция подвижного элемента. Подвижный элемент показан как гетеродуплекс, состоящий из двух генетически различающихся цепей – одна обозначена черным цветом, другая белым. В ходе репликативной транспозиции одна цепь остается в донорной ДНК, а другая переносится в ДНК реципиента. При нерепликативной транспозиции подвижный элемент вырезается из донорной ДНК и переносится целиком в ДНК реципиента.

Рис. 3-2 Образование смеси гетеродуплексов и гомодуплексов в результате денатурации и ренатурации двух различных геномов бактериофага лямбда, содержащих Тn10. Фаговая ДНК изображена линиями, а Тn10 – в виде прямоугольников. Мутационные различия между двумя элементами Тn10 показаны белыми и черными сегментами.

7. Расскажите об особенностях строения эукариотических генов, кодирующих белки (мозаичное строение: экзоны и интроны), регуляторных элементов генов, кодирующих белки (энхансеры и сайленсеры); рибосомные гены; гены тРНК; гистоновые гены.

8. Что представляют собой тандемные повторы, мини- и микросателлиты?

9. Метод ДНК-фингерпринтинга и его значение для изучения малых и изолированных популяций, выяснения природы и механизмов генетической изменчивости и факторов ее определяющих; паспортизация населения.

10. Дайте определение транспозона, ретротранспозона, ретропозона: псевдогены, ретрогены. Каково значение подвижных генетических элементов для эволюции геномов.

Занятие 4

Тема: Митохондриальный и хлоропластный геном эукариот

1. Назовите особенности строения митохондриального и хлоропластного геномов разных организмов и репликации их ДНК, заполнив таблицу

Параметры сравнения	Митохондрии	Хлоропласты

2. Заполните пропуски в следующих утверждениях.

А. Считается, что мутации, не наследуемые согласно правилам Менделя, которым подчиняется ядерная наследственность, проявляют ___________ и локализованы, по-видимому, в генах органелл.

В. У высших животных митохондрии попадают в зиготу главным образом с цитоплазмой яйца, поэтому такие митохондрии проявляют так называемую ____________ наследственность.

Д. _________ – это центральный метаболический путь для удаления азотсодержащих продуктов деградации у высших животных.

Е. Согласно _________ эукариотические клетки в начале своего эволюционного пути были анаэробными организмами, не содержащими митохондрий или хлоропластов, а затем установился их стабильный симбиоз с бактериями.

3. Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие-нет. Если утверждение неверно, объясните почему.

А. Каждая из органелл, в которых происходит превращение энергии, реплицирует свою ДНК синхронно с ядерной ДНК и делится вместе с клеткой, благодаря чему количество ДНК органелл поддерживается на постоянном уровне

Б. Хотя еще неизвестно, как ДНК уложена в органеллах, ее упаковка, по-видимому, ближе к упаковке бактериальных геномов, а не хроматина эукариот, поскольку в органеллах отсутствуют гистоновые белки.

В. По механизму синтеза белка хлоропласты очень сходны с бактериями, но сильно отличаются от митохондрий, у которых механизм синтеза белка сходен с цитоплазматическим.

Г. У высших растений многие рибосомные белки хлоропластов закодированы в ядре клетки, но эти ядерные гены имеют явно бактериальное происхождение.

Д. Генетический код в митохондриях несколько отличается от ядерного генетического кода, но он одинаков в митохондриях у всех изученных до сих пор видов.

Е. Простота генетической системы митохондрий и относительно низкая точность ее функционирования могут быть причинами повышенной частоты замещения нуклеотидов, наблюдаемой в митохондриальных геномах.

Ж. Митохондриальные геномы у растений сильно варьируют по содержанию ДНК, и все же они, по-видимому, кодируют всего лишь на несколько белков больше, чем гораздо более мелкие митохондриальные геномы животных клеток.

З. Наличие нитронов в генах органелл не должно удивлять, поскольку похожие интроны были обнаружены в сходных генах бактерий, от чьих предков, как принято считать, произошли митохондрии и хлоропласты.

И. Мутации, наследуемые по законам Менделя, затрагивают ядерные гены; мутации, которые не наследуются согласно этим законам, локализованы, по-видимому, в генах органелл.

К. Зеленые и белые пятна на пестрых листьях обусловлены митотической сегрегацией нормальных и дефектных митохондрий.

Л. Митохондрии, которые образуются путем простого деления, могут реплицироваться в пролиферирующих эукариотических клетках неопределенное число раз.

М. Функции митохондрий и хлоропластов, а также экспрессия их генов в значительной мере контролируются ядром клетки.

Н. В различных тканях одного организма митохондрии содержат одинаковый набор белков, закодированных в ядерном и митохондриальном геномах.

О. Перенос белков через мембраны митохондрий и хлоропластов происходит, по-видимому, через специальные адгезионные участки в местах контакта наружной и внутренней мембран этих органелл.

П. Хлоропласты сами синтезируют большую часть своих липидов, тогда как митохондрии получают их из цитоплазмы.

Р. Митохондрии как животных, так и растений произошли, вероятно, от особого вида пурпурных фотосинтезирующих бактерий, которые утратили способность к фотосинтезу и сохранили только дыхательную цепь.

4. У высших растений ДНК хлоропластов весьма постоянна по размеру молекул (120-180 т.п.н.) и по последовательности генов. В противоположность этому митохондриальные ДНК у растений чрезвычайно вариабельны по последовательности генов и размеру (от 218т.п.н. у турнепса до 2400 т.п.н. у мускусной дыни). Частично эта вариабельность может быть результатом переноса ДНК из хлоропластов в митохондрии.

В одном из экспериментов по изучению переноса генетического материала между геномами органелл был использован определенный фрагмент рестрикции из хлоропластов шпината, который кодировал ген большой субъединицы фермента рибулозобисфосфат-карбоксилазы. В митохондриальном геноме этот ген не обнаружен. ДНК митохондрий и хлоропластов выделяли из цуккини, кукурузы, шпината и гороха. Все препараты ДНК обрабатывали одной и той же рестриктазой и образовавшиеся фрагменты разделяли с помощью электрофореза. Затем фрагменты переносили на фильтр и гибридизовали с радиоактивным фрагментом-зондом, полученным из ДНК хлоропластов шпината. Результаты авторадиографии схематически представлены на рис. 4-1.

Рис. 4-1. Диаграммы гибридизации зонда из ДНК хлоропластов шпината с митохондриальной ДНК и ДНК хлоропластов из цуккини, кукурузы, шпината и гороха. Столбики с индексом «М» относятся к митохондриальным ДНК; с индексом «Х»-к ДНК хлоропластов. Рестрикционные фрагменты, с которыми гибридизовалась стандартная ДНК, показаны как темные полосы.

А. Трудно ли выделить митохондриальную ДНК, не загрязненную хлоропластной ДНК? Как в этих экспериментах контролируется степень загрязнения препаратов митохондриальной ДНК?

Б. Какие из этих препаратов митохондриальной ДНК могли содержать ДНК хлоропластов?

5. Ваша коллега изучала два мутанта гриба Neurospora , называя их несколько причудливо poky и puny . Скорости роста у обоих мутантов почти одинаковые, но гораздо ниже, чем у гриба дикого типа. Найти такое вещество, которое стимулировало бы скорость их роста, не удалось. С помощью биохимического анализа у каждого мутанта были обнаружены отличающиеся от нормы спектры поглощения цитохромов. Для получения генетической характеристики мутантов их скрещивали с диким типом и друг с другом и определяли скорости роста потомков. Вашу коллегу результаты этих опытов привели в недоумение.

Она объяснила, что при спаривании у Neurospora гаплоидные ядра родительских клеток сливаются, а затем делятся мейотически с образованием четырех гаплоидных спор, которые легко проверить на скорость роста. Вклады родительских клеток в диплоид неодинаковы: одна из них (протоперитециальный родитель) дает ядро и цитоплазму, другая (оплодотворяющий родитель) дает практически одно ядро – это очень похоже на то, что происходит в случае яйца и сперматозоида у высших организмов. Как видно из таблицы 4-1, от «порядка» скрещиваний зависят свойства потомков: такого явления ваша коллега никогда раньше не наблюдала. Можете ли вы объяснить эти результаты?

Таблица 4-1.

Генетический анализ мутантов Neurospora

Тема: Программа «Геном человека»

1. Расскажите о программе «Геном человека»:

· Задача и значение программы.

· Этапы программы.

· Составление генетической карты сцепления.

· Гибридизация соматических клеток in situ – как методы картирования генов человека.

· Составление физических карт низкого разрешения.

· Составление физических карт высокого разрешения.

· Определение нуклеотидной последовательности генома человека.

· Определение локализации всех генов организма и их функционального значения.

2. Составьте таблицу «Генетически детерминируемые болезни человека»

Хромосома	Местоположение гена	Обозначение гена	Болезнь человека	Примечание

3. Цветное зрение у человека определяется тремя различными зрительными пигментами, поглощающими свет в красной, зеленой и синей областях видимого спектра. Потеря одного из этих пигментов приводит к дальтонизму. Примечательно, что около 8% всех мужчин имеют дефекты цветового зрения, сцепленные с Х-хромосомой и затрагивающие красный или зеленый пигменты. Дальтонизм по голубому цвету – аутосомный признак – встречается крайне редко.

Гены человека, кодирующие зрительные пигменты, были обнаружены путем выявления генов, гомологичных клонированному гену бычьего родопсина, который кодирует зрительный пигмент, находящийся в палочках сетчатки и определяющий черно-белое зрение. Таким способом было идентифицировано четыре типа генов: ген родопсина и три других гена (один аутосомный и два сцепленных с Х-хромосомой), кодирующих белки, структура которых весьма сходна с родопсином. Два гена, сцепленные с Х-хромосомой и предположительно кодирующие красный и зеленый пигменты, идентичны на 98% как в области экзонов, так и в области интронов. Рестрикционные карты этих двух генов (А-типа и В-типа) приведены на рис. 4-2. Гены можно различить благодаря полиморфизму длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), один из которых (при обработке Rsal) показан под картами генов на рис. 4-2. Для проверки того, что именно эти гены кодируют красный и зеленый пигменты, обследовали нескольких нормальных мужчин и нескольких дальтоников по красному или зеленому цвету. В этих экспериментах использовали гибридизационные зонды, специфичные для ПДРФ-маркеров, выявляемых при обработке Rsal (рис. 4-3).

Удивительную вариабельность по наблюдаемому числу генов А-типа изучали путем обработки препаратов ДНК определенных индивидов рестриктазой NotI, последующего разделения получаемых длинных рестриктов методом пульс-электрофореза и гибридизации их с зондом, комплементарным к обоим генам (рис. 4-4).

А. Какие гены кодируют красный зрительный пигмент и какие зеленый?

Б. Генетический анализ показал, что гены, кодирующие красный и зеленый зрительные пигменты, расположены на Х-хромосоме рядом друг с другом. Каким образом эксперименты, описанные выше, позволяют сделать вывод, что эти гены физически сцеплены?

В. Почему у мужчин с нормальным цветовым зрением число генов А-типа варьирует? Почему вариабельность числа генов у нормальных мужчин приводит к высокой частоте дальтонизма?

Рис. 4-2. Рестрикционные карты генов зрительных пигментов А-типа и В-типа. Экзоны обозначены маленькими светлыми прямоугольниками. Участки ПДРФ, выявленные при обработке RsaI, обозначены под генами. E-EcoRI, B-BamHI, H-HindIII, S-Sall.

Рис. 4-3. ПДРФ, выявляемый при обработке рестриктазой RsaI, у нормальных мужчин, у дальтоников, не воспринимающих зеленый цвет, и у дальтоников, не воспринимающих красный цвет. Вариант ПДРФ, специфичный для гена А-типа, обозначен RsaI А; вариант ПДРФ для гена В-типа обозначен RsaI В. Индивиды обозначены номерами.

Рис. 4-4. Фрагменты обработанной NotI ДНК некоторых нормальных мужчин и дальтоников. Цифры, обозначающие индивидов, соответствуют цифрам на рис. 4-4. Соотношение генов 44 А-типа и В-типа определено по интенсивности зон гибридизации на рис. 4-4. Размеры фрагментов, образующихся при расщеплении NotI, указаны в т. п. н.

Занятие 5

Тема: Репликация ДНК

1. Заполните пропуски в следующих утверждениях.

А. Активный участок хромосомы, участвующий в репликации, представляет собой Y-образную структуру, называемую _______________.

Б. У E . coli новосинтезируемая ДНК кратковременно обнаруживается в молекулах длиной 1000-2000 нуклеотидов, называемых _______________.

В. Фермент, который сшивает разрывы в ДНК во время синтеза ДНК или ее репарации, называется ___________.

Г. Та дочерняя цепь ДНК, которая при репликации синтезируется непрерывно, называется ____________, а та цепь, которая синтезируется с перерывами, __________.

Д. Для ДНК-полимеразы в отличие от РНК-полимеразы совершенно необходим свободный З'-ОН-конец __________, спаренной с расплетенной ДНК, чтобы присоединять к нему новые нуклеотиды.

Е. Если ДНК-полимераза ошибочно присоединит неправильный нуклеотид к З'-концу, ее отдельный каталитически активный домен, обладающий (3' → 5')-____________ активностью, удалит неподходящее основание.

Ж. Для инициации синтеза ДНК на отстающей цепи нужны короткие праймеры, возникающие благодаря работе фермента ___________, которая в качестве субстратов использует рибонуклеозидтрифосфаты.

З. Расплетание двойной спирали ДНК в зоне репликативной вилки катализируется __________, использующей для направленного движения по ДНК энергию гидролиза АТР.

И. Способствующие расплетанию ДНК __________ связываются с одноцепочечной ДНК таким образом, что основания становятся доступными для реакции матричного синтеза.

К. Если ДНК-полимераза ошибается при образовании пары оснований, соединенных друг с другом водородными связями, то ошибка исправляется специальной системой ___________ (репарации повреждений), которая отличает новые цепи от старых по признаку метилирования.

Л. Для бактерий и некоторых вирусов, инфицирующих эукариотические клетки, было показано, что репликационные глазки образуются в тех участках молекулы ДНК, где находятся специальныепоследовательности, называемые _____________.

М. ____________ можно рассматривать как «обратимые нуклеазы», которые создают либо кратковременный одноцепочечный разрыв (тип I), либо кратковременный двухцепочечный разрыв (тип II).

А. У Е. со li репликативная вилка продвигается вперед со скоростью 500 п. н. в секунду, а цепи ДНК перед вилкой вращаются с круговой скоростью почти 3000 об/мин.

Б. Полуконсервативная репликация означает, что родительские цепи ДНК служат матрицами для синтеза новых, дочерних, цепей ДНК, так что новые двухцепочечные молекулы ДНК оказываются составленными из одной старой и одной новой цепи.

В. При считывании в том же направлении (от 5'- к З'-концу) последовательность нуклеотидов новосинтезированной цепи ДНК получается такой же, как в родительской матричной цепи.

Г. Синтез ДНК в направлении от 5'- к З'-концу означает, что удлинение цепи происходит за счет присоединения дезоксинуклеозидтрифосфатов к свободной 3'-ОН-группе (с отщеплением пирофосфата).

Д. Синтез ДНК происходит в направлении от 5'- к З'-концу на ведущей цепи и в направлении от 3'- к 5'-концу на отстающей цепи.

Е. Если бы полимеризация ДНК происходила в направлении от 3' – к 5', то растущий конец цепи заканчивался бы 5'-трифосфатом или в качестве предшественников должны были бы использоваться З'-дезоксинуклеозидтрифосфаты.

Ж. При утрате ДНК-полимеразой Е. соН (3' -к 5')-экзонуклеазной активности должна уменьшиться скорость синтеза ДНК, но не его точность.

3. Белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК в репликативной вилке, держат две цепи ДНК разделенными, закрывая собой основания и предотвращая тем самым их спаривание друг с другом.

К. У Е. со li и у вирусов, инфицирующих эукариотические клетки, новые циклы репликации ДНК начинаются со специфического участка, часто содержащего несколько копий короткой последовательности, с которой связывается комплекс белков, участвующих в инициации процесса.

Л. Для разрыва и сшивки заново цепей ДНК ферментом топоизомеразой I не нужен АТР, потому что энергия фосфодиэфирной связи временно накапливается в ковалентной связи фосфотирозина в активном центре фермента.

М. В клетках дрожжей, мутантных по топоизомеразе II, ДНК может реплицироваться, но хромосомы не могут разделяться в процессе митоза.

3. Фрагмент ДНК, изображенный на рис. 5-1, является двухцепочечным на концах и одноцепочечным в середине. Для верхней цепи указана полярность.

А. На каком конце фрагмента, 5' или 3', находится указанный на нижней цепи остаток фосфата (Р)?

Б. Каким способом, по вашему мнению, будет заполняться с помощью репаративных внутриклеточных процессов разрыв в цепи ДНК?

В. Сколько фрагментов будет содержаться в нижней цепи (рис. 5-1), если разрыв в ней заполняется (в условиях реакции в пробирке) при наличии в среде только дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и ДНК-полимеразы?

Рис. 5-1. Фрагмент ДНК с одноцепочечным участком, образовавшимся вследствие разрыва в нижней цепи.

4. Важный подход к изучению репликации ДНК-это применение электронной микроскопии, благодаря которой можно непосредственно наблюдать репликативную вилку, а на мелких молекулах ДНК можно видеть всю реплицирующуюся структуру. Кроме того, при использовании специальных методов приготовления образцов можно отличать двухцепочечную ДНК от одноцепочечной.

На рис. 5-2 изображен ряд гипотетических реплицирующихся молекул с участками одноцепочечной ДНК, показанными тонкими линиями. В одном раннем и очень важном электронно-микроскопическом исследовании репликации у бактериофага лямбда некоторые из этих структур были действительно обнаружены и встречались часто, а другие никогда не наблюдались.

А. Нарисуйте схематически репликационную структуру с двумя вилками, смещающимися в противоположных направлениях. Пометьте концы всех цепей (5' или 3') и укажите лидирующую и отстающую цепи в каждой репликативной вилке.

Б. На основе своих знаний по репликации ДНК укажите четыре структуры на рис. 5-2, которые наблюдались наиболее часто.

Рис. 5-2. Гипотетические структуры реплицирующихся молекул.

5. Где образуется РНК-затравка, на специфических или на случайных участках матрицы? Идеальной матрицей при изучении этого вопроса может служить ДНК вируса М13, потому что она не содержит 3'-ОН-группы.

Для ответа на данный вопрос кольцевую ДНК этого вируса полностью копировали в присутствии ДНК-полимеразы бактериофага Т4, праймосомы Т4 (комплекс геликазы и РНК-праймазы), различных rNТР (рибонуклеозидтрифосфатов) и dNТР (дезокси-рибонуклеозидтрифосфатов). Затем двухцепочечные кольцевые продукты обрабатывали рестриктазой, которая расщепляет двойную цепь в специфическом участке. Продукты этого расщепления подвергали денатурации, после чего анализировали последовательность нуклеотидов ДНК методом гель-электрофореза с высоким разрешением. Было обнаружено много отдельных полос. Если продукты расщепления до электрофореза обрабатывали РНКазой, то все они становились на пять нуклеотидов короче, о чем свидетельствовала более быстрая миграция их в секвенирующем геле.

Зная, что каждый продукт рестрикции заканчивается специфическим участком рестрикции, можно было по длине продукта установить матричную последовательность вблизи 5'-конца. (Полная последовательность М13 известна.) Некоторые из этих матричных последовательностей показаны на рис. 5-3 слева. Последовательность ДНК на каждом из соответствующих 5'-концов цепей продуктов была определена после удаления РНК-затравки. Эти последовательности показаны на рис. 5-3, справа, в той же строчке, что и комплементарная последовательность матричной ДНК.

Определите на основе этих данных стартовый участок для РНК-затравки на каждой матричной последовательности. Какой сигнал нужен для начала реакции, катализируемой РНК-праймазой?

Рис. 5-3. Матричные последовательности М13 (слева) и соответствующие последовательности ДНК, образуемые в каждом сайте (справа) во время синтеза РНК-затравки. РНК-затравки были отделены от этих цепей ДНК перед секвенированием.

6. В лаборатории, где вы работаете, занимаются изучением жизненного цикла вирусов животных. Геном у этих вирусов представлен кольцевой двухцепочечной ДНК. Вам поручено определить положение точки(-ек) начала репликации и выяснить, в одну или в обе стороны от начальной точки протекает репликация (однонаправленный или двунаправленный синтез). Чтобы достигнуть цели, вы выделяете реплицирующиеся молекулы, расщепляете их ферментом рестрикции, который разрезает вирусный геном в определенном сайте (в результате чего из кольцевой молекулы образуется линейная молекула ДНК) и затем исследуете образующиеся молекулы с помощью электронной микроскопии. Некоторые молекулы, которые вы видите, схематически изображены на рис. 5-4. (Обратите внимание, что в электронном микроскопе невозможно отличить один конец молекулы ДНК от другого.)

Рис. 5-4. Исходная и репликативные формы вируса животных.

Вы должны представить свои выводы сотрудникам лаборатории на следующий день. Как вы ответите на вопросы, поставленные перед вами руководителем: 1) имеется ли здесь одна точка начала репликации или таких сайтов несколько; 2) в одном или в двух направлениях происходит репликация?

7. Условно летальные мутации чрезвычайно полезны для генетического и биохимического анализа такого сложного процесса, как репликация ДНК. Температурочувствительные (ts) мутации, являющиеся одной из форм условно летальных мутаций, позволяют организму расти при определенной температуре (например, 30°С), но препятствуют росту при более высокой температуре (например, 42°С).

У Е. со li выделено большое число температурочувствительных мутантов. Все они дефектны по репликации ДНК при 42°С, но не при 30°С. Если температура среды повышается с 30 до 42 °С, синтез ДНК прекращается у этих мутантов одним из двух характерных способов. У «быстро останавливающихся» мутантов синтез ДНК прекращается сразу же, а у «медленно останавливающихся» мутантов это происходит только спустя много минут.

А. Попробуйте предсказать, мутациями в каких из нижеперечисленных белков, если они температурочувствительные, будет обусловлен «быстро останавливающийся» фенотип, а в каких – «медленно останавливающийся». В каждом случае объясните ваше предсказание.

1. ДНК-топоизомераза I.

2. Инициаторный белок репликации.

3. Белок, дестабилизирующий спираль.

4. ДНК-геликаза.

5. ДНК-праймаза.

6. ДНК-лигаза.

Б. Характер репликации в бесклеточных экстрактах мутантов по существу не отличается от такового в интактных клетках. В экстрактах «быстро останавливающихся» мутантов при температуре 42°С синтез ДНК прекращается сразу же, тогда как в случае «медленно останавливающихся» мутантов синтез ДНК продолжается в течение еще нескольких минут после повышения температуры до 42°С. Предположим, что экстракты из мутанта, дефектного по температурочувствительной ДНК-геликазе, и из мутанта по температурочувствительной ДНК-лигазе были смешаны при 42°С. Какой фенотип будет показывать смесь: «быстро останавливающийся», «медленно останавливающийся» или немутантный?

8. В тетради нарисуйте схему синтеза ДНК в репликативной вилке у прокариот.

9. Назовите особенности биосинтеза ДНК на РНК-матрице и охарактеризуйте этапы обратной транскрипции.

Занятие 6

Дата добавления: 2018-10-25; просмотров: 1343; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

12 3 4 5 6 7 8 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!