Преобразование сигнала G-белками.
Занятие №8.
Плазматическая мембрана (ПМ).
Эндоцитоз и экзоцитоз. Межклеточные контакты.
Клеточная мембрана. Строение.
В настоящее время наибольшим признанием пользуется жидкостно-мозаичная модель мембраны, предложенная в 1972 году Сингером и Николсоном (Singer, Nicolson). Согласно этой модели мембрана состоит из бислоя липидов, в котором плавают (или закреплены) белковые молекулы, образуя в нём своеобразную мозаику. Мембранные белки могут пронизывать бислой насквозь (интегральный белок), примыкать к бислою (периферический белок) или погружаться в него. Многие белки мембраны являются гликопротеинами, а мембранообразующие липиды - гликолипидами.
Липиды.
Жирные кислоты, входящие в состав мембранных липидов, содержат четное число углеродных атомов. Среди этих кислот наиболее часто встречаются:
| а) Насыщенные | б) Ненасыщенные |
| пальмитиновая С16:0 стеариновая С18:0 лигноцериновая С24:0 | пальмитоолеиновая С16:1(7) олеиновая С18:1 (9) нервоновая С24:1 (9) линолевая С18:2 (9,12) линоленовая С18:3 (9,12,15) арахидоновая С20:4 (5,8,11,14) |
Цифры указывают количество углеродных атомов и число двойных связей, а также их положение (в скобках).
Все липиды клеточной мембраны представляют собой амфипатические молекулы, то есть у них ест гидрофильный и гидрофобный концы.
|
|
|
Одним из факторов, влияющих на текучесть мембраны, является холестерол. Плазматические мембраны эукариот содержат довольно большое количество холестерола – приблизительно 1 молекулу на каждую молекулу фосфолипида. Молекулы холестерола ориентируются в бислое таким образом, чтобы их гидроксильные группы примыкали к полярным головам фосфолипидных молекул. При этом их жесткие стероидные кольца частично иммобилизуют участки углеводородных цепей, непосредственно примыкающих к полярным головам. Хотя холестерол делает липидный бислой менее текучим, при его высоких концентрациях (как в ПМ) он предотвращает слипание и кристаллизацию углеводородных цепей. Кроме того, холестерол увеличивает упругость и механическую плотность бислоя. Именно благодаря холестеролу мембрана может менять свою форму в ответ на приложенную к ней силу. Дело в том, что в отличие от фосфолипидов холестерол может быстро перераспределяться между монослоями.
Определенная текучесть мембраны имеет важное биологическое значение. Об этом свидетельствует тот факт, что бактерии, дрожжи и другие пойкилотермные организмы, принимающие температуру окружающей среды, изменяют жирокислотный состав своих ПМ таким образом, чтобы текучесть мембраны оставалась примерно постоянной. Например, при падении температуры начинают синтезироваться жирные кислоты с большим числом цис-двойных связей, для того чтобы предотвратить уменьшение текучести бислоя.
|
|
|
ПМ бактерий обычно имеют фосфолипид только одного типа и не содержат холестерол (механическая прочность обеспечивается клеточной стенкой). В ПМ животных клеток обнаруживаются 4 основных фосфолипида: фосфатидилхолин (лецитин), сфингомиелин, фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин. Другие фосфолипиды, такие как инозитолфосфолипиды, важны в функциональном отношении (роль в передаче клеточных сигналов), но представлены в относительно малых количествах.
Гликолипиды.
Гликолипиды – олигосахаридсодержащие липиды. Эти молекулы обнаруживаются только в наружной половине бислоя, а их сахарные группы ориентированы к поверхности клетки. Гликолипиды составляют около 5% липидных молекул наружного монослоя. Они сильно различаются у разных видов и даже в разных тканях одного и того же вида. У бактерий и растений почти все гликолипиды – это производные липидов на основе глицерола, например, широко распространенного фосфотидилохолина. В животных клетках гликолипиды построены на основе церамида, каковым является, например, фосфолипид сфингомиелин.
|
|
|
Все гликолипидные молекулы различаются по числу сахарных остатков в их полярных головах. Так, полярные головы нейтральных гликолипидов содержат от 1 до 15 и более нейтральных (незаряженных) сахаров. Одним из простейших нейтральных гликолипидов является галактоцереброзид, полярная голова которого состоит только из одной галактозы; галактоцереброзид – это главный гликолипид миелина (многослойной мембранной оболочки, которая окружает аксон).
Самые сложные из гликолипидов – ганглиозиды – содержат один или более остатков сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, или NANA), которые придают молекулам ганглиозидов отрицательный заряд. Особенно много ганглиозидов в мембранах нервных клеток.
Установлено, что GМ1-ганглиозид действует как поверхностный рецептор для бактериального токсина, образуемого при холере. Холерный токсин связывается с поверхностью и попадает внутрь только тех клеток, у которых в плазматической мембране присутствует GМ1-ганглиозид (к ним, например, относятся эпителиальные клетки кишечника). Проникновение холерного токсина внутрь клетки приводит к долговременному увеличению концентрации внутриклеточного сАМР, которое обуславливает сильный приток Na+ и воды внутрь кишечника.
|
|
|
1.2. Белки. Белки легко встраиваются в фосфолипидный бислой и удерживаются в нем за счет гидрофобных взаимодействий неполярных группировок аминокислот с остатками жирных кислот. Гидрофильные области белка образуют электростатические связи с полярными головками фосфолипидов и определенным образом ориентированы в бислое. По типу расположения белка в фосфолипидном бислое различают интегральные и периферические белки. Участки интегральных белков, имеющие гидрофобные аминокислоты погружены в бислой глубоко и могут пересекать его. Это могут быть транспортные белки, ферменты, рецепторы и регуляторные белки. «Заякоривание» периферических белков происходит с помощью водородных связей и ионных взаимодействий. Этому способствует также наличие в периферическом белке остатка жирной кислоты или олигосахарида, которые внедряются в липидный бислой и служат своеобразным якорем.
Многие мембранные белки диффундируют в плоскости мембраны. Мембранные белки так же, как и мембранные липиды, не могут перескакивать с одной стороны бислоя на другую (такой перескок носит название флип-флоп), но они способны вращаться вокруг оси, перпендикулярной плоскости бислоя (вращательная диффузия). К тому же многие мембранные белки могут перемещаться в плоскости мембраны (латеральная диффузия).
Липопротеины.
Липопротеиновые комплексы представляют собой шаровидные агрегаты, состоящие из ядра, образованного неполярными липидами (триацилглицеринами и ацилхолестеринами), и оболочки толщиной примерно 2 нм, построенной из апопротеинов и амфифильных липидов (фосфолипидов и холестерина). Наружная сторона оболочки полярна, вследствие этого липиды растворимы в плазме. Чем больше липидное ядро, т. е. чем большую часть составляют неполярные липиды, тем меньше плотность липопротеинового комплекса.
Липопротеиновые комплексы делятся на пять групп. Ниже они приведены в порядке уменьшения размера и увеличения плотности: это хиломикроны и остатки хиломикронов, липопротеины очень низкой плотности [ЛОНП (VLDL от англ. very low density lipoproteins)], липопротеины промежуточной плотности [ЛПП (IDL от англ. intermediate density lipoproteins)], липопротеины низкой плотности [ЛНП (LOL от англ. low density lipoproteins)], липопротеины высокой плотности [ЛВП (HDL от англ. high density lipoproteins)]. Липопротеиновые комплексы несут на внешней поверхности характерный апопротеин, который «плавает» на оболочке. Апопротеины играют решающую роль в функционировании липопротеинов: они служат молекулами узнавания для мембранных рецепторов (см. ниже) и необходимыми партнерами для ферментов и белков, которые участвуют в метаболизме и обмене липидов.
Хиломикроны обеспечивают транспорт пищевых липидов от кишечника к тканям. Хиломикроны образуются в слизистой кишечника и транспортируются в кровь лимфатической системой. В мышцах и жировой ткани они разрушаются липазой липопротеинов, активирующейся апопротеином С-II. Под действием этого фермента хиломикроны быстро теряют бóльшую часть своих триацилглицеринов. Остатки хиломикронов утилизируются печенью.
ЛОНП, ЛПП и ЛНП тесно связаны между собой. Они транспортируют триацилглицерины, холестерин и фосфолипиды от печени к тканям. ЛОНП образуются в печени и могут превращаться, как и хиломикроны, в ЛПП и ЛНП путем отщепления жирных кислот. Образующиеся ЛНП снабжают холестерином различные ткани организма.
ЛВП возвращают избыточный холестерин, образующийся в тканях, обратно в печень. Во время транспорта холестерин ацилируется жирными кислотами из лецитина. В этом процессе участвует лецитинхолестеринацилтрансфераза. Между ЛВП и ЛОНП также происходит обмен липидами и белками.
Транспортная роль ПМ.
Молекулы транспортируемых веществ или ионы металлов могут переноситься с одной стороны мембраны на другую независимо от наличия и переноса других соединений - это унипорт. Перенос молекул может осуществляться одновременно и однонаправлено с другими соединениями - симпорт. И, наконец, транспорт может быть обусловлен одновременным и противоположно направленным переносом другого соединения - антипорт. Симпорт и антипорт являются примерами котранспорта. Так, транспорт глюкозы и аминокислот через слизистые оболочки тонкого кишечника сопряжён с транспортом ионов Na+.
Пассивный транспорт.
Пассивный транспорт идет в направлении перепада электрохимического потенциала вещества, происходит самопроизвольно и не требует свободной энергии АТФ.
К пассивному транспорту относится диффузия: простая и облегченная. Диффузия – самопроизвольное перемещение вещества из мест с большей их концентрацией в места с меньшей концентрацией вещества вследствие хаотического теплового движения частиц. Диффузия вещества через липидный слой вызывается градиентом концентрации в мембране.
Признаки диффузии: каждая молекула движется независимо от других; эти движения хаотичны. Диффузия - процесс медленный. Но она может быть ускорена в результате тока плазмы, метаболической активности. Обычно вещества синтезируются в одном участке клетки, а потребляются в другом. Таким образом устанавливается концентрационный градиент, и вещества могут диффундировать по градиенту из места образования к месту потребления. Органические молекулы, как правило, полярны. Поэтому они не могут свободно диффундировать через липидный барьер клеточных мембран. Однако двуокись углерода, кислород и другие вещества, растворимые в липидах, проходят через мембраны свободно. В обе стороны проходит вода и некоторые мелкие ионы.
2.1.1. Простая диффузия. Некоторые небольшие нейтральные молекулы, а также газы могут поступать в клетку путем диффузии через мембрану из зоны с большей концентрации в зону с меньшей, то есть по электрохимическому градиенту без затрат метаболической энергии. Скорость простой диффузии вещества через мембрану не ограничена и пропорциональна растворимости этого вещества в гидрофобной зоне мембранного бислоя. Состояние жидкостности мембраны может существенно влиять на диффузию веществ (даже таких, как вода) через мембрану. Скорость диффузии обратно пропорциональна числу водородных связей, которые должны быть разрушены для того, чтобы вещество перешло из внешней водной фазы в гидрофобный бислой. Электролиты слабо диффундируют через мембрану по этой причине, и чем больше величина их заряда, тем меньше скорость диффузии. Простая диффузия может происходить через: 1) липидный бислой, 2) липидные поры в липидном слое; 3) белковые поры в липидном слое.
Через гидрофильные липидные и белковые поры сквозь мембрану проникают молекулы нерастворимых в липидах веществ и водорастворимые гидратированные ионы, окруженные молекулами воды. Для жирорастворимых веществ и ионов мембрана выступает как молекулярное сито: чем больше размер частицы, тем меньше проницаемость мембраны для этого вещества. Избирательность переноса обеспечивается набором в мембране пор определенного радиуса, соответствующих размеру проникающей частицы.
Так в мембранах имеются трансмембранные каналы или подобные порам структуры, образующие ион-проводящие пути. Например, мембраны нервных клеток содержат хорошо изученные ионные каналы, которые обусловливают потенциал действия, генерируемый в мембране. Некоторые микробные пептиды образуют ионные каналы (белковые по своей природе), или ионофоры, которые функционируют как челноки для перемещения ионов через мембраны.
Ионные каналы являются специфичным для переноса определенных ионов. Диаметр калиевого канала составляет 0,405 нм. Кристаллический радиус иона лития составляет – 0,060 нм, натрия – 0,095 нм, калия – 0,133 нм. Таким образом, все выше перечисленные ионы должны свободно проходить через калиевые каналы. Одно из возможных решений данного противоречия предложено Л. Муллинзом. Он предполагает, что в растворе вне поры каждый ион имеет гидратную оболочку, состоящую из трех сферических слоев молекул. При вхождении в пору ион «раздевается», теряя воду послойно. Пора будет проницаема для иона, если ее размер точно соответствует диаметру любой из этих сферических оболочек. Как правило, в поре ион остается с одной гидратной оболочкой. Таким образом, гидратированные ионы лития и натрия будут испытывать затруднение при прохождении через калиевый канал.
2.1.2. Облегченная диффузия. Некоторые специфические вещества диффундируют через мембрану по электрохимическому градиенту быстрее, чем это можно было ожидать, исходя из их размеров. Их диффузия является облегченной и характеризуется свойствами, отличными от свойств простой диффузии. При облегченной диффузии число участков мембраны, вовлекаемых в диффузию растворенных веществ, ограничено, поэтому общая скорость диффузии также ограничена. Но перенос ионов с участием переносчиков происходит значительно быстрее по сравнению со свободной диффузией. Облегченная диффузия обладает свойством насыщения: при увеличении концентрации с одной стороны мембраны плотность потока вещества возрастает лишь до некоторого предела, когда все молекулы переносчика уже заняты.
Система облегченной диффузии не требует никакой метаболической энергии, и осуществляется специфическими интегральными белками-переносчиками (транслоказы и пермеазы). При взаимодействии транспортируемой молекулы с активным центром белка-переносчика изменяется конформация его субъединиц, что позволяет молекуле проходить через мембрану, в которой открывается гидрофильный белковый канал.
Каждая пермеаза участвует в переносе ограниченной группы химически сходных веществ; её биосинтез детерминирован определённым геном. Наиболее изучены пермеазы углеводов у бактерий. Известны пермеазы аминокислот, некоторых ионов и др. веществ. Кишечная палочка содержит 30-60 различных пермеаз. Термин "пермеаза" часто распространяют на всю многокомпонентную систему транспортировки какого-либо вещества, придавая ему функциональный смысл. Такое расширение понятия неудачно, так как безосновательно отождествляет пермеазы с ферментами (характерное окончание - "аза"). Предложено также называть перемазы транспортными белками, или трансфорами. Так например, пермеазу для глюкозы называют также D-гексозной пермеазой.
Активный транспорт.
Процесс активного транспорта отличается от пассивного потребностью в непрерывном обеспечении энергией (за счет гидролиза АТФ, переноса электронов или энергии света) и перемещением молекул против электрохимического градиента. Причем, путь транспорта молекул против электрохимического градиента в биологических системах является настолько важным, что на этот процесс расходуется до 40% потребляемой человеком в покое энергии. Примером активного транспорта может служить так называемый натриевый насос. Обычно животные клетки поддерживают низкую внутриклеточную концентрацию ионов натрия и высокую внутриклеточную концентрацию калия. Эти градиенты поддерживаются специфическим ионным насосом-ферментом Nа+,К+-аденозинтрифосфатазой (АТФаза), которая активируется этими ионами.
АТФаза является интегральным мембранным белком, и для проявления ее активности необходимы фосфолипиды. АТФазная каталитическая активность проявляется при взаимодействии этого фермента как с АТФ, так и с ионами натрия на цитоплазматической стороне мембраны тогда, как связывающий ионы калия центр находится на наружной стороне мембраны. Для транспорта ионов через мембрану требуется энергия, источником которой служит АТФ. На каждую молекулу АТФ, гидролизованного до АДФ и неорганического фосфата, из клетки выходят три иона натрия, а два иона калия поступают в нее из окружающей среды. Этот транспорт сопровождается конформационными изменениями АТФазы и включает два этапа. На первом этапе молекула АТФазы фосфорилируется под действием АТФ, и это позволяет ей присоединять ионы натрия. На втором этапе присоединяются ионы калия, следствием чего является перенос ионов натрия через мембрану с отщеплением свободного фосфата, поступающего в цитозоль.
Рецепторная роль ПМ.
Клетка изменяет активности своих ферментов в ответ на получаемые ею из внешней среды специфические сигналы. Эти сигналы представляют собой определенные низкомолекулярные вещества - лиганды, связывающиеся со специальными участками клеточной поверхности – рецепторами. В организме человека лигандами являются, например, нейротрансмиттеры, которые выделяются в синаптических щелях нервными клетками в ответ на нервный импульс, а также вещества, секретируемые другими клетками в окружающую их среду.
В первом случае сигнал воспринимается нервной клеткой и по нервному волокну приходит точно по адресу к другой клетке. Этот тип регуляции быстрый и обеспечивается нервной системой.
Во втором случае, называемом гуморальной регуляцией, сигнальное вещество может действовать на целую группу клеток. Если оно действует в ближайшем окружении от выделившей его клетки, говорят о локальных химических медиаторах (от лат. localis – местный, medius – посредничающий). Один из примеров такого медиатора – белок гистамин, который выделяют так называемые тучные клетки в ответ на повреждение окружающих их тканей. В результате действия гистамина увеличивается просвет близлежащих кровеносных сосудов, и к месту травмы устремляются отряды лимфоцитов, буквально протискивающихся через стенки капилляров. Поглощая сигнальные вещества, которые сами же и выделяют, клетки осуществляют самоконтроль и самонастройку на определенную работу.
Возможна также и гуморальная регуляция состояния всего организма, когда сигнальное вещество синтезируется определенным типом ткани, попадает в кровь и разносится с кровотоком по всему телу. Такой тип сигнальной коммуникации обеспечивают гормоны. Однако и на гормоны реагируют только клетки, имеющие соответствующие рецепторы.
Химические вещества, способные связываться с наружными клеточными рецепторами и влиять на функционирование клетки, называют первичными медиаторами, или первичными мессенджерами (англ. messenger – посыльный). Каким же образом первичные мессенджеры оказывают влияние на активность белков и, тем самым, на активность клетки? Для этого внешний по отношению к клетке сигнал должен превратиться во внутренний. Ключевую роль в таком процессе играют образующиеся внутри клетки вторичные мессенджеры, которых на удивление мало. Главенствующую роль среди них играет циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), открытый в 1958 г. Э.Сазерлендом и Т.Роллом.
Рецепторы.
Различают три типа рецепторов.
1. Рецепторы первого типа являются белками, имеющими одну трансмембранную полипептидную цепь. Это аллостерические ферменты, активный центр которых расположен на внутренней стороне мембраны. Многие из них являются тирозиновыми протеинкиназами. К этому типу принадлежат рецепторы инсулина, ростовых факторов и цитокинов.
Связывание сигнального вещества ведет к димеризации рецептора. При этом происходит активация фермента и фосфорилирование остатков тирозина в ряде белков. В первую очередь фосфорилируется молекула рецептора (автофосфорилирование). С фосфотирозином связывается SН2-домен белка-переносчика сигнала, функция которого состоит в передаче сигнала внутриклеточным протеинкиназам.
2. Ионные каналы. Эти рецепторы второго типа являются олигомерными мембранными белками, образующими лиганд-активируемый ионный канал. Связывание лиганда ведет к открыванию канала для ионов Na+, К+ или Cl-. По такому механизму осуществляется действие нейромедиаторов, таких, как ацетилхолин (никотиновые рецепторы: Na+- и К+-каналы) и γ-аминомасляная кислота (А-рецептор: Cl--канал).
3. Рецепторы третьего типа, сопряженные с ГТФ-связывающими белками. Полипептидная цепь этих белков включает семь трансмембранных тяжей. Такие рецепторы передают сигнал с помощью ГТФ-связывающих белков на белки-эффекторы, которые являются сопряженными ферментами или ионными каналами. Функция этих белков заключается в изменении концентрации ионов или вторичных мессенджеров. Таким образом, связывание сигнального вещества с мембранным рецептором влечет за собой один из трех вариантов внутриклеточного ответа: рецепторные тирозинкиназы активируют внутриклеточные протеинкиназы, активация лиганд-активируемых ионных каналов ведет к изменению концентрации ионов и активация рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками, индуцирует синтез веществ-посредников, вторичных мессенджеров. Все три системы передачи сигнала взаимосвязаны. Так, например, образование вторичного мессенджера цАМФ (сАМР) приводит к активации протеинкиназ А [ПК-А (PK-A)], вторичный мессенджер диацилглицерин [ДАГ (DAG)] активирует [ПК-С (PK-C)], а вторичный мессенджер инозит-1,4,5-трифосфат [ИФ3 (InsP3)] вызывает повышение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме клетки.
ЦАМФ.
Это соединение образуется из знаменитой АТФ – аденозинтрифосфорной кислоты, которую часто называют «энергетической разменной монетой» клетки. Как известно, АТФ состоит из азотистого основания аденина, пятиуглеродного циклического сахара и трех остатков фосфорной кислоты. Химические связи между фосфорными остатками богаты энергией. Практически все внутриклеточные процессы, начиная от синтеза белков и кончая мышечным сокращением, получают энергию за счет отщепления одной или двух фосфатных групп АТФ.
Циклический аденозинмонофосфат образуется с помощью фермента аденилатциклазы, который отщепляет от АТФ два остатка фосфорной кислоты, а последний, третий, остаток замыкает через два атома кислорода на сахар рибозу, входящий в состав аденозина. Это удивительное вещество играет роль универсального вторичного мессенджера в клетках практически всех организмов, как эукариотических, так и прокариотических.
В качестве примера рассмотрим, как цАМФ влияет на образование гликогена, который является формой хранения глюкозы в животных клетках. В момент опасности из надпочечников в кровь выбрасывается большое количество адреналина. Двигаясь по кровеносной системе, этот гормон достигает мышечных клеток, имеющих рецепторы адреналина. Связывание адреналина приводит к изменению пространственной структуры рецептора, что, в свою очередь, активирует фермент аденилатциклазу, расположенную на внутренней поверхности клеточной мембраны. Аденилатциклаза начинает превращать АТФ в цАМФ, и внутриклеточная концентрация последнего быстро возрастает. При достижении определенного уровня цАМФ активирует фермент протеинкиназу, который присоединяет остатки фосфорной кислоты (фосфорилирует) к аминокислотам серину и треонину в ферменте гликогенсинтетазе. Как следует из названия, этот фермент занимается в клетках синтезом гликогена. Фосфорилирование изменяет пространственную структуру фермента, в результате чего он инактивируется и новые порции гликогена уже не образуются. Протеинкиназа, активированная цАМФ, фосфорилирует также еще один фермент – киназу фосфорилазы. Киназа, в свою очередь, фосфорилирует гликогенфосфорилазу, которая в результате начинает отщеплять от гликогена молекулы глюкозы. Появившаяся же в мышцах глюкоза играет роль топлива, на котором они успешно работают.
Следует отметить, cAMP активирует множество cAMP-зависимых протеинкиназ, каждая из которых фосфорилирует определенные белки-субстраты. В большинстве клеток животных присутствуют две cAMP-зависимые протеинкиназы, фосфорилирующие белки-мишени по остаткам Ser и Thr ( серин/треониновые A-киназы ).
Специфичность регуляторных воздействий cAMP обеспечивается наличием в клетках определенных типов только им присущих тканеспецифических белков, являющихся субстратами для A-киназ. Например, клетки печени обогащены фосфорилазой-киназой и гликогенсинтазой, активность которых регулируется избирательным фосфорилированием по cAMP-зависимому механизму, что сопровождается накоплением или освобождением углеводов в гепатоцитах. Адипоциты обогащены липазой, фосфорилирование которой по тому же механизму приводит к освобождению жирных кислот, и т.д.
Преобразование сигнала G-белками.
G-белки переносят сигнал с рецептора третьего типа на белки-эффекторы. Они построены из трех субъединиц: α, β и γ. α-cубъединица обладает свойством связывать гуаниновые нуклеотиды [ГТФ (GTP) или ГДФ (GDP)]. Белок проявляет слабую ГТФ-азную активность и похож на другие ГТФ-связывающие белки, такие, как ras и фактор элонгации Tu (EF-Tu). В неактивном состоянии G-белок связан с ГДФ.
При связывании сигнального вещества с рецептором третьего типа конформация последнего изменяется таким образом, что комплекс приобретает способность связывать G-белок. Ассоциация G-белка с рецептором приводит к обмену ГДФ на ГТФ (1). При этом происходит активация G-белка, он отделяется от рецептора и диссоциирует на α-субъединицу и β,γ-комплекс. ΓΤΦ-α субъединица связывается с белками-эффекторами и изменяет их активность, в результате чего происходит открывание или закрывание ионных каналов, активация или ингибирование ферментов. Медленный гидролиз связанного ГТФ до ГДФ переводит α-субъединицу в неактивное состояние и она вновь ассоциирует с β,γ-комплексом, т.е. G-белок возвращается в исходное состояние.
Эндоцитоз.
Неспецифический эндоцитоз.
Специфический эндоцитоз.
При потреблении холестерина клетки с помощью мембранных рецепторов, узнающих апо-В-100 и апо-Е, связывают ЛНП. «ЛНП-рецепторы» захватывают эти комплексы путем эндоцитоза. Поглощение происходит в так называемых «окаймленных ямках» — областях мембран, у которых внутренняя поверхность выстлана белком клатрином. Клатрин облегчает включение в ямку и содействует отделению везикулы ("окаймленная везикула"). Внутри клетки клатрин отделяется от везикулы и используется повторно. Везикула связывается с лизосомой, которая переваривает ее содержимое.
Рецептор ЛНП синтезируется в виде предшественника с массой 120 кДа на рибосомах, связанных с ЭПР. Далее при транспортировке в аппарате Гольджи к рецептору добавляются N- и O- связанные сахара, и он превращается в зрелый белок с кажущейся массой в 160 кДа.
Рецептор состоит из пяти структурных доменов: 1) лиганд-связывающий домен, 2) домен, гомологичный предшественнику фактора роста эпидермиса, 3) домен, содержащий О-связанные сахара, 4) трансмембранный домен, 5) цитоплазматический домен. На плазматической мембране рецептор локализуется преимущественно в области окаймленных ямок. Избыток холестерина тормозит активность ГМГ-КоА-редуктазы (а следовательно, и синтез нового холестерина); в то же время он активирует ацил-КоА или холестерин-ацилтрансферазу (АЦАТ-за), фермент, ответственный за внутриклеточные запасы холестерина. С увеличением внутриклеточного холестерина прекращается также образование новых рецепторов ЛНП (блокируется транскрипция гена). Так здоровая клетка поддерживает равновесие между поступающим с пищей холестерином и внутриклеточным синтезом этого вещества. Однако при избытке холестерина в клетках внутри кровеносных сосудов образуются атеросклеротические отложения.
Американские ученые Джозеф Леонард Голдстайн и Майкл Браун получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1985 г. за исследования, которые, по мнению Каролинского института в Стокгольме, «существеннейшим образом углубили наше понимание метаболизма холестерина и увеличили возможности профилактики и лечения атеросклероза».
Пиноцитоз.
Имеются два типа пиноцитоза: адсорбционный и жидкофазовый. Адсорбционный пиноцитоз является рецепторопосредованным селективным процессом усвоения макромолекул, для которых имеются белковые рецепторы - участки связывания на плазматической мембране. Эти рецепторы характеризуются высоким сродством к лигандам (веществам), что позволяет с помощью пиноцитоза извлекать эти вещества из внеклеточной среды. Примером адсорбционного пиноцитоза является захват клеткой молекул липопротеидов низкой плотности (ЛНП), а также гормонов.
При жидкофазном пиноцитозе растворенные вещества захватываются пропорционально их концентрации во внеклеточной жидкости, при этом образуются меньшие по размерам, чем при абсорбционном, везикулы.
Экзоцитоз.
Существуют два пути экзоцитоза: конститутивный и регулируемый.
Некоторые белки непрерывно секретируются производящими их клетками. При этом они упаковываются в транспортные пузырьки в аппарате Гольджи и затем переносятся непосредственно к ПМ. В таком случае говорят о конститутивном пути секреции. В других клетках определенные белки и/или малые молекулы запасаются в специальных секреторных пузырьках, которые сливаются с ПМ только после получения клеткой соответствующего сигнала извне. Конститутивный путь осуществляется во всех клетках, а регулируемый 
обнаружен главным образом в клетках, приспособленных для секреции производимых ими веществ в зависимости от потребностей. Обычно это гормоны, нейромедиаторы или переваривающие ферменты. Обычно в таких специализированных клетках сигналом к секреции часто служит химический медиатор, например, гормон, связывающийся с рецепторами на клеточной поверхности. В результате происходит активация рецепторов, которая генерирует внутриклеточный сигнал, запускающий далее процесс экзоцитоза.
Межклеточные контакты.
6.1. Плотное соединение (tight (occluding) junctions).
Интегральным мембранным белком плотного соединения оказался окклудин. Окклудин имеет 4 трансмембранных домена, длинный С-терминальный цитоплазматический домен и короткий N-терминальный цитоплазматический домен. Две изоформы окклюдина образуются в результате альтернативного сплайсинга. Окклудин взаимодействует с двумя цитоплазматическими белками, ZO-1 и ZO-2 (zonula occludence 1, 2). Их функция окончательно не ясна. Возможно, их роль заключается в локализации окклудина в сайтах между апикальной и базолатеральной поверхностями клетки.
Белок клаудин в точности колокализуется с окклюдином и ZO-1.белок Клаудин имеет также 4 трнансмембранных домена; цитоплазматический хвост клаудина короче, чем у окклудина. Избыточная экспрессия клаудина-1 увеличивает экспрессию ZO-1, но не окклюдина или ZO-2. Клаудин-1 экспрессирующие клетки обладают в 4 раза более высокой трансэпителиальной электрической резистентностью. Это указывает на то, что клаудин-1 участвует в барьерной функции плотных контактов.
Белок JAM - junctional adhesion molecule - имеет единственный трансмембранный домен. Имеется 3 JAM-родственых белка, которые принадлежат к сверхсемейству иммуноглобулинов: они имеют одиночный трансмембранный домен, а их внеклеточная часть складывается в два иммуноглобулин-подобные домена. Экзогенно экспрессируемые JAM ассоциируют латерально с клаудин-основынми стержями ободков плотных соединений в эпителиальных клетках.
Некоторые ассоциированные с цитоскелетом белки были также обнаружены в участках плотных контактов. Среди них зингулин, 7Н6 антиген и актин. Белок Ras также играет определенную роль в регулировании функционирования плотных соединений.
6.2. Заякоривающие, или сцепляющие соединения (Anchoring junctions).
Заякоривающие (прикрепляющие) контакты прикрепляют клетки (и их цитоскелеты) друг к другу или к внеклеточному матриксу. Существуют две классификации заякоривающих соединений.
v По типу прикрепления различают контакты: контакты адгезионные межклеточные (cell-cell adherens junctions) и контакты клеточно-матриксные адгезионные (cell-matrix adherens junctions). К адгезионным межклеточным контактам относятся: точечные контакты, адгезивные пояски, десмосомы. К клеточно-матриксным адгезионным контактам относятся: фокальный контакт и полудесмосома.
По структуре адгезионные межклеточные контакты очень сходны с контактами клетка-матрикс и тоже содержат три домена:
1) трансмембранный домен, содержащий адгезионные молекулы;
2) бляшку, расположенную с цитоплазматической стороны мембраны;
3) цитоскелетную часть, содержащую прикрепленные к бляшке филаменты цитоскелета и ассоциированные с ними белки.
v По элементам цитоскелета, с которыми соединяются заякоривающие соединения, различаются контакты, связанные с актиновыми филаментами, и контакты, связанные с промежуточными филаментами.
Группа контактов, связывающихся внутри клеток с актиновыми филаментами: точечные, сцепляющие и фокальные контакты .
Точечные контакты.
Точечные контакты являются первичными. Созревание фокального контакта связано с формированием ассоциированного с ним пучка актиновых филаментов. Так при распластывании эмбриональных фибробластов перепелки сначала формируются точечные инициальные (см. далее «фокальный контакт») контакты на активном краю клетки. Точечные контакты не ассоциированы с пучками актиновых филаментов, но содержат винкулин и альфа-актинин. Кроме того, показано присутствие виментиновых филаментов в этой области. Размер таких контактов не превышает 0,2-0,5 мкм.
6.2.2. Сцепляющий (адгезивный) поясок (zonula adherens).
Цитоплазматический домен Е-кадгерина связывается с гетеродимером альфа катенин - винкулин и бета-катенин - плакоглобин. Этот комплекс белков позволяет кадгерину правильно ориентироваться в мембране и образовывать прочные взаимодействия между молекулами двух клеток. Актиновые филаменты присоединяются к месту контакта с помощью еще неизвестных белков через винкулин и a- катенин. Плакоглобин впервые был обнаружен как компонент десмосом. Колокализация b-катенина и плакоглобина в одном субклеточном компартменте говорит в пользу прямого взаимодействия этих белков.
Структурная роль винкулина в вышеописанных соединениях подтверждается следующими примерами. Во-первых, микроинъекции моноклональных антител к винкулину в адсорбированные фибробласты ведет к разрушению системы заякоривания актиновых филаментов в мембране и, следовательно, к исчезновению клеточно-матриксных контактов. Во-вторых, мутации по гену винкулина у нематоды летальны на ранних стадиях развития личинки.
Рис. Димеры Е-кадгерина непосредственно взаимодействуют с плакоглобином (Pg) или бета-катенин ом (бета-cat). N-концевой участок Pg/cat связывается с N-терминальной половиной альфа-акатенин (альфа-cat), который в свою очередь взаимодействует с альфа-актинином (альфаА).
Сборка адгезионных комплексов начинается, когда β-катенин соединяется с С-концом Е-кадгерина и способствует его транспорту по секреторнорму пути. Когда комплекс кадгерин-β-катенин достигает плазматической мембраны, то α-катенин рекрутируется из цитозоля и соединяется с комплексом T-кадгерин-β-катенин. α-catenin может соединяться непосредственно с актиновыми филаментами или косвенно через линкерный белок винкулин, который в свою очередь связывается с VASP. Винкулин может соединяться непосредственно с актином и является также компонентом контактов клетка-субстрат. VASP участвует как в полимеризации актина, так и в управлении растущими актиновыми филаментами к сайтам клеточной адгезии. Индивидуальные кадгерин–актиновые единицы могут формировать кластеры и стабилизироваться с помощью α-актинина, который связывает поперек соседние актиновые филаменты. Другой катениновый белок, который непосредственно связывается с E-кадгерином, это p120. Однако функциональное значение связывания p120 с околомембранной областью кадгерина неясно, т.к. имеются противоречивые данные на то, что p120 ведет себя как позитивный или негативный регулятор адгезии. Предполагается, что связывание кадгеринов вызывает активацию p120 и усиление адгезии, тогда как внутриклеточная передача сигналов индуцирует ингибирующие эффекты p120.
Фокальные контакты.
Фокальные контакты - это наиболее хорошо изученный тип адгезионных контактов с внеклеточным веществом.
В цитоплазматической бляшке фокальных контактов находится винкулин - общий для всех адгезионных контактов белок, и талин - белок, специфический для контактов клеток с неклеточной поверхностью. С цитоплазматическим доменом интегрина взаимодействует талин, с талином связывается винкулин, а молекулы винкулина могут взаимодействовать друг с другом и с белками цитоскелетного домена фокального контакта - альфа-актинином и через него с актином. Тем не менее, следует отметить, что на данный момент нет единой модели строения фокального контакта в связи с большим числом различных белков, обнаруживаемых в этой области.
Принято выделять 2 типа фокальных контактов: инициальные контакты на активном участке края клетки и удлиненные (шртиховые) зрелые фокальные контакты. Инициальные контакты – см. «точечные контакты». Штриховые контакты присутствуют в центральной части ламеллы, в области активного края они практически не обнаруживаются. Каждому штриховому контакту соответствует пучок актиновых филаментов. Размер таких контактов составляет от 2 до 10 мкм. Следует отметить, что вблизи фокальных контактов могут локализоваться микротрубочки. И с точечными, и со штриховыми контактами могут быть локализованы виментиновые филаменты.
Индукция образования фокальных контактов происходит при контакте клетки с лигандами внеклеточного матрикса, в том числе с фибронектином. Большинство молекул матрикса имеет мультидоменную структуру и обеспечивает тем самым индукцию множественного сигнала. Показано, что в случае фибронектина для образования фокальных контактов необходимо узнавание клеткой как c RGD-пептида (аминокислотная последовательность ARG-GLY-ASP, узнаваемая в белках интегринами; встречается в белках клеточных мембран, внеклеточного матрикса и т.д.), так и с гепарин-связывающего участка молекулы.
Молекулярные массы альфа и бета цепей интегрина - рецептора фибронектина составляют 140 и 100 кДа соответственно (альфа цепь впоследствии расщепляется на две цепи, которые остаются связанными дисульфидной связью). Более подробно об интегринах см. далее. Талин связывается непосредственно с цитоплазматическим доменом интегрина (рецептора фибронектина). Субъединица талина с массой 215-235 кДа димеризуется с образованием длинной гибкой молекулы. На молекуле имеется сужение, чувствительное к Са-зависимой протеазе II. При этом талин разрезается на два неравных фрагмента - 200кД и 47 кД. Участок связывания интегрина находится на малом фрагменте. На большом фрагменте находится участок связывания винкулина.
На рис. представлена схема строения рецептора фибронектина.
При соприкосновении клетки и субстрата возникает сигнал, который раскрывает молекулу винкулина, обнажая сайты связывания талина, актина и, возможно, последовательности, необходимые для взаимодействия с другими белками. Винкулин мультимеризуется путем самоассоциации своих хвостовых доменов или, возможно, с помощью множественных связей с талином. Все эти события ведут к прикреплению F- актиновых филаментов к мембране. Активация винкулина важна не только в момент сбора стрессовых волокон у фибробластов, но и в образовании адгезионных поясов эпителиальных клеток.
В состав белкового комплекса фокальной адгезии входят нерецепторные тирозиновые и серин/треониновые киназы, такие как, например, рр125FAK , FAK ( focal adhesion kinase) и изоформы PKC ( protein kinase C ). Паксиллин является белком, который in vitro может связываться с SH3 доменом тирозин - киназы рр60 c-src. SH3 домен может быть важным посредником в белок-белковых взаимодействиях. Для трансформированных клеток известно, что они могут мигрировать сквозь окружающий их внеклеточный матрикс с помощью инвадоподий, деградируя его. Инвадоподии содержат увеличенные количества фосфорилированных по тирозину рр125FAK , паксиллина и тенсина.
В сборке фокальных контактов возможно участие и других белков, например GTP - связывающего белка rho. Микроиньекции rho в покоящиеся клетки с минимальной фокальной адгезией и числом стрессовых волокон стимулирует образование этих структур. Происходящее при активации Rho фосфорилирование (или редукция дефосфорилирования) легких цепей миозина II приводит к увеличению сократимости, что, по-видимому, является центральным звеном в цепи событий, приводящих к формированию фокальной адгезии. Эволюция индивидуального фокального контакта включает несколько этапов: формирование, созревание и, иногда, разборка. Формирование начального фокального контакта обычно осуществляется на активном краю клетки.
Модель созревания фокального контакта (Pletjushkina O.J. et al., 1997).
В центральных частях актинового кортекса, прикрепленного своими терминальными участками к фокальным контактам, развивается центростремительное натяжение (в результате сокращения индуцируемого внешним сигналом в ответ на начальное прикрепление). В результате подобного натяжения актиновые филаменты выстраиваются тангенциально относительно плазматической мембраны и прижимают вентральную часть мембраны к субстрату, тем самым приближая внеклеточные участки интегриновых рецепторов к их лигандам и механически способствуя их взаимодействию и сигнализации. Таким образом, удлинение фокальных контактов через усиление натяжения может значительно воздействовать на сигнальную трансдукцию в этих участках. Натяжение актинового кортекса оказалось важнейшим элементом функционирования фокальной адгезии. Например, изменение натяжения значительно усиливает сборку фокальных контактов под действием ростовых факторов. Усиление натяжения клетки при деполимеризации микротрубочек в среде с недостатком сыворотки вызывает сборку фокальных контактов даже при отсутствии ростовых факторов. Последствия изменения натяжения актинового кортекса под воздействием различных агентов, возможно, находят свое отражение и в других клеточных системах. Однако это направление исследований еще ждет своих результатов.
Группа контактов, связывающихся внутри клеток с промежуточными филаментами: десмосома и полудесмосома.
6.2.4. Десмосома (от греч. desmós - связь, связка и soma – тело).
Десмосомы - межклеточные контактные структуры, характерные для эпителиальных клеток. Кроме того, аналогичные структуры обнаруживаются в интеркалярных дисках миокарда позвоночных, волокнах Пуркинье, культивируемых клетках миокарда, на границе арахноидальных клеток мозга и в менингиомах их этих клеток. К десмосомам прикрепляются промежуточные филаменты, по крайней мере, трех типов - кератиновые, виментиновые, десминовые. При этом они образуют пучки, называемые тонофиламентами.
Тип промежуточных филаментов, прикрепленных к десмосомам, зависит от типа клеток: в большинстве эпителиальных клеток к десмосомам прикреплены кератиновые промежуточные филаменты; в клетках сердечной мышцы - десминовые промежуточные филаменты. Сеть промежуточных филаментов в десмосоме ассоциирована с плотной бляшкой на цитоплазматической поверхности контактной плазматической мембраны.
В десмосомах выделяется три структурных домена: цитоплазматическая бляшка, мембранный домен и центральный диск. Каждый домен характеризуется определенным набором входящих в него белков. Всего в состав десмосомы входит 7-12 белков, однако, имеются тканеспецифические вариации. Часть белков обнаруживается практически во всех десмосомах, тогда как другие присутствуют лишь в некоторых из них.
Основные строительные блоки десмосом продуцируются тремя сверхсемействами генов. Сюда входят десмосомные кадгерины, которые далее будут подразделяться на десмоглеины и десмоколлины; семейство armadillo, включая плакоглобин и плакофилины 1-3; и наконец, плакины, которые включают десмоплакин, плектин, белки клеточных оболочек энвоплакин и периплакин. Компоненты десмосом, которые выпадают из этих семейств, выполняют структурные и/или регуляторные функции.
Цитоплазматическая бляшка имеет полностью внутриклеточную локализацию и является местом прикрепления промежуточных филаментов к десмосоме. Бляшка состоит из негликозилированных белков. Обязательными белками бляшки являются:
1. Десмоплакин I - белок с молекулярной массой 240 кД, вероятно, непосредственно участвующий в заякоривании промежуточных филаментов.
2. Плакоглобин - белок с молекулярной массой 83 кД, обнаруживающийся также в адгезионных межклеточных контактах. Плакоглобин, имеющий гомологию с бета-катенином, также участвует в трансдукции сигналов.
Ряд белков десмосомальной бляшки встречается лишь в некоторых типах тканей. К ним относятся:
1. Десмоплакин II с молекулярной массой 210 кД, очень сходный с десмоплакином I. Он обнаруживается только в многослойных эпителиях.
2. Полоса 6 (75 кД) - щелочной белок, обнаруживающийся в многослойных и сложных эпителиях, но отсутствующий в простых.
3. Десмокалмин (240 кД), связывающий кальмодулин и кератины Са-зависимым образом.
Белки, входящие в мембранный домен, являются интегральными мембранными гликопротеидами, непосредственно участвующими в межклеточной адгезии. Основными белками этого домена являются:
1. Десмоглеин (полоса 3, десмоглеин I). Это трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой около 150 кД. Цитоплазматическая негликозилированная часть десмоглеина входит в состав бляшки, а наружная гликозилированная часть достигает центрального диска и врастает в него. Десмоглеин является кадгерином.
2. Десмоколлин I и десмоколлин II (полоса 4a и полоса 4b, десмоглеин IIa и десмоглеин IIb) являются трансмембранными гликопротеинами с молекулярными массами 130 кД и 97-118 кД соответственно и различаются только по гликозилированию. Поскольку антитела к десмоколлинам ингибируют образование десмосом, их можно считать адгезионными белками этих типов контактов. Десмоколлин также является кадгерином.
3. Гликопротеин 22 кДа.
Центральный диск представляет собой плотное образование толщиной 5- 9 нм, локализованное между плазматическими мембранами в области десмосомы. Центральный диск соединен с мембраной нитевидными мостиками.
Связь между десмосомными кадгеринами и сетью промежуточных филаментов может осуществляться несколькими способами, каждый из которых использует C-терминальный домен десмоплакина. Десмоплакин может функционировать как мостик между промежуточными филаментами за счет ассоциации с околомембарнным доменом десмоколлинаа Или он может соединять промежуточные филаменты с десмоглеином путем связывания плакоглобина, который в свою очередь связывается с цитоплазматическим хвостом кадгерина. Плакоглобин обладает сходными последовательностями с β-катенином и оба могут замещать один другого при образовании адгезивного пояска. Напротив, α-катенин и десмоплакин различны в отношении специфичности связывания цитоскелета с двумя типами межклеточных соединений. Десмоплакин, кроме того, может косвенно ассоциировать с десмоколлином и десмоглеином за счет соединения с плакофилином, др. родственником β-катенина.
Интересно, что устранение плакоглобина вызывает сердечнососудистые нарушения, а устранение десмоглеина-3 дает мышей с аномалиями кожи. Целенаправленное разрушение десмоколлина-1 в коже вызывает гиперпролиферацию и нарушение барьерной функции.
Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 278; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!