Описанные ниже структурная организация ЯПК и транспорт через ЯПК (пункты 1,2,3,6) были взяты из обзора Е.В. Кисилевой (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск).

Стр 1 из 6Следующая ⇒

Занятие №7.

Клеточное ядро.

Ядрышко. Ядерная оболочка.

Ядерный поровый комплекс.

I. Ядрышко.

1. Свойства ядрышка.

1.1. Методы изучения.

1.1.1.Метод серебрения.

Соли серебра имеют специфическое сродство к некоторым белкам ядрышка. Т акое сродство ядрышек к солям серебра называют аргентофилией. Аргентофилия характерная для белков, обогащенных сульфгидрильными, дисульфидными связями. Ядрышки могут восстанавливать серебро из различных растворов: нитрата серебра, «аммиачного серебра», протеинатов серебра. При этом происходит отложение темных осадков исключительно в ядрышках интерфазных клеток, а также в ЯОР на митотических хромосомах.

1.1.4. Электронная микроскопия.

1.1.5. Метод молекулярной гибридизации in situ.

Является более точным методом для определения ядрышковых организаторов по сравнению с методом серебрения. Описание технологии гибридизации in situ предложено в статье Heliot et al (1997).

1.1.6. Выделение ядрышек.

В связи с тем, что ядрышки, фактически, являются частью хромосом, их выделение затруднено. Для этого используют ультразвук с последующей седиментацией.

1.2. Физические и химические свойства ядрышка.

Ядрышко – наиболее плотный компонент клетки. Коэффициент преломления для гепатоцитов составляет 1,587. Такое свойство ядрышка объясняется высокой концентрацией в нем химических соединений. Высокая плотность ядрышка обуславливает не только сильное преломление световых лучей, но и сильное поглощение β-лучей.

Материал ядрышка состоит из 3 классов веществ: ДНК, РНК и белков. Белки составляют 70-80% от сухого веса ядрышка; такое большое содержание белка и определяет его высокую электронную плотность. Кроме белков, входящих в состав РНП-частиц, в ядрышке встречаются белки, не связанные с частицами. К ним относятся: кислые белки (фосфопротеиды), гистоновые белки, ферменты (нуклеозидтрансфераза, щелочная фосфатаза, АТФ-аза и др.). Особая роль принадлежит РНК-полимеразе-I.

РНК составляет около 10% (5-14%) веса ядрышка и обуславливает характерную базофилию ядрышка на гистологических препаратах; ДНК составляет 2-12%.

Содержание РНК, ДНК и белка в изолированных ядрышках (сухой вес в %)

Объект	РНК	ДНК	Белок	РНК/ДНК
Печень крысы	11,0	8,0	78,0	1,4
Регенерирующая печень (6 ч)	7,6	4,6	87,8	1,7
Регенерирующая печень (18 ч)	15,5	5,4	79,1	2,9
Печень морской свинки	4,1	9,5	86,4	0,43
Стебель гороха (4 дня)	15,11	10,6	74,0	1,5
Проростки гороха (36 ч)	16,7	6,4	76,9	2,6

2. Ультраструктурное строение ядрышка.

2.1. Фибриллярный центр (ФЦ).

Впервые этот термин введен в 1969г. Рехером. ФЦ представляют собой обязательный структурный компонент интерфазного ядрышка. ФЦ – это участок скопления фибрилл с низкой электронной плотностью, в составе которого находится ДНК, ответственная за синтез рРНК. Толщина основного класса фибрилл в среднем составляет 6-8нм. Зоны ФЦ состоят из тонких хроматиновых фибрилл, значительно обедненных гистоном Н1. ФЦ как и ядрышковые организаторы (ЯОР) окрашиваются солями серебра (это зависит от наличия особых ядрышковых кислых белков) и содержат РНК-полимеразу-I, что подтверждает соответствие ФЦ активным ЯОР. Однако, скорее всего, ФЦ входят в состав ЯОР вместе с внутри- и околоядрышковым хроматином.

ФЦ представляют собой сферические, реже цилиндрические образования. Объем ФЦ может сильно меняться. Число ФЦ также изменчиво. При активации синтеза рРНК наблюдается такое изменение числа ФЦ и их размеров, которое может говорить о какой-то фрагментации исходных ФЦ в относительно малоактивных ядрышках. Как правило, ФЦ разбросаны по всему ядрышку без какой-либо закономерности.

Существует несколько моделей, объясняющих пространственную организацию ФЦ и взаимоотношения различных компонентов ядрышка. По одной из них, предложенной Жоссеном и Лепуаном (Goessens, Lepoint, 1974-84), «елочка» располагается на поверхности ФЦ, где и происходит синтез рРНК. Тяжи рДНК локализованы также внутри ФЦ, но синтез РНК на них не идет: то есть в ФЦ расположены неактивные рибосомные гены и, возможно, спейсерные участки.

Согласно Мирр и Сталь (Mirre, Stahl, 1978-81) деконденсированная рДНК протянута между ФЦ, соединяя их в единую систему. При этом та часть фибрилл, которая располагается внутри ФЦ, находится в конденсированном состоянии, другая же, лежащая на поверхности ФЦ, - транскрибирует. По мнению авторов, для синтеза рРНК не обязательно, чтобы рДНК располагалось на поверхности ФЦ. Подобная пространственная организация характерна для нуклеолонемных ядрышек. Таким образом, не исключено, что ФЦ в данном случае выполняет структурную функцию, поддерживая пространственную организацию деконденсированной рДНК.

По третьей версии рДНК локализована и транскрибирует внутри ФЦ.

В активных ядрышках ФЦ не всегда хорошо выявляются, т.к. большое число мелких ФЦ распределено по ядрышку без какой-либо закономерности. Напротив, в ядрышках дифференцированных клеток, клеток с искусственно подавленной транскрипцией, а также некоторых опухолевых клеток ФЦ имеют крупные размеры и часто центральное расположение. При естественной или искусственной задержке транскрипции рРНК параллельно с упрощением композиции ядрышка происходит уменьшение числа и увеличение размеров ФЦ. Между числом и размерами ФЦ существует строгая корреляция: увеличение количества ФЦ всегда сопровождается уменьшением среднего объема одного ФЦ и ростом суммарного объема ФЦ. Это может быть связано как с дополнительным синтезом специфических белков, расходующихся на новообразующиеся ФЦ, так и с фрагментацией существующих ФЦ.

2.2. Плотный фибриллярный компонент (ПФК).

ПФК представляет собой фибриллы РНП диаметром 4-8нм. Фибриллы ПФК плотно упакованы и окружают ФЦ в виде сплошного слоя или образуют на их поверхности небольшие шапочки. По сравнению с ФЦ ПФК имеют более высокую электронную плотность. Иногда ПФК образует впячивания внутрь ФЦ, придавая им чашевидную или сегментированную форму. В области ПФК синтезируется 45S-пре-рРНК.

2.3. Гранулярный компонент.

Гранулярный компонент в виде РНП-частиц представлен электронноплотными гранулами диаметром около 10-25 нм и тонкими фибриллами толщиной 4-8 нм. Базофилия ядрышка в первую очередь обусловлена именно этим компонентом. Гранулярный компонент ядрышка соответствует прерибосомным частицам (55S-40S-РНП).

2.4. Околоядрышковый хроматин (ОХР).

Касперсон в 1950г. дает ему название «ассоциированный с ядрышком хроматин» («nucleolus-associated chromatin»). В 1964-1968гг. ядрышковый хроматин разделили на две части: внутриядрышковый (интрануклеолярный) и околоядрышковый (экстрануклеолярный). ОХР часто отождествляют с гетерохроматином ядрышкового организатора (Ченцов, Поляков, 1974). Около- и внутриядрышковый хроматин образован дезоксирибонуклеопротеидными (ДНП) фибриллами диаметром 20-30нм.

Увеличение размеров ядрышек или возрастание их числа во время интенсивного синтеза РНК в клетке обычно сопровождается утолщением околоядрышкового хроматина. В растущих, регенерирующих или железистых клетках, где в основном и встречаются крупные ядрышки, обычно развит и околоядрышковый хроматин. ОХР богат гуаниновыми и цитозиновыми основаниями, что подтверждает участие этой ДНК в синтезе рРНК. ОХР в зависимости от степени активности ядрышкообразующего района выявляется или в виде конденсированного блока, или же проявляет более рыхлую упаковку. ОХР связывает ядрышко с ядерной оболочкой в ранних проэритробластах и, как правило, окружает все ядрышко так, что граница между ядрышком и хроматином выражена нечетко.

2.5. Матрикс ядрышка.

Это белковый остов ядрышка. На ультратонких срезах не выявляется. Но если экстрагировать из ядрышек РНК, ДНК и белки, то можно видеть, что ядрышко как таковое не распадается, не теряет своей общей формы. После таких обработок структура ядрышка представлена рыхлой фибриллярной сетью, заполняющей объем ядрышка.

2.6.Ядрышковая вакуоль («nucleolar vacuole»).

Вакуоли (или интерстиции, или светлые полости, лишённые мембран) характеризуются сравнительно низкой концентрацией материала, который по структуре практически не отличим от нуклеоплазмы. Термин «ядрышковая вакуоль» не совсем точен, т.к. в классическом смысле вакуоль должна иметь мембрану. Однако в 1966г. он был утвержден. Цитохимическими тестами в содержимом вакуолей не удалось обнаружить ионов металлов, энзимов и жиров. Вопрос о химической природе вакуолей пока еще остается открытым. В некоторых клетках (например, в бластомерах куриного зародыша или ооцитах мыши) содержимое вакуолей обладает повышенной плотностью по сравнению с нуклеоплазмой. А в центральной вакуоли растительных клеток выявляются РНП-гранулы диаметром 15нм и более.

Из данных, полученных на растительных клетках, следует, что вакуоли служат для накопления продуктов деятельности ядрышка и вывода их в нуклеоплазму. Однако некоторые учёные считают, что вакуолизация ядрышек связана с периодами синтеза РНК: активный выход синтезированного продукта может приводить к образованию полости внутри ядрышка. С другой стороны, замечают Moreno-Diaz и соавторы, парадоксально, но обработка клеток веществами, уменьшающими ядрышковую активность, также приводит к формированию кольцевидных ядрышек. Ультраструктура таких ядрышек несколько нарушена: нуклеолярный кортекс более компактный, а в вакуолях появляются 33нм гранулы.

Кроме этого, существуют сведения об экспорте материала ядрышка при помощи вакуолей в клетках корневой меристемы Allium cepa L. Moreno-Diaz и соавторы обнаруживают в вакуолях ядрышек растительных клеток гомогенные гранулы размером 15 нм в диаметре, являющихся, по их мнению, аналогами рибосом. Эта гипотеза нашла подтверждение в работах, связанных с ролью вакуоли в дисперсии внутриядрышкового хроматина. Ядрышковые вакуоли выявлены также в клетках листа чеснока, активность которых увеличивается вследствие формирования каллуса. Авторы предполагают, что связано с увеличением ядрышковой транскрипционной активности.

Долгое время о функции вакуолизированных ядрышек в клетках животных ничего (кроме сходного с нуклеоплазмой строения) не было известно. Но на примере гепатоцитов морской свинки показали, что и в этих ядрышках вакуолярная система принимает участие в депонировании и транспорте рРНП. Кроме 25нм фибрилл на ультратонких срезах ядрышек клеток печени обнаружили два типа РНП-структур, локализующихся внутри ядрышковых вакуолей. Первый – гранулы размером 15-20нм в диаметре, сходные по морфологии с гранулярным компонентом. Подобные гранулы находят и в растительных объектах, проводя аналогию с рибосомами. Таким образом, можно высказать ещё одно предположение о функции вакуолярного компонента ядрышка как месте процессинга рРНК. Второй тип – фибриллы диаметром 15-20нм; по толщине они сопоставимы с РНП-фибриллами, находящимися в околоядрышковой области ядра и собственно в нуклеоплазме. Предполагается, что такой вакуолярный РНП-компонент представляет собой продукт активности ядрышкового хроматина. С другой стороны, вакуоль может образовываться вследствие частичной инактивации рДНК.

Подводя итоги выше сказанному, можно выделить следующие предполагаемые функции ядрышковых вакуолей:

— накопление продуктов деятельности ядрышка,

— образование вакуоли вследствие активного транспорта,

— образование вакуоли вследствие инактивации рДНК,

— экспорт материала ядрышек при помощи вакуолей,

— место процессинга рРНК.

3. Функции ядрышка. Связь структуры и функций.

3.1. Синтез и процессинг рибосомальной РНК.

Это основная функция ядрышка была открыта Касперссоном в30-ых годах XX века.

Внимание!!! О всех ниже перечисленных функциях можно говорить только, начиная со слова «предполагается…». Участие компонентов ядрышка во всех этих процессах со 100% точностью не доказано (в скобках даны ссылки на статьи авторов, занимающихся соответствующей проблемой).

3.2. Синтез низкомолекулярной или 4-7-РНК.

3.3. Модификация нуклеотидов некоторых мяРНК (Malatesta et al, 2000; Pederson, 2002).

Движение мяРНК часто встречается в клетках, вероятно, это необходимо для взросления мяРНК. мяРНК специфически обнаруживаются в ПФК.

3.4. Некоторая роль в биосинтезе SRP.

3.5. Транспорт и/или деградация мРНК (Malatesta et al, 2000).

3.6. Тельца Кахаля.

Прежнее название телец Кахаля - coiled bodies (это название придумали электронные микроскописты). Тельца Кахаля были открыты в 1903г. испанским цитологом Рамон-и-Кахалем. В тельцах Кахаля располагаются домены, которые взаимодействуют с рядом белков, включенных в пре-РНК-процессинг, создание рибосом, пре-мРНК-сплайсинг. транскрипцию. В частности, было выявлено, что тельца Кахаля солокализуются с некоторыми ядрышковыми белками и факторами транскрипции РНК-полимеразы II. При этом тельца Кахаля не содержат ДНК и поэтому не могут быть сайтами транскрипции. Тельца Кахаля существуют как в клетках животных, так и в клетках растений. Тельца Кахаля локализуются по периферии ядрышка и – иногда - внутри него. Они могут разъединяться на 2 дочерних тельца или, наоборот, формировать более крупные тельца. Белок р80 – коилин (coilin) - является маркерным для телец Кахаля.

Связь структуры и функций.

Структурная организация ядрышка тесно связана с его функциональной активностью. Сопоставление структуры и функций ядрышек наиболее детально изучено на примере дифференцирующихся лимфоцитов крови и костного мозга человека, эритробластов млекопитающих и птиц, модели крипты-ворсинка. Данные о различной функциональной активности разных типов ядрышек (см. далее) позволяют выделить следующие группы ядрышек:

— высокоактивные (компактные, нуклеолонемные и ядрышки типа кора-сердцевина; все они характерны для недифференцированных клеток, активно делящихся и быстро растущих),

— умеренноактивные (ретикулярные, вакуолизированные и, может быть, псевдонуклеолонемные),

— малоактивные (кольцевидные ядрышки с центрально расположенным ФЦ и сегрегированные; характерны для клеток с явным признаками дифференцировки и при подавлении синтеза рРНК),

— неактивные (плотные фибриллярные ядрышки и свободные ФЦ).

Динамичность ядрышка.

Ядрышко – это динамичная структура. каждый морфологический тип ядрышек отражает уровни трех основных процессов, связанных с биогенезом рибосом: синтез пре-рРНК, процессинг и миграцию РНП-частиц в нуклеоплазму. При обычной функциональной нагрузке, соответствующей потребностям определенной популяции клеток, скорости протекания этих процессов постоянны, поэтому структура ядрышка остается практически неизменной.

4. Белки ядрышка.

На данный момент насчитывают около 270 белков ядрышка, большая часть которых включена в синтез или процессинг рРНК (Pederson, 2002). Годом позже (2003) Leung et al идентифицировали в ядрышковой протеоме около 400 белков. Около 12% белков из данных 400 выявлены в клетках человека, около 30% белков представляют собой новые и не охарактеризованные белки.

По распространению ядрышковых белков в клетке можно выделить следующие классы:

― белки, которые локализуются преимущественно в ядрышке,

― белки, которые встречаются как в ядрышке, так и в нуклеоплазме,

― белки ядрышка (около 24%), которые связаны с нуклеиновыми кислотами или нуклеотидами,

― рибосомальные белки (14%),

― факторы трансляции (3,5%),

― ферменты, ответственные за модификацию РНК (9%),

― РНК-хеликазы DEAD-box’a (5%),

― шапероны (5%),

― оставшиеся 11% не были определены в какую-либо группу (Anderson et al, 2002).

90% белков ядрышек, выделенных из клеток человека, включаются в рибосомальный биогенез. Около 10% обладают факультативной ядрышковой локализацией, так например, они могут находиться в ядрышке только в течение одной стадии клеточного цикла. В статье Leung et al, 2003 приведена большая таблица белков ядрышка с указанием краткого и полного названий белка, его функций.

4.1. Аминокислотный состав ядрышка.

В работе Leung et al (2003) было выявлено, что заряженные аминокислоты (такие как глутамин, аспарагин, лизин или аргинин) наиболее предпочтительнее для ядерно-специфических и обще-клеточных белковых последовательностей. Интересно, что полярная аминокислота серин, которая является важной мишенью для фосфорилирования, не является общесвойственной для последовательностей белков ядрышка.

На данный момент не выявлено специфической последовательности («мотива»), которая была бы общей для всех ядрышковых белков. Но для ядрышкового протеома человека подобная специфическая пептидная последовательность определена. Она представляет собой тетрапептид – Lys/Arg-Val-Xaa-Phe – и называется РР1 (phosphotase-1binding motif). Это означает, что белок, содержащий РР1-сайт вероятнее всего будет локализоваться в ядрышке нежели в других частях ядра (Leung et al, 2003). Кроме того, белки ядрышка (по сравнению с белками ядра и клетки вообще) обогащены трипептидами GRG и RGG.

4.2. Специфические ядрышковые белки.

В эту группу входят белки, связанные с транскрипцией рибосомных генов, с процессингом 45S, факторы транскрипции, ферменты, участвующие в синтезе и процессинге рРНК.

РНК-полимераза I . РНК-полимераза-I имеет мол. массу около 500 кДА. В зависимости от происхождения и методов выделения в ее состав входят от 10 до 13 компонентов. Большая субъединица этого фермента (195кДа) имеет сродство к серебру. Этот белок локализуется в зоне ФЦ, по их периферии, в зоне ядрышковых организаторов митотических хромосом. Это обстоятельство не противоречит данным, что во время митоза транскрипция полностью прекращается.

UBF ( Upstream Binding Factor) . UBF – фактор транскрипции рРНК. Имеет 764 аминокислотных остатка у человека (94 или 97 кДа). UBF при массе в 97 кДа состоит из 5 (у Xenopus) или 6 (у человека) тандемно повторяющихся последовательностей, имеющих гомологию с HMG-1- и HMG-2-белками, поэтому UBF относят к группе HMG-белков. UBF связывается с промотером рибосомального гена, таким образом UBF выявляется на периферии ФЦ и. возможно, в ПФК. Во время митоза UBF распределяется поровну между 2 дочерними клетками. Динамика UBF идентична поведению РНК-полимеразы-I.

Нуклеолин (С23). Негистоновый белок, фосфопротеин. Мол. масса -110 кДа (706 аминокислотных остатков у человека). Входит в состав ФЦ и ПФК, а также обнаруживается в зонах ЯОР в митотических хромосомах. Следовательно, он обнаруживается как на транскрибируемых, так и на неактивных участках рибосомных генов. Имеет сродство к серебру. С недавних пор предполагается, что нуклеолин является многофункциональным белком. Так, возможно, что ускоряет взаимодействие белков и рРНК. N-терминальный конец нуклеолина показывает гомологию с HMG-белками.

Нуклеофозмин (В23; nucleophosmin , NPM ). Мол. масса – 37 кДа (294 аминокислотных остатка у человека). В23 – высококонсервативный белок. Локализован в области ПФК и гранулярного компонента. Считается, что этот белок участвует в промежуточных и конечных стадиях биогенеза рибосом и в транспорте пре-рибосом. Фактически, В23 связывает NLS-последовательности и перемещается между ядрышком и цитоплазмой.

Нуклеофозмин был обнаружен in vitro в составе центросомы 3Т3-клеток, в тех клетках, которые имели только одну центросому. Клетки, в которых дупликация центросомы уже произошла, нуклеофозмина в составе этой органеллы не содержали: нуклеофозмин выходит из центросомы перед ее удвоением. Диссоциация нуклеофозмина от центросомы происходит под действием комплекса CDK2-cyclin E. При использовании антител, блокирующих фосфорилирование нуклеофозмина in vitro, центросома не удваивается.

Фибрилларин. Мол. масса – 34 кДа. Этот белок является компонентом мяРНК. Он осуществляет первые этапы процессинга пре-рРНК. Фибрилларин ассоциирован с другими РНП, в состав которых входит U3-, U8- и U13-мяРНК, необходимые для начального этапа процессинга 45S-рРНК. Фибрилларин локализован в ПФК. В созревшем виде он содержит N-терминальный повторяющийся домен, богатый глициновыми и аргининовыми остатками. Центральная его область имеет сходство с РНК-связывающим доменом и РНП-типичные последовательности. Фибрилларин имеет схожее с метилтрансферазами строение. Мутации аналога этого белка (Nop 1) в дрожжах приводят к накоплению неметилированных пре-РНК и потере цитоплазматических рибосом. В митозе фибрилларин диссоциирует от ядрышка и располагается на поверхности рибосом.

Nopp 140. Мол. масса – 140 кДа. Преимущественно ядрышковый белок. Nopp 140 локализуется в тельцах Кахаля только после первоначального накопления его в ядрышке. в связи с этим предполагается, что он играет роль в транспорте от ядрышка к тельцам Кахаля.

5. Строение и функционирование генов рРНК.

Гены класса I, кодирующие 5,8S, 18S- и 28S-рРНК, транскрибируются РНК-полимеразой I. Все мРНК и ряд малых ядерных РНК (мяРНК) образуются при транскрипции генов класса II с участием РНК-полимеразы II. тРНК, 5S-рРНК и некоторые малые цитоплазматические РНК (мцРНК) образуются при транскрипции генов класса III с участием РНК-полимеразы III.

Гены класса I . Экспрессия.

Каждая единица транскрипции рРНК кодирует 18S-, 5,8S- и 28S-рРНК, перечисленные в порядке их расположения, начиная с 5´-конца. Три рРНК-кодирующие последовательнсти фланкируются и разграничиваются промежуточными транскрибируемыми сегментами. Они называются соответственно внешними (5´- и 3´-ETS) и внутренними (5´- и 3´-ITS) транскрибируемыми спейсерами. Область между тандемно повторяющиммися единицами транскрипции протяженностью от нескольких т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) до почти 30 т.п.н. первоначально называлась нетранскрибируемым спейсером (NTS). Поскольку, как теперь стало известно, подобные спейсеры на самом деле транскрибируются и транскрипция в этих областях, возможно, является особенностью регуляции экспрессии рДНК, применительно к ним стали использовать более подходящие название – межгенные спейсеры (IGS). Длина IGS варьирует от 2 т.п.н. у дрожжей до 30 т.п.н. у млекопитающих.

Размеры и нуклеотидная последовательность областей, кодирующих рРНК, весьма незначительно варьируют среди широкого круга эукариот. Напротив, длина ITS изменяется в широких пределах в зависимости от вида; соответственно изменяется и размер единиц транскрипции. Так, единица транскрипции рДНК в ДНК человека имеет размер около 14 т.п.н., приближаясь к самой длинной из известных.

В большинстве случаев копии рДНК организованы в виде тандемного повтора, образующего протяженный кластер. В геноме человека рДНК обнаружена в 5 хромосомных локусах, при этом каждый из них содержит разное число копий рДНК, а кроме того, число копий на хромосому неодинаково у разных индивидов.

РНК-полимераза.

Определить тип эукариотической РНК-полимеразы можно по ее чувствительности к α-аманитину, токсичному бициклическому октапептиду, выделенному из гриба Amanita. РНК-полимераза II инактивируется при очень низких концентрациях α-аманитина; для инактивации РНК-полимеразы III более высокие концентрации (20мкг/мл). РНК-полимераза I сохраняет активность даже при концентрации октапептида 200 мкг/мл.

Процессинг рРНК.

18S-, 5,8S- и 28S-рРНК образуются из транскрипта-предшественника в результате процессинга, включающего расщепление РНК эндонуклеазами и метилирование как нуклеотидов, так и 2'-гидроксильных групп. Метилирование и связывание с рибосомными белками про-рРНК происходят непосредственно во время транскрипции. Расщепление начинается на 5'-конце 5,8S-рРНК и далее происходит в местах соединений 18S- и 28S-рРНК со спейсерами. Сборка рибосомы заканчивается связыванием соответствующих рибосомных белков.

Гены 5 S -рРНК.

Гены 5S-рРНК, как правило, сцеплены с генами 18S-, 5,8S- и 28S-рРНК; исключения обнаружены только среди грибов и простейших. Гены 5S-рРНК, длина которой составляет 120 нуклеотидов, не прерываются никакими интронами. У человека гены 5S-рРНК располагаются на хромосоме 1: около 2000 копий на гаплоидный геном. Гены 5S-рРНК у многих эукариот многократно повторяются и образуют семейства длинных тандемных повторов.

6. Классификация ядрышек.

В настоящее время в литературе существует достаточное количество данных, позволивших выделить несколько типов ядрышек в зависимости от изучаемого объекта: от его видовой принадлежности, от нормы или патологии ткани, от стадии онтогенеза. Таким образом, все эти результаты дают нам возможность говорить о состоянии клетки в целом.

В 1985 г. Челидзе предложил условно объединить все ядрышки в три основные формы: ретикулярные (или нуклеолонемные), компактные и кольцевидные. Однако в 1988 году П.В. Челидзе и О.В. Зацепиной была предложена иная классификация, в основу которой положены данные о структурной и функциональной активности ядрышек в клетках животного и растительного происхождения. Согласно данной классификации можно выделить девять типов ядрышек: компактные, нуклеолонемные, ядрышки типа кора-сердцевина, ретикулярные, вакуализированные, кольцевидные, сегрегированные, плотные и свободные фибриллярные центры; во многих клетках показаны ядрышки переходных форм. Для каждого из них описана морфология, соотношение фибриллярного и гранулярного компонентов, степень активности и виды тканей, где обнаруживается данный тип.

6.1. Нуклеолонемные ядрышки.

Типичные нуклеолонемные ядрышки – крупные, с характерным нитчатым строением. Их стабильные структуры – нуклеолонемы, или нити – имеют диаметр 150-200 нм и состоят из перемешанных между собой фибриллярного и гранулярного компонентов. Нуклеолонема представляет собой непрерывный тяж, соединяющий все ФЦ. Нуклеолонемы неоднородны по своему строению: в них кроме гранул толщиной 15 нм входит множество тонких фибрилл, которые могут образовывать в нуклеолонемах отдельные сгущения. Контуры нуклеолонемных ядрышек сильно «изрезаны», поэтому их иногда даже называют цветковидными.

В петлях нуклеолонемы располагаются электронно-светлые области: фибриллярные центры и ядрышковые вакуоли. Основными критериями, по которым можно отличить эти два компонента, являются следующие: фибриллярный центр состоит главным образом из однородных по толщине фибрилл диаметром 7-10 нм и характеризуется большей (по сравнению с вакуолями) электронной плотностью; содержимое же вакуолей по структуре и плотности практически неотличимо от нуклеоплазмы.

Как правило, между петлями нуклеолонемы находятся мелкие вакуоли примерно одинакового диаметра. Однако в ядрышках гепатоцитов морской свинки были обнаружены вакуоли другого типа: в них наблюдались скопления фибрилл толщиной около 25 нм, отличающихся высокой электронной плотностью и сходных по структуре с фибриллами околоядрышкового хроматина; также удалось выявить связь этих фибрилл с околоядрышковым хроматином. Предполагается, что эти скопления относятся к внутриядрышковому хроматину. Аналогичная связь вакуолярного компонента и внутриядрышкового хроматина была отмечена в раннем развитии Sinapis alba. В клетках фиброаденомы молочной железы обнаружена связь внутриядрышкового хроматина со всеми фибриллярными центрами ядрышка.

Многочисленные мелкие ФЦ имеют преимущественно сферическую форму и равномерно распределены в объеме ядрышка. Диаметр ФЦ колеблется от 50нм до нескольких микрон. В некоторых объектах (напр., гепатоциты куриного зародыша) ФЦ идентифицируются с трудом. Число и средний суммарный объем ФЦ выше, а средние размеры ФЦ ниже по сравнению с ретикулярными ядрышками. ПФК (20% от общего объема ядрышка) интенсивно развит и формируют тяжи и «шапочки» вокруг ФЦ. Гранулярный компонент также интенсивно развит и занимает около 65% от общего объема ядрышка. ОХР и ВХР в нуклеолонемных ядрышках развиты слабо.

Как правило, нуклеолонемные ядрышки встречаются в активно синтезирующих и пролиферирующих. В частности, такие ядрышки имеются в дифференцированных интерфазных эритроидных клетках, незрелых мегакариоцитах, в гепатоцитах интактной печени морской свинки, мыши и крысы. Но для каждого из этих видов животных определены свои морфофункциональные особенности. Так, для ядрышек клеток печени морской свинки характерно слабое развитие (иногда даже не выявляется) плотного фибриллярного и низкое содержание гранулярного компонентов. Однако это не говорит об инактивации ядрышка, так как гепатоциты – клетки, активно синтезирующие большое количество белков; вероятно, что причина подобной морфологии заключается в высокой скорости процессинга. Кроме того, нуклеолонемные ядрышки обнаружены в клетках культуры СПЭВ.

Обычно в пролиферативно активных клетках (проэритробласты печени мыши) нуклеолонема формирует в центральной части ядрышка сетевидную структуру, окруженную слоем гипертрофированного гранулярного компонента. Важно отметить, что общая композиция различных вариантов нуклеолонемного ядрышка обусловлена разной степенью компактизации ДНК-фибрилл р-хроматина. Так, например, структурные изменения в ядрышке, наступающие вслед за гепатэктомией, могут быть объяснены деконденсацией р-хроматина и увеличением линейных размеров транскрипционно-активной части рДНК.

По одной из гипотез, которая сочетает в себе две выше описанные модели пространственной организации ядрышка, в нуклеолонемных ядрышках транскрибирующие р-гены могут локализоваться на поверхности ФЦ и в тяжах рДНК, протянутых между ФЦ, а отходящие от рДНК латеральные РНП-фибриллы, очевидно, при этом образуют аргентофильный ПФК. Выключенная из работы часть р-генов теряет связь с аргентофильными белками и собирается в нуклеосомные фибриллы внутриядрышкового конденсированного хроматина толщиной 20-30 нм, нечувствительные к ионам серебра. В типе нуклеолонемные ядрышки можно выделить три класса: собственно нуклеолонемные, нуклеолонемно-вакуолизированные, псевдонуклеолонемные (более подробно см. далее).

6.2. Ретикулярные ядрышки.

В клетках печени мыши ядрышки отличаются слабым развитием плотного фибриллярного компонента, хорошо выраженными фибриллярными центрами и вакуолярной системой, которая придает им губчатую (трабекулярную) форму. Вследствие этого они и были выделены в особый тип – ретикулярные (или трабекулярные) ядрышки. В световом микроскопе по размерам и организации они сходны с нуклеолонемными; некоторые авторы даже используют эти термины как синонимы.

По сравнению с нуклеолонемным ретикулярное ядрышко имеет более округлую форму и сглаженные контуры. Трабекулы состоят преимущественно из РНП-фибрилл. Серийные срезы ретикулярного ядрышка свидетельствуют о том, что степень вакуолизации в нем очень высока. Суммарный объем вакуолей от общего объема ядрышка достигает 37%. Так называемые каналы вакуолярной системы имеют связь с нуклеолоплазмой и околоядрышковым хроматином, от которого отходят ДНП-фибриллы, проникающие в вакуоль. Хорошо выраженные фибриллярные центры имеют эллиптическую форму и гладкую поверхность, распределены по всему ядрышку и лежат на границе трабекул и вакуолей. Зоны плотного фибриллярного компонента не формируют тяжей (как в нуклеолонемных ядрышках), а образуют лишь небольшие «шапочки», локализованные на поверхности фибриллярного центра. По сравнению с фибриллярным материалом гранулярная часть развита намного слабее. ОХР образует крупные блоки и структурно связан с ФЦ, расположенными в периферической части ядрышка.

Ретикулярные ядрышки встречаются в клетках с умеренным уровнем синтеза рРНК. В частности, ретикулярные ядрышки обнаруживаются в дифференцированных соматических клетках в норме и морской свинки, адреналоциты крысы, ооциты мыши на стадии двухслойного фолликула) и после действия ряда канцерогенов (гепатоциты крысы после действия этионина).

6.3. Вакуализированные ядрышки.

Вакуоли обнаруживаются в ядрышках разных типов: нуклеолонемных, ретикулярных, а также кольцевидных. В первых двух случаях размеры вакуолей не превышают 0,1-0,15мкм, Если происходит увеличение их размера, которое сопровождается редукцией числа (до 1-2), а также если вакуолярный компонент преобладает над РНП-частью, то можно говорить о наличии вакуолизированного (лакунарного) ядрышка. Такие гигантские вакуоли сообщаются с нуклеоплазмой и с вакуолями меньших размеров.

ФЦ в вакуолизированных ядрышках хорошо выражены и лежат на границе с вакуолями; вследствие сильного развития вакуолярной системы они как бы «оттесняются» на периферию ядрышка. Зоны ПФК выражены слабее, чем в ретикулярных ядрышках. Число и размеры ФЦ и степень развития РНП-части аналогичны этим характеристикам в ретикулярных ядрышках. Вакуолизированные ядрышки в зависимости от степени развития фибриллярного и гранулярного компонентов можно разделить на две группы: фибриллярно-гранулярные и гранулярные.

В фибриллярно-гранулярных ядрышках РНП-компонент представлен как фибриллами, так и гранулами, ФЦ хорошо выражены. Такие ядрышки обнаружены в гепатоцитах куриного зародыша и мыши, в растущих ооцитах на стадии двухслойного и многослойного фолликула, в клетках корня моркови и конуса роста корешка лука после действия ингибиторов синтеза рРНК.

В гранулярных вакуолизированных ядрышках отмечается резкое преобладание гранулярного компонента над фибриллярным; ФЦ практически не выявляются. К таким ядрышкам можно отнести ядрышки в гепатоцитах куриных зародышей, клетках эпителия желчного протока крысы после обработки нитрозоморфолином, меристематических клетках проростков кукурузы, клетках корня гороха, дифференцирующихся под действием гормонов.

Популяция клеток с подобными ядрышками составляет в интактной печени мыши около 20%; остальные 80% приходятся на ретикулярные. Средний суммарный объём вакуолей в вакуолизированном ядрышке достигает 60% от общего объёма ядрышка, в то время как в ретикулярном типе он составляет 37%. Суммарный объём фибриллярных центров, а также взятых вместе ФЦ+ПФК, меньше, чем в ретикулярных ядрышках. При этом число фибриллярных центров и их размеры, как и объём РНП-компонентов не различаются. Таким образом, объём вакуолизированного ядрышка приблизительно в 1,4 раза больше объёма ретикулярного ядрышка.

Казалось бы, вакуолизация ядрышек животных клеток связана с частичной инактивацией рДНК. Сокращение числа вакуолизированных ядрышек в регенерирующей печени мыши подтверждает такое предположение. Однако, несмотря на резкие различия суммарных объёмов вакуолей, по степени развития РНП-части вакуолизированные и ретикулярные ядрышки не различаются. Кроме того, снижение количества фибриллярных центров в вакуолизированных ядрышках не сопровождается увеличением их размеров. Таким образом, вопрос о функциональной активности вакуолизированных ядрышек пока ещё остаётся открытым.

6.4. Кольцевидные ядрышки.

Кольцевидные ядрышки можно условно разделить на 2 группы: кольцевидные ядрышки с центрально расположенным фибриллярным центром и кольцевидные ядрышки с центральной вакуолью. Термин «кольцевидное» не отражает пространственной организации, а говорит лишь о форме ядрышка на ультратонких срезах. Следует заметить, что зачастую при исследовании кольцевидных ядрышек в световом микроскопе вакуоль и гигантские фибриллярные центры легко спутать друг с другом. Однако в 1988 году Челидзе и Зацепина предлагают несколько иную классификацию ядрышек. Согласно этой классификации истинные кольцевидные ядрышки - это кольцевидные ядрышки с ФЦ, а кольцевидные ядрышки с центральной вакуолью относятся к типу вакуолизированные ядрышки (класс гранулярные).

Если в ядрышке содержится одна гигантская вакуоль, то такое ядрышко принято называть кольцевидным с центральной вакуолью. Ядрышки подобного типа чаще всего встречаются в пролиферирующих эмбриональных клетках животных и пролиферирующих клетках (меристематических) растений. В некоторых случаях подавление синтеза РНК также может приводить и к возникновению кольцевидных вакуолизированных ядрышек. Так, например, кольцевидные ядрышки такого типа обнаружены в полихроматофильных эритробластах. Скорее всего, кольцевидную форму с хорошо развитым ФЦ ядрышки должны приобретать на одном из этапов, близких к терминальной дифференцировке.

Кольцевидные ядрышки, в которых центральная светлая зона представляет собой фибриллярный центр, были выявлены в следующих типах клеток: высокоспециализированные клетки животных и человека, находящиеся на стадии терминальной дифференцировки; клетки с искусственно подавленной синтетической активностью. При трехмерной реконструкции такие ядрышки имеют грибовидную или седловидную форму. Периферическая часть ядрышек образована фибриллярным компонентом и бедна гранулами; иногда в ней видны вакуоли. ОХР и ВХР хорошо развиты, имеют вид блоков, структурно связанных между собой. Этот тип распространен среди животных объектов и не характерен для растительных клеток. Кольцевидные ядрышки с центрально расположенным ФЦ являются малоактивными.

Наличие кольцевидных ядрышек (как вакуолярного, так и фибриллярного типов) является отличительной чертой опухолевых клеток: клеток лимфосаркомы, гепаткарциномы, опухолей предстательной и щитовидной желез, а также лейкозных лимфоцитов. На клетках рака молочной железы показано, что определённой степени злокачественности рака соответствуют определённые формы ядрышка. Кольцевидные формы ядрышек без признаков нуклеолонемной структуры встречаются только при второй и третьей степенях злокачественности; вблизи ядрышка всегда выявляется зона околоядрышкового конденсированного хроматина. При первой степени злокачественности кольцевидные ядрышки бывают редко, чаще – нуклеолонемно-кольцевидные; конденсированный перинуклеарный хроматин не обнаружен.

Таким образом, сама по себе кольцевидность ядрышка не является однозначным показателем ни его функционального состояния, ни степени активности ядра, ни степени дифференцировки клетки. Вопрос о функциональной активности кольцевидных ядрышек с центральной вакуолью пока еще остается открытым.

6.5. Ядрышки типа кора-сердцевина.

Основными структурными компонентами являются РНП-фибриллы и гранулы. При этом центральная часть ядрышка занята фибриллярным компонентом, гранулы образуют мощный слой на его периферии. ФЦ морфологически не выявляются; возможно, они замаскированы продуктами синтеза рРНК. Как правило, вакуолярный компонент плохо выражен. Об организации ОХР и ВХР не известно. Размер не превышает 1-2 мкм. Ядрышки типа кора-сердцевина характерны для клеток с высоким уровнем синтеза рРНК и белка, то есть эти ядрышки можно отнести к высокоактивным. Они описаны в ооцитах и сперматоцитах амфибий и некоторых беспозвоночных, гепатоцитах саламандры и меристематических клетках многих растений.

6.6. Компактные ядрышки.

Эта форма характеризуется отсутствием нуклеолонем и имеет вид плотных структур, как правило, погруженных в ОХР. Эта форма ядрышек встречается в специализированных клетках и, скорее всего, характеризуется низкой активностью. Наиболее часто компактные ядрышки встречаются в опухолевых клетках. Однако, уже в 1988 г. Челидзе и Зацепина утверждают, что компактные ядрышки (наряду с нуклеолонемными) являются наиболее активными и характерны для незрелых (бластных) клеток.

Компактные ядрышки отличаются достаточно крупными (3-4мкм) размерами.Имеют высокую плотность упаковки компонентов (РНП-фибрилл, гранул и ФЦ), которые равномерно распределены по объему ядрышка. ФЦ хорошо выражены, имеют округлую или чашеобразную форму и достигают 0,1-0,5мкм в диаметре; общее число ФЦ в одном ядре превосходит число ядрышкообразующих районов. ФЦ могут быть собраны в группу, окруженные общим слоем ДНП-фибрилл – такие группы были названы фибриллярными комплексами. Отличительный признак компактного ядрышка - высокая степень развития гранулярного компонента (70-80% от общего объема ядрышка). Вакуоли, как правило, полностью отсутствуют. Лишь в некоторых объектах в компактных ядрышках наблюдается система мелких полостей – такие ядрышки получили название компактно-нуклеолонемные. Таким образом, в типе компактные ядрышки можно выделить два класса: собственно компактные и компактно-нуклеолонемные. ОХР и ВХР в компактных ядрышках развиты слабо.

При анализе ядрышек на ЭМФ следует быть внимательными, т.к. есть вероятность принять за компактные ядрышки плоскость сечения сегрегированных или кольцевидных ядрышек. Компактные ядрышки наблюдаются в следующих видах ткани: корневой меристеме проростков гороха, клетки инфильтратных форм рака молочной железы. Компактные ядрышки обладают высокой активностью. Они обнаруживаются в интенсивно пролиферирующих и растущих клетках животных и растений: корневая меристема проростков гороха, кукурузы, клетки инфильтратных форм рака молочной железы, клетки асцитной карциномы Эрлиха, культура ткани (свиньи, мыши, человека). В некоторых случаях при активации синтеза РНК также появляются компактные ядрышки: в лимфоцитах при действии фитогемагглютинина, в гепатоцитах при обработке тиоацетамидом. Кроме того, компактные ядрышки выявляются в клетках трофобласта лабиринтного отдела плаценты крысы, то сеть в дифференцирующихся клетках.

6.7. Сегрегированные ядрышки.

Основным морфологическим признаком сегрегированных ядрышек считается пространственное разделение (сегрегация) их структурных компонентов. Такие ядрышки имеют небольшие размеры: 1-2 мкм в диаметре. Гранулярный и фибриллярный компоненты четко отделены друг от друга. ФЦ значительно увеличиваются в размерах, уменьшаются в количестве и локализуются в периферической части ядрышка. Вакуолей практически не образуется. Сегрегированные ядрышки обнаруживаются в большом числе объектов животного и растительного происхождения после действия различных ингибиторов синтеза рРНК, в частности актиномицина Д. Кроме того, ядрышки этого типа выявляются в процессе естественном дифференцировки клеток, например, в эпителии ворсинок тонкой кишки и в лимфоцитах крысы.

Сегрегированные ядрышки образуются под действием многих антибиотиков, которые подавляют не только транскрипцию (актиномицин), но и редупликацию (митомицин) и трансляцию (циклогексимид). Аналогичная картина наблюдается при действии на клетки некоторыми канцерогенами (афлатоксин) и антиметаболитами. Такое многообразие веществ, вызывающих сегрегацию ядрышка, и способы их воздействия на клетку указывают на тот факт, что процесс образования сегрегированных ядрышек не носит специфического характера. Любое нарушение клеточного метаболизма в конечном итоге отражается на процессе транскрипции. Кроме того, сегрегированные ядрышки обнаружены при созревании эритробласта на стадии ортохроматофильного эритробласта (в данных клетках они состоят из ФЦ и слоя ПФК) и в эпителии ворсинок тонкой кишки.

Сегрегированные ядрышки характеризуются низким уровнем синтеза рРНК, причем при полной сегрегации компонентов ядрышка синтез рРНК практически равен нулю.

6.8. Плотные фибрилляторные ядрышки.

Имеют малые размеры: менее 1мкм, это само по себе служит удобным критерием для их идентификации. Обладают высокой плотностью упаковки РНП-материала, имеют сферическую форму и ровные контуры. В этом типе ядрышек можно выделить два класса: малые и большие фибриллярные ядрышки. Малые плотные фибрилляторные ядрышки обнаруживаются в клетках эпителия ворсинки кишечника мыши и крысы, ядерных эритроцитах, бластомерах амфибий, а также в клетках, подверженных воздействию многих химических и физических факторов – ингибиторов синтеза рРНК. Большие плотные фибрилляторные ядрышки выявляются в растущих ооцитах на стадии многослойного фолликула и в ядрах 1-2 клеточных зародышей некоторых млекопитающих. Плотные фибриллярные ядрышки практически неактивны.

6.9. Свободные ФЦ.

Некоторые авторы рассматривают их как одну из разновидностей микроядрышек. На светооптическом уровне без специального окрашивания свободные ФЦ не выявляются. На электронно-микроскопическом уровне они представляют собой округлые зоны, образованные рыхло лежащими фибриллами. То есть свободные ФЦ практически не отличаются от ФЦ, видимых в составе ядрышек других типов. В некоторых случаях ФЦ контактируют с небольшим количеством фибрилл. Свободные ФЦ обнаруживаются в клетках, характеризующихся полным отсутствием синтеза рРНК: ядерных эритроцитах птиц, нормобластах костного мозга и печени зародыша мыши, гранулоцитах. свободные ФЦ видны в телофазных клетках и метафазных хромосомах; в последнем случае их называют ядрышкообразующими районами. при стимуляции синтеза рРНК вокруг свободных ФЦ начинается формирование активного ядрышка.

6.10. Промежуточные типы ядрышек.

Несмотря на такое многообразие типов, в клетках встречаются и промежуточные между ними типы ядрышек, некоторые из которых рассмотрены ниже.

6.10.1. Нуклеолонемно-вакуолизированные (нуклеолонемно-кольцевидные) ядрышки.

Нуклеолонемные ядрышки, в которых наряду с элементами нуклеолонемы отчетливо выявляется вакуоль (вакуоли), принято называть нуклеолонемно-вакуолизированными. Такие ядрышки встречаются в гепатоцитах куриного зародыша, в бластомерах мыши на стадии морулы, в гепатоцитах крысы после хронического отравления CCI₄. Ядрышки такого типа занимают как бы промежуточное положение между вакуолизированными и истинно нуклеолонемными ядрышками. С другой стороны, нуклеолонемно-вакуолизированные ядрышки можно отнести к фибриллярно-гранулярным вакуолизированным ядрышкам.

6.10.2. Псевдонуклеолонемные ядрышки.

Обнаружены в гепатоцитах регенерирующей печени крысы через 6 часов после операции. Такие ядрышки также состоят из интенсивно развитой нуклеолонемной сети, которая намного сильнее извита и разветвлена, чем в контроле; гранулярный компонент при этом уменьшается (ядрышко может практически не содержать гранул). Длина нуклеолонемы в таких ядрышках через 6 часов после гепатэктомии в 2,5 раза превышает длину нуклеолонемы в контроле. ФЦ хорошо выражены. Обладают большей по сравнению с нуклеолонемными транскрипционной активностью. Обнаруживаются в клетках асцитной карциномы Эрлиха, нефроцитах мыши, луминарном эпителии матки крысы, нормальном и малигнизированном эпителии молочной железы человека, при подавлении синтеза рРНК.

6.10.3. Компактно-нуклеолонемные ядрышки.

Основной объем ядрышка занят гранулами, РНП-фибриллы располагаются преимущественно вокруг мелких и многочисленных ФЦ, ядрышковый хроматин развит плохо, в некоторых участках ядрышка видны тяжи нуклеолонемы.

6.10.4. Ячеисто-кольцевидные ядрышки.

6.10.5. Ядрышки типа «рулевых колес».

Ядрышки типа «рулевых колес» относятся в гранулярным вакуолизированным ядрышкам. Они содержат несколько крупных вакуолей, вследствие этого срез такого ядрышка по форме напоминает рулевое колесо; отсюда и пошло название ядрышка.

6.10.6. Гипертрофированное ядрышко.

Как отдельный тип или промежуточная форма гипертрофированное ядрышко не описано. Но, на мой взгляд, такое ядрышко является именно промежуточной формой. Основное отличие гипертрофированных ядрышек – значительное увеличение размеров. Как правило, это происходит за счет увеличения гранулярного компонента. Вероятно, что такие изменения могут происходить в любом типе ядрышек. Выявляется гипертрофированные ядрышки в гепатоцитах регенерирующей печени через 22 часа после операции. Гипертрофированные ядрышки также характерны для гепатоцитов, вступивших в митоз и находящихся в конце S- или начале G2-фазы. В гипертрофированных ядрышках нуклеолонемные тяжи развиты намного сильнее и упакованы более рыхло, чем в контроле. Все клетки, содержащие гипертрофированные ядрышки, содержат по 4 центриоли, то есть тетраплоидны. Длина нуклеолонемы в гипертрофированных ядрышках через 22 часа после гепатэктомии в 1,6 раза превышает длину нуклеолонемы в контроле.

7. Ядрышко и клеточный цикл.

В G1-, S- и G2-периодах происходит увеличение транспорта рРНК из ядра в цитоплазму; вероятно, что образование вакуоли связано именно с этим процессом. В середине S- и G2-периодов некоторые кольцевидные ядрышки трансформируются в компактные. Последние также подвергаются некоторым изменениям, которые заключаются в уменьшении концентрации и содержания РНК.

На примере опухолевых клеток Эрлиха было выявлено, что в G2-фазе объем ядра и ядрышек практически в 2 раза больше, чем в G1-периоде. Для сравнения: объем ядрышек в G1-периоде в опухолевых клетках Эрлиха составляет 49,18мкм ³, в S-периоде – 88,121мкм ³, а в G2-периоде – 92,89мкм ³. Эти наблюдения в дальнейшем подтвердились Зацепиной и др. (1989): в диплоидных проэритробластах (G1) суммарный объем ядрышек в 1,7 раза больше, чем в тетраплоидных (G2).Таким образом можно предположить, что суммарные объемы ФЦ пропорциональны плоидности клетки, то есть числу содержащихся в ней рибосомных генов (ядрышкообразующих хромосом – ЯОР). Однако, число ФЦ не образует строгой корреляции с плоидностью клетки.

8. Морфогенез ядрышка.

8.1. Морфогенез ядрышка в процессе терминальной дифференциации эритробластов.

На примере эритробластов удается проследить все переходные этапы трансформации ядрышка, связанные с прекращением транскрипции ДНК, входящей в состав ЯОР, расходованием РНП в условиях отсутствия продукции новосинтезированной РНК и разборкой ядрышка. Процесс инактивации ядрышка сопровождается увеличением зон ОХР, уменьшением размеров ядрышка, редукцией гранул, укрупнением ФЦ и уменьшением их числа. Так, число ФЦ в проэритробласте почти в 30 раз превышает число ФЦ в нормобласте, а средний диаметр ФЦ в нормобласте в 2 раза больше, чем в проэритробласте; при этом суммарный объем ФЦ на клетку в 3,5 раза выше в проэритробласте по сравнению с нормобластом.

Это подтверждает ранее высказанную гипотезу о механизме возникновения в интерфазных ядрышках крупных ФЦ и кольцевидных ядрышек вследствие прекращения работы генома (в том числе и ядрышковых генов) и расходования рибонуклеопротеидной (РНП) части. Конечной формой превращения ядрышка в высоко специализированных клетках считается кольцевидное ядрышко с центрально расположенным ФЦ. То есть, возможно, что инактивация ядрышка при эритропоэзе сопровождается слиянием индивидуальных ФЦ и, может быть, и уплотнением их материала. Однако, против слияния ФЦ говорит тот факт, что уменьшение числа ФЦ в процессе эритропоэза сопровождается и уменьшением их суммарный объемов. С другой стороны, уменьшение суммарного объема ФЦ может быть вызвано потерей их белкового компонента (например, РНК-полимеразы I). Таким образом, на примере морфогенеза ядрышка в процессе терминальной дифференцировки эритробластов можно проследить зависимость структурной организации ядрышка от его функциональной активности.

Кроме того, было показано, что в активных ядрышках проэритробластов общее число ФЦ коррелирует с плоидностью клетки и в несколько раз превышает количество ядрышкообразующих районов хромосом. Это означает, что в активных ядрышках один ЯОР образует более одного ФЦ. При этом суммарные объемы ФЦ в нормобластах втрое меньше, чем в проэритробластах, хотя средние объемы индивидуальных ФЦ выше в нормобластах. Вероятно, что инактивация ядрышек при эритропоэзе сопровождается слиянием индивидуальных ФЦ и, возможно, уплотнением их материала.

8.2. Морфогенез ядрышка вследствие частичной гепатэктомии мышей и крыс.

Процессы морфогенеза ядрышек также были показаны при стимуляции клеток интактной печени к пролиферации методом частичной гепатэктомии. Так в ядрышках гепатоцитов морской свинки после резекции части органа через 2,5 и 5 часов хорошо выражен плотный фибриллярный компонент и увеличен гранулярный компонент, размеры вакуолей при этом уменьшаются; это говорит об увеличении синтеза и процессинга пре-рРНК. Через 9 часов после операции происходит расширение вакуолярного компонента и уменьшение толщины тяжей нуклеолонемы, что свидетельствует о транспорте образовавшейся рРНК. Однако внутриядерный хроматин при этом обнаруживает увеличенную степень конденсации. Авторы работы связывают это с выключением ряда генов, ответственных за синтез тканеспецифичных белков при включении в работу так называемых генов митоза.

Подобное увеличение количества гранулярного компонента, а также общего объёма ядрышка и количества фибриллярных центров, и уменьшение вакуолярной части наблюдается в течение 18 часов после частичной гепатэктомии печени мыши. Наиболее существенные изменения структуры ядрышек видны через 18-24 часа после стимуляции, когда в клетках обнаруживаются нуклеолонемные ядрышки (32%), а частота вакуолизированных снижается с 20% до 2% . Плотный фибриллярный компонент занимает 20% нуклеолонем (гранулярный – 65%) и объединяет все фибриллярные центры, число которых, по сравнению с ретикулярными ядрышками, выше, а размер – меньше. Следует отметить, что уже через 6 часов после операции около 70% внутриядрышкового хроматина декомпактизовано, а через 22 часа объём нуклеолонемы понижается. Данные о наличии рДНК подтверждаются методом серебрения.

II. Ядерно-поровый комплекс.

Ядерный поровый комплекс (ЯПК) пронизывает двухслойную ядерную оболочку и обеспечивает пассивный (за счет диффузии) и активный (требующий энергетических затрат) транспорт различных молекул между ядром и цитоплазмой.

Описанные ниже структурная организация ЯПК и транспорт через ЯПК (пункты 1,2,3,6) были взяты из обзора Е.В. Кисилевой (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск).

1. Структурная организация.

Ядерная пора - это сложное образование, проявляющее октагональную (восьмикратную) симметрию и состоящее из 50 различных белков - нуклеопоринов (всего пора содержит около 1000 белков и имеет вес около 125 мДа). Нуклеопорины сгруппированы в комплексы, которые формируют 6 горизонтальных колец, связанных многочисленными вертикальными спицами. Многие индивидуальные компоненты ЯПК имеют субъединичное строение, что обеспечивает ее высокую пластичность в процессе молекулярного транспорта. Два периферических кольца диаметром около 120 нм - цитоплазматическое и внутриядерное ограничивают центральную часть ядерной поры, состоящую из двух зеркально симметричных отделов. Каждый из этих отделов включает 3 связанных друг с другом кольца: внутреннее, контактирующее с центральным транспортером; среднее, пронизывающее боковой участок ядерной мембраны, формирующей пору, и радиальное, расположенное в просвете между наружной и внутренней ядерными мембранами. Среднее и радиальное кольца обеспечивают прочное закрепление поры в ядерной оболочке, а внутреннее играет роль основного каркаса, вокруг и внутри которого собраны остальные компоненты поры. Центральный канал поры имеет вариабельный внутренний диаметр (меняющийся от 10 до 26 нм) и находится внутри транспортера, состоящего из 4 связанных между собой частей: 2-х симметричных тонкостенных цилиндров и 2-х одинаковых периферических гранул, которые привязаны 8-ю фибриллами к периферическим кольцам поры и закрывают оба входа в центральный канал. Транспортер занимает центральную часть внутреннего кольца поры.

Периферические отделы ЯПК являются несимметричными, что, вероятно, связано с различными механизмами ядерно-цитоплазматического транспорта молекул через пору на начальных этапах их импорта и экспорта. Со стороны цитоплазмы пора имеет 8 гранул, расположенных на цитоплазматическом кольце, как бусы на нитке, и содержащих короткие фибриллы, со стороны ядра - 8 фибрилл, отходящих от внутриядерного кольца и формирующих структуру, похожую на баскетбольную корзину (названную баскет-комплекс; от англ. basket - корзина). В неактивной поре фибриллы баскета закрывают вход в пору, а в активной - формируют дополнительное кольцо диаметром около 50 нм.

Структурная организация ЯПК у всех высших организмов, включая человека, птиц, амфибий, насекомых и высших растений сходна и является высоко консервативной. Плотность расположения пор в ядерной оболочке (ЯО) варьирует в среднем от 13 до 30 пор на 1 мкм² поверхности ядра, достигая 5000 пор на одно ядро в ооцитах лягушки и ранних эмбрионах дрозофилы. Предполагается, что все ядерные поры являются универсальными и могут обеспечивать транспорт молекул как в ядро, так и в цитоплазму. Изменение числа поровых комплексов в ЯО высших эукариот может происходить при изменении функционального состояния клеток, вероятно, за счет их образования de novo. В то же время из-за тесной связи с ламиной, фибриллярной сетчатой структурой, расположенной с внутренней стороны ядерной оболочки, ЯПК не могут изменять свое местоположение в ядерной мембране.

В отличие от высших организмов, низшие эукариоты (например, дрожжи) не имеют ламины, благодаря чему их ядерные поры могут свободно перемещаться вдоль ядерной оболочки, а их плотность в различных участках оболочки может существенно изменяться. Структура ядерных пор дрожжей до сих пор детально не изучена, хотя показано, что их диаметр (~100 нм) меньше, чем у пор высших организмов (~120 нм), а часть нуклеопоринов в них отсутствует. Вместо 50 нуклеопоринов пора дрожжей содержит только 30. Это согласуется с моделью ЯПК дрожжей, демонстрирующей ее более простое строение по сравнению с клетками высших эукариот. Так, например, в ЯПК дрожжей отсутствует радиальное кольцо в центральном компоненте поры. Однако периферические отделы в порах дрожжей также несимметричны, а центральный канал имеет те же размеры, что и аналогичный канал у высших эукариот. Наблюдаемая универсальность организации ЯПК предполагает, что именно такое строение необходимо для обеспечения возможности двунаправленного транспорта молекул через ЯПК.

Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 309; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

12 3 4 5 6 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!