Векторные системы для клонирования в клетках эукариот: животных, растительных и дрожжевых.
Основой векторов для клонирования генов животных чаще всего является геном вируса обезьян SV40.
Для растительных клеток, которые не содержат собственных плазмид, основой векторов часто служат геномы вирусов растений, а также бактериальная плазмида pTi, которая опосредует перенос сегментов плазмидной ДНК в геномы различных двудольных растений и индуцирует образование опухолей (корончатых галлов). Семейство плазмид pTi выявлено в грамотрицательных бактериях Agrobacterium tumefaciens
Гены эукариотических клеток состоят из участков – экзонов (кодирующие области) и интронов. В процессе сплайсинга из первичных транскриптов удаляются интроны и объединяются участки, содержащие экзоны.
Сначала из клеток выделяют зрелую матричную РНК, появляющуюся в клетке при функционировании выбранного для клонирования гена.
Такая РНК содержит только соответствующие экзонам нуклеотиды, то есть фактически кодирует аминокислотную последовательность нужного белка. Затем с помощью обратной транскриптазы проводят реакцию синтеза ДНК на матрице этой РНК. Полученные таким образом молекулы (комплементарные ДНК, кДНК) объединяют с промотром прокариотического гена и вводят путем лигирования в составплазмиды-вектора. После трансформации такой векторной ДНК бактерий в их клетках будет продуцироваться эукариотический белок.
Чтобы сделать ген бактерии работающим в клетках эукариот (например, клетках растений) с помощью рестрикции и последующего лигирования объединяют промотор какого-либо эукариотического гена и структурную часть прокариотического.
|
|
|
Такая генетическая конструкцияили «гибридный ген» будет транскрибироваться эукариотической РНК-полимеразой, то есть «работать» в эукариотической клетке.
Например, если структурную часть гена инсулина человека объединить с промотором какого-либо бактериального гена и ввести такую последовательность ДНК в способную реплицироваться в клетках бактерий плазмиду-вектор, то такие бактерии будут синтезировать инсулин.
26. Способы введения рекомбинантных ДНК в клетки различных организмов. Поиск клонов с рекомбинантной ДНК.
Прямое введение гена в клетку осуществляют несколькими способами:
Трансфекция
Микроинъекция
Электропорация
Метод «мини-клеток»
Упаковка в липосомы
Электронная пушка
Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.
Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий СаС12 их мембрана становится проницаемой для ДНК.
Эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка.
|
|
|
Отбор бактерий, подвергшихся трансформации, осуществляется в процессе клонирования.
Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бактерий на 1 см2 поверхности.
Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием колонии. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника.
Конкретные имеющие тот или иной чужеродный для них ген бактерии обычно называют клоном,то есть совокупностью одинаковых по содержащейся в них наследственной информации клеток, а вышеописанная процедура называется клонирование генов.
Требования, предъявляемые к питательным субстратам, использующимся в биотехнологических процессах
Питательные субстраты, применяемые в биотехнологии.
В питательной среде должны присутствовать все элементы, необходимые для построения компонентов живых клеток в доступной для усвоения форме. В больших количествах клеткам необходимы макроэле-менты: углерод, азот, кислород, водород, фосфор, сера, калий, кальций, магний. Снабжение клеток кислородом и водородом осуществляется за счет воды. Углерод является составной частью всех органических соединений и его источники многочисленны и многообразны: чаще всего сахара, многоатомные спирты и органические кислоты. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного и растительного происхождения. Помимо макроэлементов, клетки в незначительных количествах нужаются также и в некоторых микроэлементах: натрий, марганец, никель, кобальт, хлор, цинк, медь, кремний, молибден, бор, ванадий и некоторые другие. Кроме основных пластических и энергетических компонентов, питательные среды могут содержать и так называемые факторы роста. Это органические соединения (витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и др.), в которых нуждаются ауксотрофные клетки икоторые они синтезировать не в состоянии. Отсутствие таких веществ при- водит к нарушению обменных процессов и прекращению роста клеток. В качестве необходимых компонентов питательных сред могут вы- ступать газы: хорошо (NH3, H2S), умеренно (CO2) или плохо (N2, O2, H2, CH4) растворимые в воде.
|
|
|
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 1264; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!