Ферментативная система синтеза ДНК in vitro. Активирование ДНК
1956 – 1960 Артур Корнберг, первый биотехнолог
1. Днк-образец
2. dNTP – активир. Дезоксинуклеозиды – акт. Субстраты, мономеры
3. Днк-полимераза
4. Mg2+
Днк пол нужен спаренный 3’-ОН конец ДНК в качестве затравки, одноцеп. ДНК-матрица
1960-е Корнберг, один из нуклеотидов, ddATP всегда включался в полим. цепь и обнаруживался на её 3’-конце – док-во униполярности, синтез всегда от 5’к 3’, необходимость ОН-гр
активирование эндонукл. 1
3-й способ активирования - эндонуклеазой
ДНК-пол помимо полим. акт. Обладает 5’-3’ эндонук. акт.
ДНК-пол1 E.coli и пол. Корнберга – 1 полипепт. цепь, 90 тыс, полим. акт, 5’-3’ эндон. гидр. и 3’-5’ эндонукл. акт.
При синтезе – поли Т, но в системе возможна ошибка Ц-А-3’ неспарен. Ферм, вкл. непр.нуклеотид, может вернуться и откусить 1 неспар. нуклеотид
Проявл. 5’-3’ гидр. акт. – ДНК-пол. отщепит по 1 Т из 2-го олиго dT и построит дальше цепь (такой же олиго dТ)
Днк-пол. работает, съест 2-й олиго dТ и постр. новый Дойдёт до 3-го – откусит 5 - 4 dC и 1 dТ, далее расщепит весь олиго dТ. 4-й олиго dТ не отщепится (ДНК пол не может отщепит более 10Н), ДНК пол перейдёт на олиго dС и синтез. олиго dG
Вопрос 59
ДНК-пол помимо полим. акт. Обладает 5’-3’ эндонук. акт.
ДНК-пол1 E.coli и пол. Корнберга – 1 полипепт. цепь, 90 тыс, полим. акт, 5’-3’ эндон. гидр. и 3’-5’ эндонукл. акт.
При синтезе – поли Т, но в системе возможна ошибка Ц-А-3’ неспарен. Ферм, вкл. непр.нуклеотид, может вернуться и откусить 1 неспар. нуклеотид
|
|
|
Проявл. 5’-3’ гидр. акт. – ДНК-пол. отщепит по 1 Т из 2-го олиго dT и построит дальше цепь (такой же олиго dТ)
Днк-пол. работает, съест 2-й олиго dТ и постр. новый Дойдёт до 3-го – откусит 5-4 dC и 1 dТ, далее расщепит весь олиго dТ. 4-й олиго dТ не отщепится (ДНК пол не может отщепит более 10Н), ДНК пол перейдёт на олиго dС и синтез. олиго dG
Вопрос 60
Схема непрерывной антипараллельной репликации Корнберга in vivo
1961г – первая предложенная схема
Концы – обязательно серия палиндромов – спаривание 3’конц.
Далее 3’-к. в кач-ве затравки – синтез. Позднее – спец. эндонуклеаза режет по оси. Корнберг сам видел недостаток своей модели – укорочение ДНК с каждым раундом репликации. И хотя линейная ДНК действ. укорачивается, это происходит по др. причине.
Вопрос 61
Вопрос 51
Схема непрерывной параллельной репликации Кернса
1963; использовал авторадиографии
НА подложку наливают фотоэмульсию (в темноте), выдерживают 2 недели. ИЗ меченных Т вылетают β-част., после проявления – тёмные точки
К. смотрел на ДНК через Эл. микроскоп и там же – на автографию.
По ширине засветки – число репл. цепей, К. наблюдал широкую полосу, движ. в 1 напрвлении.
|
|
|
Схема не верна, но заставила искать ф-ты, раб. в напр. 3’-5’
Вопрос 62
Вопрос 52
Схема прерывистой антипараллельной репликации Оказаки
1968 год
Метод импульсного мечения – на 5-10 секунд. Скорость полимериз. ДНК пол1 – 667 нм в мин, пол2 в 20 раз медл, пол 3 в 15 быстрее.
Давалась метка, через нужное время добавляется 1000-кр. избыток немеч. нуклеотидов.
Метод центрифкгирования в щел. градиенте сахарозы – ДНК денатурирует, после центрифугирования короткие последовательности отделяются от длинных.
Доказательство – в эксп. с фагом Т4 (мутантный штамм с термочувств. лигазой) – работает от 20-43 градусов С.
E.coli заражали фагом, при этом реплицировалась только фаг. ДНК, причём обе цепи синтез. прерывисто. Давалась имп. метка, далее центрифугировалось в щел. градиенте сахарозы. Сшивка мелких фрагментов.
Это доказыват необходимость лигазы и прерываистость.
Не хватало затравки.
Прерывивстость показана для всех, кроме одноцепочечных фагов.
У некоторых бактерий и фагов прерывистый синтез по обеим цепям.
У всех остальных есть лидирующая цепь и отстающая
Чем выше вид в эвол. лестнице, тем меньше фрагменты Оказаки
Вопрос 63
ДНК-полимераза 3, 3*, holo-ф-т.
|
|
|
К репликации имеет отношение лишь 1 и 3, причём именно 3 является репликазой, 1 – вспомогательная, репаративная. Полимераза 2 – только репарация
Вопрос 64
Схема размножения фага М13 и док-во наличия РНК-затравки в репликации ДНК
ДНК – кольцевая, одноцеп.
мРНК компл. дочерней цепи – идентична исходной. После трнмляции 6 белков, часть из них необходима для репл. 2 дочерней цепи.
Рифампицин - ингибитор бактериальной РНК-полимеразы (на стадии инициации).
Хлорамфеникол - ингибитор трансляции на бактериальных рибосомах.
Если одновременно с заражением E. сoli фагом добавить хлорамфеникол, то блокируются трансляция, репликация II и сборка фагов.
Если подействовать рифампицином, то блокируется не только транскрипция и все следующие процессы, но и репликация I.
Вывод: бактериальная РНК-полимераза участвует в репликации ДНК фага.
Вся фаговая ДНК составляет ~6000 нукл.
Вопрос 65
Модель Катящегося колеса
Репликация 2 ДНК-фага M13
После репл. 1 – 2-х цепоч. ДНК. НА 5´ конец садится реп-белок (геликаза E.coli, кот. не нужен одноцеп. участок ДНК) он отодвигает 5’ конец.
Белок 2-го гена обладает лигазной активностью – сшивка концов полной (+)ДНК, при этом он вновь вносит разрыв в (-)цепь
|
|
|
Вопрос 66
В фаге Т10174 работает не РНК-полимераза, а фермент-праймаза dnaG.
Нуждается в белках препрайминга. Праймосома – белки препрайминга и праймаза
dnaG
dnaВ – геликаза (6 субъединиц)
dnaС -6 мол-л
n' – АТФ-за
n – стр. компоненты
Пока dnaG работает, паровоз (праймосома) под ней, когда он отйдёт, и праймаз перестанет работать.
Парово – праймосома, её белки делают петлю, необх. для работы dnaG
Белки идут по матричной цепи 5’-3’, а праймаза ноборот, синтезируя РНК-затравки в организованных с помощью прайминга участках ДНК на раст. ~1000 нукл
Репликация аденовируса не нужд. в затравке.
Вопрос 67
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 1171; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!