Імуноблотинговий метод дослідженя
Імуноблотинг – якісний метод, який дозволяє з великою вірогідністю визначати Аg або Аt в будь-якому біологічному середовищі організму. Специфічність і чутливість методу - 99-100 %. Метод імуноблотингу схожий на ІФА, проте фінальний етап дослідження полягає у переносі й іммобілізації біополімера (Аg або Аt) на пористу мембрану, де біополімер аналізують за допомогою імуносорбентів. Імуноблотинг завдяки своїй специфічності належить до референс-тестів (підтверджуючих).
Один з варіантів електрофоретичного розділення антигенів у гелі, який супроводжується переносом фракціонованих антигенних білків з гелевої пластинки на лист нітроцелюлози (блотинг), де в подальшому здійснюють ідентифікацію антигенів за допомогою специфічних сироваток.
Електрофорез антигенних білків проводять у гелі з додаванням додецилсульфата натрія, що дозволяє розділяти сотні компонентів суміші, визначати їх розміри, виявляти подібність антигенів. Блотинг використовують у зв’язку з тим, що не всі антитіла здатні проникати у пори геля. При накладанні нітроцелюлозної мембрани на гель отримуюють так званий “сендвіч”. Його занурюють у буферний розчин, витримуюють декілька діб і завдяки градієнтній дифузії антигени з геля переходять у твердофазну пористу нітроцелюлозну мембрану. Таким чином отримують відбиток електрофореграми – блот (блотограму), на якому за допомогою специфічних сироваток ідентифікують певні антигени. Для виявлення комплексів “антиген-антитіло” використовують різні барвники, які здатні зв’язуватись з білками – амідо чорний 10 В, кумасі блакитний R-250, понсо S, швидкий зелений FCF та інші.
|
|
|
Комплемент представляє собою комплекс сироваткових білків з протеолітичною дією, який бере активну участь в елімінації антигенів завдяки поступовій каскадній активації окремих його компонентів. За нормальних умов комплемент знаходиться в організмі унеактивному стані, що запобігає саморуйнуванню клітин. Запуск системи активації комплемента відбувається під впливом антигенів, комплексів “антиген-антитіло”, С-реактивного білка, манан-з’язуючого лектина. В активному стані комплемент сприяє фагоцитуванню і лізису антигенних клітин-мішеней. На здатності комплемента спричиняти цитоліз (лізис клітин) базуються такі методи лабораторної діагностики, як реакція лізиса та реакція зв’язування комплемента.
Розділ 3. Практична реалізація сучасних методів виявлення та ідентифікації патогенних агентів
Застосування імунологічних методів у діагностиці інфекційних захворювань
ПЛР у лабораторній практиці ідентифікації патогенних агентів
|
|
|
Розділ4 Техніко-економічне обґрунтування випуску тест-системи
Аналіз фармакологічних властивостей цільового лікарського засобу та галузі використання
Розроблена тест-система має виявляти туберкульоз на всіх стадіях, особливо актуальною є властивість виявляти ранні стадії розвитку туберкульозу. Сферою застосування даного препарату являються в першу чергу діагностування людей, які знаходяться на диспансерному обліку. Такождана тест-система має бути застосована при комплексному дослідженні, як з один з етапів контролю стану здоров’я хворих на СНІД та інших людей, які при певних умовах можуть тривалий час контактувати із хворими на туберкульоз. Виходячи з даних про кількість «споживачів» тест-системи робимо розрахунок необхідноїпотужності виробництва.
Обсяг ринку та очікувані темпи його розвитку
Визначальними вимогами до методів діагностики є специфічність і чутливість. Якщо метод має недостатню специфічність, то при його використанні буде отримано велике число хибнопозитивних результатів серед здорових людей або серед нетуберкульозних хворих. Недостатньо чутливий метод “пропускатиме” дуже багато дійсно хворих на активний туберкульоз, а дуже чутливий — може давати позитивний результат при тестуванні здорових людей з неактивною формою туберкульозу або пацієнтів, щодо недавно вакцинованих БЦЖ. При виборі методу діагностики важливу роль також грають: час аналізу, його вартість, відтворність результатів, а також можливість об'єктивного інструментального обліку результатів.
|
|
|
Серед класичних методів діагностики туберкульозу легенів, мабуть, найбільшою специфічністю володіє метод ідентифікації культури збудника в посіві мокроти пацієнта.
Проте мікобактерії дуже повільно ростуть на поживних середовищах і для отримання навіть попередньої відповіді при бактеріологічному дослідженні потрібен 3 тижні, що не влаштовує клініцистів.
Широко застосовується також цитологічне (мікроскопічне) визначення мікобактерій в мазках мокроти і плеврального ексудату хворих після забарвлення міцним синім (АFВ-метод). Проте обидва ці методи виявляються непридатними при небацилярних формах туберкульозу, коли мікобактерії відсутні в біологічних рідинах. Оскільки такі форми туберкульозу зустрічаються в 2–3 рази частіше за бацилярні, загальна ефективність виявлення хворих при використовуванні даних методів невисока. Крім того, культивування мікобактерій, через їх повільне зростання, достатньо тривала (близько 1 місяця) і дорога процедура, а цитологічна ідентифікація не володіє достатньою чутливістю, чревата помилками і дуже сильно залежить від кваліфікації персоналу (при використанні і тесту в лабораторіях країн, що розвиваються, виявляється 20–40% хворих на туберкульоз, в розвинутих країнах ≈ 40–60%).
|
|
|
Діагностика легеневого туберкульозу, заснована на рентгеноскопії грудної клітки, може давати неадекватні результати через виниклих під дією найрізноманітніші чинники неспецифічних змін в легенях. Крім того, при різних поєднаних інфекціях, наприклад, туберкульоз+ВІЛ, картина рентгеноскопії взагалі може сильно відрізнятися від класичної (характерної для активного процесу в легенях).
В цілому, три описаних вище методи діагностики туберкульозу (ідентифікація культури, АFВ-метод і рентгеноскопія) малопридатні для масового скринінгу населення, здійсненні тільки в спеціалізованих лабораторіях і вимагають серйозного фінансування. Практично завжди вони використовуються лише для підтвердження діагнозу “активний туберкульоз”, а не для його виявлення. В результаті, рання діагностика туберкульозу часто ґрунтується лише на клінічній картині і сукупності непрямих ознак.
Відносно широкі можливості для скринінгу туберкульозу надають методи серодіагностики, серед яких найбільш поширені тести, засновані на визначенні антитіл до антигенів мікобактерій. Результати серологічних тестів в набагато меншому ступені залежать від того, в якій формі — бацилярної або не бацилярній — виявляється туберкульоз. Завдяки своїй щодо невисокої вартості, швидкості, достатньо високої чутливості і специфічності, вони незамінні при масових обстеженнях. Здавалося б, що з серологічними методами конкурує недорогий і простий у виконанні шкірний туберкуліновий тест (реакція Манту), що є показником напруженості клітинного імунітету. Проте, через низьку специфічність і, по суті, нездатність диференціювати активні і неактивні форми туберкульозу його застосування в більшості випадків навряд чи виправдано. Навпаки, гуморальна імунна відповідь вельми характерна саме для активного процесу, тому серологічні тести, в яких проводиться визначення специфічних до M. tuberculosis антитіл, набагато достовірніше за шкірні тести.
Серологічні методи відрізняються великою різноманітністю. Традиційні тести, засновані на реакціях гемаглютинації, гальмуванні гемаглютинації, фіксації комплементу і деякі інші, відносно прості в постановці, недорогі, мають невеликий час проведення аналізу (від 1 години до доби), потребують мінімумі устаткування. Проте вони в даний час морально застаріли і, крім того, ефективна діагностика туберкульозу з їх допомогою можлива тільки при комбінованому сумісному використовуванні відразу декількох тестів.
Результати аналізу при постановці традиційних серологічних методів досить погано піддаються інструментальному обліку. Тому до їх недоліків можна додати відомий суб'єктивізм візуальної оцінки і, отже, не дуже добру відтворюваність результатів тесту в “сірій зоні” при невисоких титрах антитіл до антигенів мікобактерій.
До сучасних методів серодіагностики туберкульозу, що отримали останнім часом достатньо широке застосування, відносяться імунохроматографія і дот-блоттинг. Тест-системи, в яких використовуються ці принципи, пристосовані для простого у виконанні експрес-аналізу з візуальною оцінкою результату.
До імунохроматографічних діагностикумів відноситься набір “ТВ-Check-1” що випускається в Австрії. Постановка аналізу в даній тест-системі не викликає особливих ускладнень у лаборанта і дозволяє отримати результат тестування за 25–35 хвилин. До недоліків тесту можна віднести високу вартість аналізу і серйозну залежність оцінки результату від оператора при невисокому титрі специфічних антитіл (тобто в “сірій зоні”).
Прикладом тест-системи, в якій використовується дот-блоттинг, може слугувати набір “МycoDot”, що виробляється фірмою “DynaGene”. Постановка аналізу із застосуванням даного набору складніша, ніж тестування зразків в тест-системі “ТВ-Check-1”. Проте при його використовуванні за рахунок позитивних і негативних контролів досягається велика точність візуальної оцінки результату, а вартість аналізу дещо менше ніж в тест-системі “ТВ-Check-1”.
Серед сучасних методів серодіагностики туберкульозу найбільше розповсюдження отримали імуноферментний і радіоімунний аналізи (ІФА і РІА). При їх використанні, як правило, застосовується інструментальний облік і автоматична (комп'ютерна) обробка результатів аналізу, що дозволяє виключити суб'єктивну оцінку. Для тест-систем, в якому використовуються принципи ІФА і РІА, характерні: високий технічний рівень, ступінь стандартизації і відтворюваність результатів аналізу. Вони зручні в роботі і дозволяють проводити одночасне тестування великої кількості проб, тобто проводити скринінг. Інтенсивний розвиток методу ІФА в останні 10–15 років призвів до того, що імуноферментні тест-системи за своїми характеристиками, і в першу чергу по чутливості, стали схожі на радіоімунні тести. Проведення ІФА, на відміну від РІА, не вимагає обладнаних для роботи з радіоактивністю приміщень, високої кваліфікації персоналу і дорогого устаткування, крім того, вартість аналізу значно нижче. Тому в більшості лабораторій імуноферментні тест-системи витіснили радіоімунні.
Порівняльні характеристики сучасних тест-систем наведені в таблиці 1.1
Таблиця 1.1
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 1352; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!