Контрольные задания для СРС  

Лекция 4 Культивирование микроорганизмов

 

План лекции

1. Основные стадии и показатели роста микроорганизмов.

2. Стадии разработки биотехнологического производства - лабораторный регламент (подбор штаммов, субстратов, условий культивирования, конструкции биореактора, способов выделения и оценки качества конечного продукта, технологическая схема), опытно-промышленное испытание (масштабирование в условиях полупромышленных производств), промышленное производство (масштабирование). 

3. Характеристика этапов.

 

 

Основные стадии и показатели роста микроорганизмов

 

Организация любого микробиологического процесса синтеза практически важных веществ начинается с изучения физиологии продуцента.

Необходимо изучить характер питания продуцента, а также влияние внешних факторов на состояние клеток и популяций. Вопросы эти выясняются путем оптимизации исследуемого про­цесса. Основой для этого является культивирование микроорга­низмов в контролируемых и управляемых условиях.

Оптимизация давно существующих промышленных процессов начиналась с эмпирического подбора условий методом «проб и ошибок». При большой затрате времени и труда в конечном итоге устанавливали состав сред и режим культивирования, на­иболее приемлемые экономически и, которые в дальнейшем также эмпирически возможно совершенствовать при ведении процесса в промышленном масштабе.

Долгое время не существовало иного способа культивирования микроорганизмов в лаборатории, кроме периодического: засев — размножение продуцента —- съем выросшей культуры и выделе­ние нужного продукта из клеток или из среды.

В промышленности с давних пор существовали и другие спо­собы культивирования микроорганизмов: непрерывно-проточный метод получения этилового спирта из мелассы и проточный метод получения уксуса из спирта при помощи бактерии, иммобили­зованных на твердой фазе — древесных стружках. Эти методы пришли в лабораторную практику на десятилетия позже, когда появились новые технические возможности и новые взгляды на проблемы культивирования микроорганизмов.

По мере развития технологии производства, изучения физио­логии и биохимии микроорганизмов методы их культивирования в лаборатории и в промышленности совершенствовались и видо­изменялись. Многие технологические приемы проведения химиче­ских реакций оказались пригодными для микробиологических процессов, прежде всего проведения их в реакторах — фермен­терах со всем необходимым для этого оснащением. Существует ряд методов культивирования микроорганизмов, применяемых на лабораторном этапе разработки промышленного процесса, а затем ведутся в укрупненном масштабе в емкостях среднего размера (десятки литров) и, наконец,— в крупномасштабном варианте, в емкостях в сотни кубометров. Все методы культивиро­вания микроорганизмов делятся на периодические и непрерыв­ные.

Периодическое культивирование - начало изучения микробиологического синтеза. Изучение процесса микробного биосинтеза обычно начинается с исследования динамики роста периодической культуры. Цикл развития периодической культуры (не имеющей аналогии с цик­лом развития многоклеточного организма) начинается с засева среды. Засев осуществляется в таком количестве, которое обес­печивает начало роста микроорганизмов с минимальной задерж­кой или даже без лаг-фазы. Лаг-фаза мало дает для понимания хода биосинтеза, ее наличие свидетельствует только о недоста­точно хорошем качестве и количестве посевного материала или о неоптимальности условий для роста. Для многих микробиоло­гических процессов активный «омоложенный» посевной материал применяют в количестве около 2% от объема среды.

Прослеживают ход накопления биомассы и интересующего продукта, а также потребление исходного основного сырья, обычно углеродного. Для этого отбирают пробы развивающейся культуры с частотой, позволяющей уловить фазы экспоненциаль­ного роста, и заканчивают наблюдения после остановки роста (рис. 4.1) и накопления максимума целевого продукта. Получен­ные кривые роста и накопления продукта показывают, является ли его образование связанным с ростом биомассы, т. е. первичным, или это процесс второй фазы, когда рост заторможен, по вырос­шая биомасса может перерабатывать оставшийся недоисполь­зованным субстрат. Бывают, однако, случаи, когда интересую­щий продукт второй фазы начинает синтезироваться еще в фазу роста, так что подразделение процессов на одно- и двухфазные не носит абсолютного характера.

 

Рисунок 4.1 – Кривая роста микроорганизмов в полулогарифмическом масштабе: х – концентрация биомассы, I – лаг-фаза, II – фаза ускорения роста, III – экспотенциальная фаза, IV – фаза замедления роста, V – стационарная фаза,   VI – фаза отмирания

 

Наличие вторичных продуктов (метаболитов) в отличие от первич­ных в большинстве своем для жизни продуцента необязательно. Они об­разуются в том случае, когда состав среды таков, что для дальнейшего роста биомассы каких-либо компо­нентов начинает недоставать, но жи­вые клетки способны синтезировать некоторые вещества и в среде имеют­ся материалы для этого. Иногда вто­ричный биосинтез связан с видоиз­менением нормального роста клеток из-за лимитирования или ингибировапия. Среди вторичных продуктов встречаются искаженные вещества клеточной оболочки, предшественни­ки веществ, входящих в состав спор, производные аминокислот, пептидов, углеводов, нуклеотидов, а иногда их сложные комплексы. Типичными продуктами конструктивного метаболизма второй фазы роста культур являются антибиотики. Вторичными могут быть и продукты энергетического метаболиз­ма. Например, у некоторых бродильных микроорганизмов продук­тами первичного метаболизма углеводов часто являются органи­ческие кислоты, но при ингибировапии роста создающимися экстремально кислыми условиями среды вместо них образуются нейтральные вещества - спирты, кетоны, которые часто и являют­ся целевыми продуктами.

Во вторую фазу могут осуществляться и сверхсинтезы про­дуктов первой фазы роста культур, часто бесполезные в это вре­мя для самого продуцента. Состав среды может быть таким, что вещества, необходимые для нормального роста микроорга­низмов, исчерпываются, но имеются субстраты и активные ферменты, участвующие в синтезе тех или иных продуктов нормаль­ного метаболизма первой фазы. Такими являются, например, витамины.

Способность к сверхсинтезам продуктов второй фазы особен­но сильно выражена у специально полученных мутантов; послед­ние имеют изменения в генетическом аппарате, препятствующие нормальному метаболизму. В результате реакции отклоняются в сторону обильного накопления веществ, необходимых клетке лишь в небольшом количестве. Среди них встречаются практи­чески ценные продукты. Кроме генетического контроля вторично­го синтеза и сверхсинтеза огромное значение имеет физиологи­ческий контроль, или управление метаболизмом популяций.

Биохимические механизмы изменения метаболизма обусловлены репрессией и депрессией синтеза определенных ферментов или изменением их активности. Эти изменения часто в наиболь­шей степени выражены в среде, не оптимальной для роста, но оптимальной для биосинтеза определенного продукта. Для этого некоторые компоненты среды должны быть в недостатке, чтобы основное исходное сырье перерабатывалось биомассой в целевой продукт.

До недавнего времени лимитирующие рост факторы выявля­лись только путем эмпирического поиска и обнаруживались слу­чайно. Так установлено, что многие антибиотики, образуемые актиномицетами, синтезируются при лимитации роста проду­центов недостатком фосфата, для биосинтеза пенициллина требуется лимитация роста культур глюкозой, а для грамициди­на С — молекулярным кислородом. Целенаправленные поиски факторов, необходимых для каждого процесса, лимитирующего или ингибирующего рост продуцентов, значительно сокращают подбор оптимальных условий для их биосинтеза. После получе­ния заданного количества биомассы в условиях, оптимальных для роста культур, добавки элементов питания (кроме лимити­рующего), обеспечивающие синтез продукта, могут продлить его образование.

Большинство промышленных микробиологических процессов ведут на сложных средах, часто используя отходы других произ­водств или сельского хозяйства из-за их дешевизны. Естественно, что и в лабораторных условиях процесс отрабатывается на тех же средах. На сложных средах можно определить фазу наиболее активного биосинтеза целевого продукта, его скорость, продук­тивность процесса, выявить оптимальную температуру, рН, сте­пень аэрации. Для оптимизации роста микроорганизмов и полу­чения продуктов первой фазы этого достаточно. Но на сложных средах невозможно выявить лимитирующие рост культур компо­ненты питания: источники углерода, азота, фосфора, витамины и др., недостаток которых приводит к синтезу вторичных мета­болитов. Этот вопрос можно решить только на синтетических или полусинтетических средах. Если микроорганизмам необходимы витамины или аминокислоты, то их вносят в среду в небольших количествах, например, в виде автолизата или экстракта дрож­жей, содержащих почти все необходимые витамины и амино­кислоты. Если продуцент растет при небольших добавках дрож­жевого автолизата, например, в пределах 0,2 г/л и рост возмо­жен за счет потребления минеральных соединений азота (аммо­ния или нитрата), то автолизат можно рассматривать как источ­ник витаминов. Если же автолизат дрожжей требуется в боль­ших количествах, а минеральные соединения азота не исполь­зуются, то организм, следовательно, нуждается в готовых амино­кислотах и (или) других органических веществах.

Применяя набор синтетических сред с заранее предусмотрен­ным ограничением роста культур микроорганизмов известным компонентом, выявляют нужный для данного биосинтеза лимитирующий или ингибирующий фактор и нужные концентрации других компонентов, чтобы они не были в недостатке.

Если потребности микроорганизма неизвестны, то оптимиза­ция условий питания и понимание физиологии продуцента за­труднено. Полезно применение методов математического плани­рования экспериментов. Они ускоряют поиск оптимальных усло­вий, но не заменяют собой изучение физиологии питания про­дуцента для понимания его потребностей в условиях роста и биосинтеза целевых продуктов.

Непрерывное культивирование микроорганизмов. Метод проточного непрерывного культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Принцип проточного культивирования состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная сре­да и одновременно вытекает такой же объем культуры. По тако­му принципу организуются две разновидности процессов не­прерывного культивирования: процесс полного вытеснения и про­цесс полного смешения.

Непрерывные процессы имеют значительные преимущества перед периодическими: возможность специализации аппарату­ры для каждой операции (стадии) непрерывного процесса, стабилизации его во времени, улучшение качества продукта, легкость регулировки и, главное, возможность автоматизации. Этими преимуществами объясняется тенденция микробиологов к переходу от периодических процессов к непрерывным.

Процесс полного вытеснения. Сосуд для выращивания микроорганизмов (трубчатый фер­ментер) представляет собой трубку, расположенную горизонталь­но или вертикально, в которую втекают среда и посевной материал и вытекает культура (рис. 4.2). Перемешивания не производится. Так можно культивировать микроорганизмы, не требующие аэрации. С одного конца ферментера подаются среда и посевной материал, популяция находится в начале своего раз­вития. По ходу трубки культура «стареет», субстрат исчерпы­вается, накапливаются продукты ме­таболизма и вытекающая культура находится в состоянии, аналогичном стационарной фазе роста периодиче­ской культуры. Таким образом, в ферментере воспроизводится полная кривая роста, но не во времени, а в пространстве.

Рисунок 4.2 – Трубчатый ферментер полного вытеснения:

S0 – концентрация субстрата в поступающей среде, S – концентрация субстрата в вытекающей среде, X0 – начальная концентрация биомассы,

X – концентрация вытекающей биомассы

 

В настоящее время появились ферментационные аппараты, обеспе­чивающие процессы с режимом, приближающимся к полному вытесне­нию и при аэробном культивиро­вании. Это вращающиеся трубча­тые реакторы с насадкой или внут­ренними аэрирующими элемента­ми, а также многосекционные ко­лонные аппараты.

Процесс полного вытеснения применяется в промышленности в тех случаях, когда желательно из­бежать потери времени па опорож­нение, стерилизацию и заполнение емкости. Его применяют в пище­вой промышленности, когда ис­пользуются сложные среды и стоит задача наиболее экономично про­вести процесс, аналогичный тому, который ведется в периодиче­ском режиме.

Пример практического применения трубчатого ферментера — анаэробная стадия при производстве пива в башенных проточных емкостях. В этом случае не требуется аэрирования и процесс идет без перемешивания. Если этот процесс аэробный, то его ве­дут в батарее аэрируемых ферментеров (рис. 4.3). При этом кривая роста периодической культуры распределяется но ходу батареи.

Рисунок 4.3 – Рост микроорганизмов в батарее аэрируемых ферментеров

(I – III). Обозначения на рисунке 2

 

Процесс полного смешения. В процессе полного смешения рост культур происходит в емкости — ферментере при интенсивном перемешивании. Перемешивание достигается продуванием воздуха или работой мешал­ки (или тем и другим одновременно). Во всей массе культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. Этот метод культивирования получил название гомогенно-непрерывного. В ферментере создаются условия, соответствующие одной точке кривой роста культуры. При больших потоках среды эти условия близки к быстрому экспоненциальному росту, при малых -- приб­лижаются к условиям стационарной фазы роста культур. При таком методе может быть воспроизведена любая точка роста периодической культуры — от начала замедления роста после экспоненциальной фазы и до конца стадии замедления роста. В установившемся режиме скорость потока среды, отнесенная к единице объема культуры в ферментере, называется коэффи­циентом разбавления D. Она равняется удельной скорости роста µ. При этом культура находится в устойчивом стационарном состоянии (динамическое равновесие, D = µ) и обладает способностью самопроизвольно автоматически подстраиваться к изме­нениям условий.

Если условия изменятся таким образом, что рост ускорится, то в ферментере повысится концентрация биомассы (х) и пони­зится концентрация субстрата (s). Если рост замедлится, кон­центрация биомассы понизится, а остаточное содержание лими­тирующего рост субстрата повысится.

Если изменения условий временные, то при возвращении к исходным установится исходное стационарное состояние. На из­менения скорости потока культура реагирует соответствующим изменением концентрации биомассы и остаточной концентрации субстрата, ограничивающей рост, не выходя из стационарного состояния. При неизменности условий проточные культуры способны к полной воспроизводимости концентрации биомассы. Но при таком способе культивирования нельзя получить устойчивого состояния только при максимальной скорости роста. Повышение скорости потока или взаимодействие, замедляющее рост, при­водит к тому, что скорость роста (µ) окажется меньше коэффи­циента разбавления (D) и культура вымоется из ферментера. Воспроизведение в потоке определенной точки кривой роста культур широко применяется в промышленности при наращива­нии биомассы микроорганизмов. Хорошо отработанный периоди­ческий процесс выращивания экономически выгодно воспроиз­водить в проточном варианте, так как культура непрерывно находится в состоянии максимальной активности нужного про­цесса, не тратится время на освобождение, заполнение емкостей и на лаг-фазу.

При наращивании биомассы в проточных условиях процесс стремятся вести при возможно большей скорости потока, но не настолько большой, чтобы в среде оставался недоиспользован­ный субстрат. Ограничивающим фактором часто является ин­тенсивность аэрации. Из-за слабой растворимости молекулярного кислорода следует применять только такую концентрацию суб­страта, которая может быть использована при доступной для данной аппаратуры степени аэрирования. При необходимости переработать высокие концентрации субстрата применяется ба­тарея ферментеров, в каждом из которых успевает использовать­ся только его часть. Чем выше концентрация субстрата, тем больше ферментеров необходимо иметь в батарее. При всех про­цессах, связанных с фазой роста культур, считается целесообраз­ным применение проточного культивирования, как более эконо­мичного с технологической точки зрения.

Если периодический процесс идет без учета действия лимити­рующих и ингибирующих факторов, то эта неопределенность останется и при переводе его на непрерывный режим. При раз­ных скоростях потока рост культур может быть ограничен раз­ными факторами. Недостаток одного компонента питания при одной скорости роста может смениться недостатком другого ком­понента при другой скорости и притом без ведома эксперимен­татора. При наращивании биомассы на сложных средах иногда нет необходимости выявлять смену лимитирующих факторов при разных скоростях потока. Это возможно в тех случаях, когда хотят воспроизвести в проточных условиях хорошо отработанный периодический процесс.

Хемостатное культивирование. Хемостатное культивирование — это вариант гомогенного проточного культивирования с заданным желаемым коэффици­ентом разбавления (D), к которому подстраивается скорость рос­та культур (µ). Последняя может быть минимальной или близ­кой к максимальной. При этом задается также фактор, который обусловливает ограничение концентрации вырастающей био­массы. Концентрация биомассы определяется одним определен­ным компонентом питания. При низком коэффициенте разбавления лимитация, т. е. голодание, будет сильной, при высоком — слабой. То же наблюдается и в отношении отравления микро­организмов ингибиторами: при низком коэффициенте разбавле­ния клетки долго соприкасаются с ингибитором и бывают силь­но отравлены, при высоком они недолго пребывают в фермен­тере и отравлены в слабой степени. Однако при высокой скорости роста клетки могут быть более чувствительны к ингибитору.

Хемостатный метод культивирования незаменим в лаборатор­ных исследованиях физиологии микроорганизмов и клеток тка­ней. В промышленности он применяется при наращивании мик­робной биомассы, если известно, какой именно фактор ограни­чивает рост.

Варианты хемостатного культивирования. Хемостатный метод имеет большое количество вариантов. Одностадийное культивирование применяется при необходимости воспроизвести любую скорость роста культур, кроме максималь­ной. Двухстадийное культивирование в двух последовательных ферментерах позволяет наблюдать культуры при максимальной скорости роста и создать условия для ее превышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирование при D<µ_m, а во второй подается культура из первого и добавляется свежая сре­да (рис. 4.4). Во втором ферментере происходит повышение ско­рости протока вплоть до превышения µ_m, а вымывания не проис­ходит, так как из первого ферментера непрерывно поступает культура.

Рисунок 4.4 – Двухстадийный хемостат с дополнительной подачей во вторую стадию (А); двухстадийный хемостат (Б):

S₀ – концентрация субстрата в подаваемой среде, S₁ – в первом ферментере, S₂ – во втором ферментере, X₁ – концентрация клеток в первом ферментере, X₂ – во втором ферментере

 

Максимальная скорость роста может быть достигнута при турбидостаточиом методе регулирования, который является ва­риантом хемостатного, в этом случае скорость потока среды уста­навливается не экспериментатором, а автоматически, по сигналу датчика, регистрирующего концентрацию клеток. Для этого фер­ментер должен иметь устройство для нефелометрического изме­рения мутности, зависящей от концентрации клеток (х) и для регулирования скорости потока среды так, чтобы х оставалось постоянным. Этот метод культивирования позволяет поддержи­вать культуру в устойчивом состоянии па границе вымывания из ферментера, так как при снижении концентрации клеток пе­рестает подаваться среда. Турбидостат дает возможность изу­чать влияние внешних факторов па максимальную скорость роста культур и на состояние клеток при этом (рис. 4.5).

Рисунок 4.5 – Схема турбидостата. Подача среды осуществляется по «команде» нефелометра, измеряющего концентрацию клеток в контуре, по которому насосом прокачивается культура из ферментера:

S₀ – концентрация субстрата в подаваемой среде, S₁ – в первом ферментере, S₂ – концентрация субстрата в вытекающей культуре, X – концентрация клеток

 

Сигналом для подачи среды может быть не только плотность (мутность), но и любой параметр сре­ды, измеряемый электродом или дру­гим устройством, переводящим величи­ну измеряемого параметра в величину электрического потенциала. Последний усиливается и приводит в действие ра­боту насоса, подающего раствор или питательную среду. Для процессов культивирования, имеющих прямую связь между приростом биомассы и из­менением значения рН среды (напри­мер, при потреблении физиологически кислого соединения азота), использует­ся рН-статный способ управления ско­ростью потока среды. Скорость потока с помощью автоматических устройств уравнивается со скоростью измене­ния рН растущей популяцией, а следо­вательно, и со скоростью роста куль­тур. Это обеспечивает поддержание рН па заданном уровне, а скорость роста является максимальной в данных условиях. Изме­няя условия, можно проследить за соответствующими изменения­ми максимальной скорости роста культур.

В двухстадийиой системе можно воспроизвести во втором ферментере вторую фазу роста периодической культуры, свя­занную с синтезом вторичного продукта метаболизма. В первом ферментере ведется выращивание культуры при большой скорос­ти роста, что соответствует первой фазе периодической культуры. Второй ферментер берется большего размера или содержит боль­ше среды. Поэтому поступающая из первого ферментера куль­тура оказывается в условиях замедленного роста в такой степе­ни, в какой во втором ферментере содержится больше среды, чем в первом. Скорость роста во втором ферментере должна со­ответствовать скорости роста во второй фазе, оптимальной для синтеза вторичного продукта.

При низких концентрациях субстрата и при низкой концент­рации клеток можно возвратить в ферментер часть вытекающей из него биомассы; возврат повышает ее концентрацию и ускоря­ет процесс. Вариантов возврата биомассы может быть несколько. Сепарируют вытекающую культуру и сгущенную часть возвра­щают в ферментер. Устанавливают различные фильтрующие уст­ройства, позволяющие вытекать культуральной жидкости, но за­держивающие клетки. Известны и другие методы культивиро­вания:

1.    Отъемно-доливной метод. Среда подается в проточный ферментер порциями. Отъем культуры также производится пор­циями или происходит постоянный слив. Кривая концентрации клеток приобретает вид гребенки.

2.    В практике стерильного наращивания патогенных бактерий для получения вакцин применяют многократное выращивание без стерилизации перед каждым циклом. Из ферментера после окон­чания цикла роста сливается не вся культура (небольшая часть остается). К ней добавляется стерильная среда и цикл наращи­вания повторяется. Так ведут несколько циклов.

3. Продленная периодическая культура, или метод подпитки. К периодической культуре добавляются компоненты питания — обычно соединение углерода по мере его исчерпания. Культура не страдает от избытка соединения углерода в начале роста, что неизбежно в обычной периодической культуре, и сразу начинает быстрый рост, который идет с постоянной скоростью до полного исчерпания всех компонентов питания.

Другой способ продления роста —- это диализ. Культивиро­вание ведут в гильзе, не проницаемой для клеток, но пропускаю­щей растворенные вещества. Гильза с культурой погружена в питательную среду, которая может быть проточной. Из среды поступают компоненты питания и в нее же выносятся продукты метаболизма. Таким путем получают сильно концентрированную биомассу.

Основные методы культивирования микроорганизмов пред­ставлены на схеме (рис. 4.6).

 

Рисунок 4.6 – Основные методы культивирования микроорганизмов

 

 

Стадии разработки биотехнологичесого производства - лабораторный регламент (подбор штаммов, субстратов, условий культивирования, конструкции биореактора, способов выделения и оценки качества конечного продукта, технологическая схема), опытно-промышленное испытание (масштабирование в условиях полупромышленных производств), промышленное производство (масштабирование) 

Все биотехнологические производства по их направленности делятся на две группы. Первая преследует цель получения мак­симально возможных количеств биомассы, а вторая - максимум выхода продуктов жизнедеятельности клеток (метаболитов). В первом случае - это могут быть живые клетки (например, хлебопекарные дрожжи), био­масса нежизнеспособных клеток как источник кормового белка, витами­нов, споры с токсинами (препараты для защиты растений от вредителей). Во втором - органические кислоты, ферменты, аминокислоты, антибиоти­ки. При этом клетки продуцента являются отходом производства, тре­бующим утилизации.

Несмотря на различные цели, общая схема биотехнологического производства в обоих случаях может быть представлена в виде пяти основных стадий:

- подготовка питательной среды для культивирования промышленного микроорганизма;

- получение чистой культуры для внесения в основной аппарат - фермен­тер;

- основная ферментация;

- выделение и очистка конечного продукта;

- получение товарных форм препарата.

Постановка задачи масштабирования.Изучение процессов ферментации в лабораторных условиях происходит сначала в колбах, затем в ферментерах лабораторного масштаба объемом 1 — 10 л, далее происходит испытание в опыт­ных установках объемом 50, 100, 1000 л и более. Объемы промыш­ленных установок зависят от вида продукта и от потребности в нем. Обычно речь идет уже о десятках кубометров — 10, 20, 50, 60, 100, отдельные аппараты имеют объемы свыше 1000 м³ (для полу­чения кормовых дрожжей).

Обычно в аппаратах разного масштаба используют одинаковые микроорганизмы и одинаковый состав питательных сред. Можно было бы ожидать, что в пересчете на единицу объема — литр, ку­бометр, миллилитр — количество получаемого продукта (биомас­сы или продуктов метаболизма) будет одинаковым или почти оди­наковым в аппаратах разного масштаба.

Действительность, однако, не оправдывает таких прогнозов. Наоборот, очень часто в аппаратах разного масштаба и конструк­ции результаты процесса различаются, иногда в несколько раз.

В связи с этим в производственной практике возникает пробле­ма масштабирования.

Масштабирование — это воспроизведение результатов, полу­ченных на оборудовании одного размера (или одной конструк­ции), при проведении того же процесса в аппаратах другого (обычно большего) размера или другой конструкции.

Обиходный пример масштабирования дан в книге Джонатана Свифта «Путешествия Гулливера». Гулливер оказался пленником лилипутов, и у них возникла проблема кормления Гулливера. Их специалистами по масштабированию был разработан критерий масштабного перехода: Гулливеру давали 1728 лилипутских пор­ций. Происхождение этой цифры таково. Гулливер был в 12 раз крупнее (т. е. выше ростом), чем лилипут. Очевидно, что масса и объем Гулливера и лилипута соотносились как 123: 1 = 1728.

Масштабирование оказалось удачным: Гулливер совершал мно­жество всяких подвигов и в конце концов освободился от плена.

Другой пример не столь удачен, хотя по существу использовал­ся тот же принцип масштабирования — по массе. Биологическая лаборатория в США проводила испытание действия препарата ЛСД на различных животных. Как обычно принято при испыта­нии лекарственных средств, сначала испытания проводят на мел­ких животных (мышах, крысах, кошках, кроликах), а затем пере­носят их на крупных животных и даже на человека; при подборе дозировки исходят из массы тела. Испытав препарат ЛСД на кош­ках, назначили дозировку для слона с учетом их разницы в весе в 30 000 раз. Результат оказался отличным от ожидаемого: слон за­шатался и упал замертво, свидетельствуя тем самым, что проблема масштабирования не столь однозначна, как кажется.

Вернемся теперь к нашему процессу — процессу ферментации. Соотношение массы культуральной жидкости, например, в колбе (100 мл) и в производственном аппарате объемом 63 м³ (объем жидкости 45 м³) равно 450 000 : 1 — даже больше соотношения кошка: слон. Между тем именно с таким соотношением реально приходится работать, если не хочется осложнять себе жизнь и тра­тить время и деньги на испытания в большом ряду аппаратов про­межуточных емкостей.

Подход к масштабированию на основе концентрации растворенного кислорода. Основные предпосылки. Поскольку ход процесса определяется микроорганизмами, различия в ходе ферментации в аппаратах разного масштаба и конструкции следует искать в микроокруже­нии микробных клеток. Концентрации питательных веществ, продуктов метаболизма, температура и рН вряд ли зависят от мас­штаба. Более естественным выглядит предположение о различии в концентрациях растворенного кислорода С.

Аэробные микроорганизмы не могут развиваться в отсутствие кислорода. Однако растворимость кислорода воздуха в воде очень невелика — 7 мг/л при 20°С. Если жидкость (или среду) полностью насытить кислородом воздуха, а затем прекратить аэрацию, то мно­гие промышленные культуры микроорганизмов «съедают» этот запас за 5—10 с. Поэтому требуется непрерывная подача воздуха в аппарат.

Надо заметить, что растворимость кислорода зависит еще и от давления воздуха, а вернее, от парциального давления кислорода в газовой фазе. Если, например, повысить давление воздуха в 2 раза, то и концентрация растворенного кислорода при насыщении жид­кости воздухом также повысится в 2 раза. Если вместо воздуха для насыщения среды использовать чистый кислород, то концентрация растворенного кислорода возрастет почти в 5 раз — пропорцио­нально парциальному давлению кислорода в воздухе и газообраз­ном кислороде: (100 %) / (21 %) — 4,8. Этот показатель — концентрацию растворенного кислорода — можно измерять с помощью специального датчика растворенного кислорода. Это очень важный прибор для процессов ферментации, хотя в обычных системах контроля и автоматизации химических производств он используется довольно редко.

Профили изменения концентрации растворенного кислорода во времени. Концентрации растворенного кислорода, которые мы ука­зывали ранее, — это концентрации в равновесном состоянии, при насыщении. В реальном процессе происходит непрерывное по­требление растворенного кислорода из жидкости и одновременно его непрерывное растворение — массопередача из пузырей воздуха. Надо иметь в виду важную особенность микробиологических процессов. Микроорганизмы не способны потреблять кислород напрямую из газовых пузырей. Они потребляют лишь растворен­ный кислород, т. е. кислород переходит в клетку микроорганизма через две ступени: массопередача из газа в жидкость и затем по­требление уже растворенного кислорода из жидкости.

Чтобы повлиять на концентрацию растворенного кислорода в жидкости, необходимо изменить либо скорость продувания возду­ха через аппарат, либо частоту вращения мешалки в аппарате; либо давление в нем.

Мы можем наблюдать за ходом изменения концентрации ра­створенного кислорода непрерывно в течение всей ферментации. Обычный ход кривой C(t) представлен на рисунке  4.7.

Рисунок 4.7 – типичный профиль изменения концентрации растворенного кислорода во времени в ходе периодической ферментации

 

Эта кривая (профиль во времени) отражает разные потребнос­ти кислорода в разные периоды ферментации и, соответственно, баланс между подводом кислорода и его потреблением.

Можно, конечно, меняя скорость подачи воздуха и частоту вращения мешалки, поддерживать профиль во времени, напри­мер, в большом аппарате таким же, как в малом.

А можно вспомнить о том, что кислород, как и другие субстраты, влияет на процесс обычно по кривой с насыщением (рис. 4.8). Тогда в ходе процесса достаточно поддерживать величину OQp. Обычно зависимость выхода за весь процесс ферментации (Р или X) от поддерживаемой концентра­ции растворенного кислорода имеет вид графика, представленного на рисунке  4.9.

 

Рисунок 4.8 – Влияние концентрации растворенного кислорода на удельную скорость биосинтеза целевого продукта

 

 

Рисунок 4.9 – Влияние концентрации растворенного кислорода на выход продукта или биомассы микроорганизмов

 

Повышение концентрации раство­ренного кислорода выше некоторой ве­личины Скр не ухудшает процесс, но из экономических соображений удобно держать концентрацию поменьше. При высоких концентрациях в аппарат пода­ется больше воздуха, больше скорость вращения мешалки, иногда приходится увеличивать давление и даже добавлять в воздух кислород.

Есть процессы, хотя их и немного, в которых повышение концентрации растворенного кислорода хуже не просто из-за перерасхода воздуха и энергии, но также и из-за снижения выхода (показано пунктиром на рисунке 4.9).

Так в общем выглядит способ масштабирования процесса пу­тем поддержания профиля растворенного кислорода во времени.

Проблема в том, что обслуживание датчика и прибора для изме­рения растворенного кислорода — довольно хлопотное дело, и часто на заводах их либо нет, либо отказываются от их регулярной эксплу­атации.

Связь концентрации растворенного кислорода с условиями массопередачи. Как бы сделать так, чтобы этот профиль в аппарате большего масштаба выдерживался сам собой? Какую характерис­тику нужно поддерживать одинаковой в сравниваемых аппаратах, чтобы одинаковым был и кислородный профиль?

Для ответа на этот вопрос рассмотрим основное уравнение массопередачи кислорода в ферментере        

 

Qo₂ = K_La (C* - C),                                               (4.1)

                                                            

 

где Qo₂— скорость потребления кислорода единицей объема среды (кинетический параметр, аналогичный Qs для не газообразного субстрата); K_La — объемный ко­эффициент массопередачи по кислороду; С* — концентрация растворенного кис­лорода при насыщении; С — текущая концентрация растворенного кислорода.

Уравнение показывает, что в текущий момент времени ско­рость потребления кислорода равна его скорости растворения в жидкости из газового потока.

Интересно, что коэффициент K_La включает в себя площадь межфазной поверхности, поэтому его размерность включает в себя единицу объема.

Размерность Qo₂ :

 

Размерность С и С:

Отсюда получается размерность для величины K_La:

 

Из уравнения (1) легко получить выражение для текущей концентрации растворенного кислорода С:

                                                  (4.2)

Если в ходе процесса скорость потребления кислорода Qo₂, из­меняется во времени, то изменяется и концентрация растворенно­го кислорода, что и дает наблюдаемый профиль во времени.

Если мы имеем два разных аппарата, в которые загружена одна и та же культуральная жидкость, имеющая одну и ту же скорость потребления кислорода на единицу объема, то концентрация ра­створенного кислорода в таких аппаратах зависит только от коэф­фициента массопередачи K_La.

Отсюда вытекает второй способ масштабирования — по вели­чине K_La.

Если обеспечить равенство значений K_La в сравниваемых аппа­ратах, то можно ожидать, что при этом автоматически обеспечива­ется и равенство профилей концентраций растворенного кислоро­да во времени.

Кроме того, если K_La, например, недостаточен (мал), то мы не сможем поддержать требуемое значение Сопт в течение всего про­цесса (рис. 4.10).

 

Рисунок 4.10 – Влияние коэффициента массопередачи K_La на профиль по времени растворенного кислорода в процессе ферментации:

1 – для процесса с минимальным значением K_La;

2 – для процессов с промежуточным значением K_La;

3- для процесса с максимальным значением K_La

 

Профили растворенного кислорода при различных значениях K_La (которые можно задать разной частотой вращения мешалки, разными ее размерами и конструкцией, разной скоростью аэра­ции) должны различаться.

Можно по результатам такой ферментации построить зависи­мость выхода от величины K_La (рис. 4.11).

Рисунок 4.11 – Зависимость выхода продукта от величины K_La:

K_La_опт – значение K_La, оптимальное для реализации процесса

 

Хотя здесь за K_La скрывается профиль C(t) в ходе ферментации, выход продукта в зависимости от K_La аналогичен зависимости от С: либо с насыщением (с плато в области высоких K_La), либо с эк­стремумом (оптимальным диапазоном K_La) — в зависимости от процесса. В обоих случаях можно выбрать значение или диапазон значений K_La, которые должны поддерживаться в аппаратах лю­бой конструкции и размера, чтобы получить желаемый результат.

Методы определения K_La в аппаратах различного масштаба. Да­лее при масштабировании возникает проблема реализации необ­ходимого значения K_La в аппаратах любого типа и размера.

Для этого и нужны формулы, связывающие величину KLa с размерами мешалки, аппарата, числом ярусов, частотой враще­ния, скоростью подачи воздуха на аэрацию. Подобные формулы для различного вида аппаратов можно найти в специальной ли­тературе.

Например, для аппаратов с мешалкой

                                 (4.3)

где α и δ — коэффициенты; n_i — число ярусов мешалки; N — мощность, расходу­емая на перемешивание жидкости; F_B — расход воздуха; S — поперечное сечение аппарата (равное πD²/4).

Как определить влияние ве­личины K_La на результат про­цесса при проведении опытов в колбах?

Прежде всего, можно ме­нять частоту встряхиваний ка­чалки (устройства для встряхи­вания колб). На рисунке 4.12 представлена зависимость величины K_La от частоты качаний для двух типов колб — обычных полых колб и колб с отбойниками.

 

-

Рисунок 4.12 – Влияние частоты качаний качалки на величину K_La

при проведении опытов в колбе

 

Отбойники различной конструкции вставляются в колбы для создания сопротивления движению потока и улучшения условий перемешивания и массопередачи. Колбы с отбойниками позволя­ют моделировать аппараты высокой интенсивности.

Довольно часто устройства для встряхивания колб (качалки) не имеют приспособлений для регулирования скорости. В этом слу­чае можно использовать для создания различных значений K_La прием, заключающийся в проведении экспериментов с различны­ми объемами жидкости в колбе. На рисунке 4.13 представлена зависи­мость коэффициента K_La от объема жидкости в колбе.

Рисунок 4.13 – Влияние объема жидкости в колбе V на величину K_La

 

В микробиологической практике используют колбы разного объема и разной конструкции. Даже при их постоянной степени заполнения величина K_La зависит от объема сосуда.

На рисунке 4.14 представлен характер изменения величины K_La в колбах разной вместимости при их заполнении на 1/10 объема.

 

Рисунок 4.14 – Влияние объема колбы на величину K_La

 

Графики позволяют приблизительно оценить величину K_La для колб разного объема с разной степенью заполнения и с разной ча­стотой качаний.

Практически же при решении реальных задач масштабирова­ния с использованием колб целесообразно провести соответству­ющие эксперименты по сульфитной методике, в которой скорость массопередачи кислорода определяют по скорости реакции окис­ления сульфита в сульфат.

Другие критерии масштабного перехода.Хотя использование величины K_La в качестве критерия масш­табного перехода наиболее обоснованно, в практике часто исполь­зуют более простые критерии масштабного перехода, связанные с величиной K_La, но являющиеся, так сказать, его «суррогатами».

Такими критериями являются удельная мощность, фиктивная линейная скорость газа, удельный объемный расход воздуха.

Удельная мощность Nyд, расходуемая на перемешивание жидко­сти в аппарате, равна:

Nуд = N/V                                                           (4.4)

Мы видим, что величина N/V входит в формулу (4.3) для опре­деления K_La, хотя в формуле есть и другие члены. Отсюда вытека­ет, что масштабирование по удельной мощности перемешивания оказывается удачным для аппаратов, не слишком различающихся своей конструкцией и масштабом. Поскольку измерение или рас­чет удельной мощности выполнить просто, этот показатель до­вольно популярен. Однако из формулы (4.3) видно, что он очень уязвим из-за пренебрежения интенсивностью аэрации: получает­ся, что удельная мощность может быть реализована даже без аэра­ции, только перемешиванием; величина же K_La при этом падает очень сильно. Конечно, это крайний случай, никто не предпола­гает отключения аэрации. Но пренебрежение ее величиной и раз­личными значениями коэффициентов α и δ в формуле приводит к изменению связи K_La и Nyд и к неправильному масштабированию.

Фиктивная линейная скорость газа, также присутствующая в приведенной выше формуле для расчета K_La, равна:

F_S = F_B/S                                                        (4.5).

По поводу этого параметра можно высказать те же предостере­жения, что и по величине Nyд. Здесь получается, что K_La, наобо­рот, не зависит от того, производится ли механическое перемеши­вание.

Удельный объемный расход воздуха равен:

Fуд = F_B/V,                                                     (4.6)

где V — объем жидкости в аппарате.

Здесь в прямом виде реализуется метод Джонатана Свифта («ме­тод Гулливера»). В некоторых формулах для K_La используют Fyд вместо F_S. Но ограничения для использования Fyд вместо K_La те же.

Движущая сила массообмена по кислороду. Когда мы рассматри­вали формулу для определения концентрации растворенного кисло­рода (4.2), то намеренно не акцентировали внимание на равновес­ной концентрации кислорода при насыщении С*, приняв эту ве­личину одинаковой для любых масштабируемых аппаратов.

Реально же в производственных аппаратах величина С зависит от давления в аппарате Р и гидростатического давления столба жидкости в нем Hρg.

Тогда равновесная концентрация кислорода в производствен­ном аппарате Спр будет отличаться от С* в лабораторном аппара­те, даже если равны давления над зеркалом жидкости. Связь меж­ду ними имеет вид

                                           (4.7)

где Рпр и Рл - давление над зеркалом жидкости в производственном и лаборатор­ном аппаратах соответственно; Н — высота слоя жидкости в производственном аппарате; р — плотность жидкости; g — ускорение свободного падения.

В этой формуле принято, что среднее давление Рпр в производ­ственном аппарате больше давления в лабораторном аппарате Рл на величину давления половины высоты гидростатического столба жидкости в нижней точке аппарата.

Таким образом, для выравнивания условий по массопередаче кислорода в лабораторном аппарате необходимо поддерживать давление в нем Рл в соответствии с зависимостью

                                                           (4.8)

Концентрация растворенного диоксида углерода. В некоторых процессах ферментации на результат процесса влияет не только кислород, но и растворенный диоксид углерода. Теоретически необходимой скорости массопередачи кислорода Qo₂ можно до­стичь, сильно увеличив перемешивание и подняв давление в ап­парате. При этом можно значительно уменьшить расход воздуха. Так иногда поступают, чтобы уменьшить пенообразование, ко­торое сильно зависит от расхода подаваемого воздуха. В этом случае, однако, сильно возрастет концентрация СО₂ в выходя­щем газе, а с ней и концентрация растворенного диоксида угле­рода, который может ингибировать процесс. Для некоторых про­цессов известны критические значения концентрации СО₂ в газе (С^Гсо₂) и в жидкости (С^Жсо₂), выше которых наблюдается ингибирование процесса ферментации. Для таких процессов при масш­табировании необходимо учитывать ограничение по концентра­ции СО₂. Если известна интенсивность дыхания на единицу объема Q^Гco₂ и на весь объем аппарата Gco₂

 

Gco₂ = VQco₂                                                (4.9)

 

то концентрацию СO₂ в выходящем газе С^Гсо₂ можно определить по формуле:

 

С^Гсо₂ = Qco₂ V/F_B ,                                                    (4.10)

 

где F_B -— общий объемный расход воздуха через аппарат.

Поскольку для таких процессов должно соблюдаться соотношение:

 

С^Гсо₂ ≤ С^Гсо_{2 кр}                                                                                              (4.11)

 

отсюда можно получить ограничение для расхода воздуха:

 

F_B ≥ Qco_{2 max} V/ С^Гсо_{2 кр}                                                                          (4.12)

 

где Qco_2max — максимальная интенсивность дыхания в процессе ферментации; С^Гсо_2кр — критическое значение концентрации СО₂ в выходящем из ферментера воздухе.

Ограничение (4.12) показывает, что в процессах, где есть ингибирование роста и развития культуры повышенными кон­центрациями диоксида углерода, нельзя снижать расход воздуха до сколь угодно малого значения.

Механическое воздействие мешалки на клетки. Усилия сдвига, действующие у краев мешалки, отбойников, могут механически воздействовать на клетки микроорганизмов, вызывая их разру­шение. Различные клетки по-разному реагируют на одно и то же воздействие. Бактерии, имеющие небольшие размеры (0,5 ... 1 мкм), практически нечувствительны к механическим воз­действиям. Более чувствительны мицелиальные микроорганизмы и в особенности растительные и животные клетки, для которых перемешивание должно быть особенно мягким.

Экспериментально оценить механическое воздействие переме­шивающих устройств разного типа на микробные клетки доволь­но трудно. На практике обычно проводят экспозицию исследуе­мой культуры клеток в течение определенного времени в изучае­мом аппарате, затем отбирают пробу жидкости и осуществляют прямой рассев ее на агаризованные среды, где определяют содер­жание живых клеток по сравнению с контролем.

Более быстрым способом является определение изменения оп­тической плотности жидкости при длине волны 260 нм за время перемешивания в аппарате (ΔЕ₂₆₀). Это изменение показывает сте­пень выхода в раствор содержимого клетки.

Такой способ, однако, трудно применить в аппарате большого размера.

Практически для оценки механического воздействия на клетки используют показатель, называемый окружной скоростью мешалки v_Л:

 

v_Л = πnd_М,                                                       (4.13)

 

где п — частота (угловая скорость) вращения мешалки, об/с; d_M — диаметр мешал­ки, м.

Обычно окружная скорость мешалки составляет 3—6 м/с. Превышение величины 8 м/с приводит к явлениям кавитации и воздействию на микробные клетки. Для мицелиальных, расти­тельных и животных клеток ограничения по скорости могут быть еще больше: они индивидуальны для разных клеток и мо­гут достигать 0,5 м/с. В аппаратах, предназначаемых специаль­но для культивирования животных клеток, используют весьма низкие окружные скорости мешалок и к тому же стараются со­здавать рабочие органы мешалок с обтекаемыми поверхностями без острых кромок.

Масштабирование «снизу вверх» и «сверху вниз». Обычно осуществляют масштабирование «снизу вверх». Результат, полученный в лабораторных условиях, переносят на аппарат большего размера, стараясь воспроизвести в этом аппарате все те критерии, которые выбраны для масштабирования. В мировой литературе такое мас­штабирование обозначают термином «Scale-up».

Это не всегда приводит к успешным результатам, поскольку обычно в промышленном аппарате невозможно создать условия гидродинамики и массопередачи, идентичные условиям в аппара­тах малого масштаба.

При этом рекорды производительности, полученные в колбах, оказываются нереалистичными и служат только для победных от­четов научных работников перед производством.

Более реально использовать масштабирование «сверху вниз» («Scale-down»).

При этом сразу ориентируются на те промышленные аппараты, которые есть в производстве. Эти аппараты изучают с учетом массообменных характеристик и других критериев масштабирования и уже лабораторные условия подгоняют под критерии, имеющие­ся в производственных аппаратах.

Соответственно и в колбах процесс изучают сразу при нужном значении K_La (т. е. при определенном объеме среды). И хотя на такой установке обычно результаты хуже по технико-экономичес­ким показателям, чем можно было бы получить, стремясь выжать максимум из лабораторного оборудования, все же так работать выгоднее, поскольку менее вероятно возникновение трудностей при переходе на промышленное оборудование.

Полученные результаты без большого труда переносятся на промышленные аппараты. Конечные показатели технологическо­го процесса в производстве при этом не хуже, а часто и лучше, чем при масштабировании типа «Scale-up».

 

Характеристика этапов

Хотя для получения продуктов микробиологического синтеза применяются различные культуры микроорганизмов и исполь­зуются разные питательные среды и режимы культивирования, тем не менее процессы синтеза имеют общую структуру. Это вид­но из приведенной ниже схемы:

 

 

Приготовление и сте­рилизация питательной среды. Для выращива­ния микроорганизмов в цехе чистой культуры и в цехе основной фер­ментации необходима стерильная питатель­ная среда. Это делают в сырьевом или рецеп­турном цехе. Среду го­товят по периодическо­му или непрерывному методу. В отдельных случаях приготовление и стерилизация среды осуществляются прямо в ферментаторе. На со­временных микробио­логических предприя­тиях все чаще исполь­зуют непрерывный метод приготовления среды (рис. 4.15). Для этого используют два резервуара: в один вводят исходные вещества, а из другого жид­кость идет в смеситель непрерывного действия. Из него среда при помощи насоса подается в колонну стерилизации и на выдержи­вание, а затем — в охладитель.

Рисунок 4.15 – Схема непрерывного приготовления питательной среды:

1 и 2 – резервуары для растворения исходных веществ, 3 – резервуар для смешивания растворов, 4 – насос для передачи среды, 5 – колонна или инжектор для нагрева среды паром, 6 – закрытый сосуд для стерилизации, 7 – охладитель, 8 – резервуар для спуска нагретой воды, 9 – ферментор

 

Выбор аппаратуры и технологии приготовления питательной среды зависит от количества и вида компонентов. Компоненты растворяют в подогретой или горячей воде. Если с точки зрения совместимости и стерилизации это возможно, то все они могут быть растворены в одном реакторе. В противном случае компо­ненты растворяют по группам и затем соединяют в смесителе. Ес­ли среду стерилизуют периодически паром или при помощи теп­лообменника, надо довести весь объем питательной среды до 120°С и после этого по меньшей мере час выдержать при 120— 124°С. Затем среду охлаждают до 29—30°С.

При непрерывной стерилизации нагревание среды до темпе­ратуры стерилизации, выдерживание при этой температуре и ох­лаждение происходят в потоке. Прямая подача пара в среду раз­бавляет ее на 10—20%, это надо учитывать при приготовлении среды. При работе с колонками используют пар давлением 0,5 МПа (5 кгс/см2). Скорость потока среды в колонке зависит от состава и температуры.

В кожух выдерживателя вводят пар давлением 0,25 МПа (2,5 кгс/см2). Длительность выдерживания (5—7 мин) зависит от состава и свойств питательной среды. Температура среды, выте­кающей из выдерживателя, 124—130°С.

Приготавливая среду, надо следить, чтобы в процессе стери­лизации не происходили нежелательные реакций (карамелизация, образование меланоидинов). Если в цехах чистой культуры и ос­новной ферментации работают с разными средами, то необходимо иметь две и более линий для приготовления питательных сред. В цехе приготовления среды необходимо иметь различную изме­рительную аппаратуру (весы, мерную посуду, дозаторы), аппара­туру для растворения вискозных и твердых веществ, снабженную мешалками (обычные реакторы), центрифуги для осветления рас­творов (кларификаторы), устройства для декантации и др.

Хранение культуры и размножение посевного материала в ла­боратории. Культуры микроорганизмов — продуцентов веществ— заводы получают из институтов (коллекции культур) в пробир­ках на косом агаре или в ампулах, законсервированными в виде чистых культур. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, физиологии, характеристики среды для культивирования и хранения культуры.

При длительном хранении культуры важно сохранить ее свой­ства. При частом пересеве она со временем может изменять свой­ства — уменьшается продуктивность, появляется гетерогенность культуры, — т. е. различные варианты культуры с отличающей­ся морфологией и физиологией.

В гомогенности или гетерогенности культуры можно убедить­ся, высевая ее на твердую питательную среду и изучая морфоло­гические и физиологические свойства колоний.

Чтобы сохранить свойства культуры без изменений, ее надо хранить в соответствующих условиях. В основе хранения культур лежит охлаждение, замораживание или обезвоживание.

Во всех этих случаях ограничивается или даже прекращается клеточный обмен веществ. Иногда (при замораживании и обезво­живании) клетки приводят в состояние анабиоза или преданабиоза.

На практике культуры хранят различными способами;

– на косом агаре при низкой температуре (1 - 5°С) можно хранить культуру 1—2 мес, а иногда и дольше;

– замораживание и хранение при температуре ниже —20°С позволяет сохранить культуру в течение нескольких месяцев. Не желательно многократное оттаивание и замораживание;

– на твердых средах под слоем стерильного парафина или минерального масла можно хранить дрожжи, плесневые грибы. Менее пригоден этот способ для хранения актиномицетов. Слой масла над поверхностью косого агара должен быть не менее 1 см. Масло предохраняет культуру от высыхания и доступа кислоро­да;

– на агаре без добавления питательных веществ (допускают­ся очень незначительные добавки питательных веществ) хранят актиномицеты;

– при лиофилизации культуру замораживают при температу­ре до —80°С (обычно при —30°С) и подвергают сублимации в ва­кууме (остаточное давление 6—130 кПа). Для предохранения клеток от инактивации используют защитные среды (сыворотка крови, бульон, сахароза, смесь песка и глины и др.). Лиофилизированную чистую культуру в ампулах хранят в течение несколь­ких лет;

– хранение в стерильной смеси песка и глины заключается в следующем. Нанесенные на эту смесь микроорганизмы или сус­пензию спор сушат при комнатной температуре и при такой же температуре хранят в посуде, закрытой ватной пробкой;

– консервация спор (актиномицеты) в песке. Около 1,0 г сте­рильного песка насыпают в пробирку, высевают туда же споры и сушат их в эксикаторе над силикагелем или хлористым кальцием. После сушки пробирки герметично закрывают пробками и зали­вают парафином.

Через определенное время, специфичное для каждого вида хранения, культуру пересевают.

Перед началом технологического процесса культуру размно­жают в лаборатории в стерильных условиях при оптимальном составе среды и режиме выращивания (рН, температура, дли­тельность). С поверхности косого агара культуру стерильно пере­носят в колбы объемом 100—200 мл и инкубируют в термостате или на качалке в зависимости от потребности культуры в кислороде. В производстве дрожжей для этого используют, например, колбы Пастера (0,45 л), затем колбы Карлсберга (4,5 л). Дли­тельность каждой стадии выращивания 24 ч. На этом этапе дрож­жи растут на полноценной среде — 10%-ном солодовом сусле. Содержимое колб Карлсберга используют в качестве посевного материала для первого инокулятора цеха чистой культуры. Однако последовательность стадий не всегда одинакова. В производ­стве аминокислот, например лизина, в цех чистой культуры по­ступает посевной материал, полученный из колб на качалке.

Иногда для уменьшения опасности заражения инфекцией в инокулятор культуру вносят прямо из пробирок. При этом дли­тельность инокуляции увеличивается.

В производстве антибиотиков часто используют споровый ма­териал. При этом в лабораторных условиях культуру размножа­ют двумя способами:

– культуру продуцента высевают на косой агар, инкубируют до образования спор и смывают их стерильной водой. Суспензию спор снова переносят в свежую агаризированную среду для полу­чения спорового материала второго поколения. Выросшие споры еще раз смывают стерильной водой и суспензию используют для получения первого вегетативного поколения продуцента на жид­кой среде;

– как и в первом случае, культуру продуцента высевают на агаризованную среду для получения спор. Полученную суспен­зию спор сразу же вносят в колбы с жидкой средой и выращива­ют их на качалке. Полученный таким образом вегетативный ма­териал продуцента первого поколения используют в качестве по­севного материала для второго поколения продуцента в колбах с жидкой средой. Вегетативный материал второго поколения ис­пользуют для внесения в инокулятор. Для размножения спорово­го материала широко используют среды на сыпучем материале— зерне, крупе, лузге и др.

Для получения спор многих продуцентов антибиотиков часто используют среду из зерен проса. Споровый материал с таких сред можно засевать прямо в инокулятор, минуя размножение на жидкой среде в колбах. Иногда в лабораторной практике культу­ру продуцента начинают размножать сразу на жидкой среде в колбах, исключая предварительное получение спор.

Для обеспечения стабильного выхода активных веществ в производственных условиях надо создать достаточный запас куль­туры продуцента на длительный период времени (год и более), но нельзя часто менять технологию приготовления посевного ма­териала.

Получение посевного материала в цехе чистой культуры.Дальнейшее размножение посевного материала обычно идет в две стадии: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции. Аппа­раты первой стадии часто называют инокуляторами, аппараты второй стадии — посевными ферментаторами.

Схема приготовления посевного материала из споровых культур на предприятиях по производству антибиотиков показа­на на рисунке 4.16.

Рисунок 4.16 – Схема приготовления посевного материала:

1 – законсервированный штамм продуцента, 2 – первое поколение на косом агаре в пробирке с образованием спор, 3 – второе поколение на твердой среде в колбах с образованием спор, 3а и 3б – первое и второе поколение на жидкой среде в колбах, 4 – инокулятор, 5 – посевной ферментатор, 6 – ферментатор

 

Для приготовления посевного материала используют полно­ценную среду, тщательно проверенную различными химическими и микробиологическими методами. Количество питательной сре­ды в аппарате не должно превышать 60% общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема среды. Такое не­большое количество посевного материала требует длительного периода инокуляции (2—4 сут). Для посевных ферментаторов ис­пользуют 10—12% инокулята, поэтому продолжительность при­готовления посевного материала на этой стадии уменьшается и обычно не превышает 1 сут. Во время приготовления посевного материала надо следить, чтобы в аппаратах был оптимальный режим культивирования. Три раза в сутки отбирают образцы для микробиологического и биохимического анализов. Посевной ма­териал для главной ферментации готовят в количестве 5—20% объема используемой питательной среды.

Главная ферментация. Обычно она протекает в ферментато­рах большого объема. Для стерильной ферментации ши­роко используют аппараты объемом 50м³ с механическими мешал­ками. Перед заполнением аппарата средой его моют, проверяют на герметичность, стерилизуют горячим паром как сам ферментатор, так и систему трубопроводов. Для обеспечения стериль­ности ферментатора часто применяют предварительную обработку его химическими дезинфицирующими веществами (этот процесс проводят непосредственно перед обработкой горячим па­ром). После этого его заполняют стерильной охлажденной пита­тельной средой. Количество среды в ферментаторе не должно превышать 70% его общего объема. Затем по линии посевного материала с помощью стерильного воздуха в ферментатор вво­дят посевной материал. Уже перед его подачей температура и рН питательной среды должны быть доведены до оптимальных зна­чений для данной культуры. Соответственно регулируют интен­сивность аэрации и перемешивания среды. Для предотвращения попадания нестерильного атмосферного воздуха в аппарат давле­ние воздуха над поверхностью жидкости повышают на 20— 30 кПа (0,2—0,3 кгс/см2). В пространстве над жидкостью обыч­но скапливается пена. Если ее слой сильно увеличивается, то в аппарат вводятся химические пеногасители. Во время фермента­ции автоматически регулируется температура и рН среды, в слу­чае необходимости добавляют растворы кислоты или щелочи. По специальному графику берут образцы жидкости из ферментатора для биохимического и микробиологического контроля. При полу­чении активных веществ методом периодической ферментации различают два этапа.

На первом этапе идет интенсивное размножение культуры. Она проходит через все характерные фазы развития. На этом эта­пе компоненты питательной среды используются главным обра­зом на получение энергии и конструктивный обмен веществ — происходит постепенная ассимиляция источников углерода и азотсодержащих веществ, в среде накапливаются продукты окис­ления углеводов, например кислоты.

На втором этапе происходит интенсивный синтез нужного ме­таболита (иногда он идет параллельно процессу роста культуры), наблюдается старение клеток и их автолиз.

Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается мак­симальное количество полезного продукта. Конец ферментации можно определить и микробиологически по морфологическим из­менениям клеток продуцента. Окончив ферментацию, культуральную жидкость охлаждают до 10—15°С и перекачивают в резер­вуары, из которых она постепенно подается на дальнейшую обработку.

Выделение продукта из культуральной жидкости. В состав культуральной жидкости входят остатки использованной пита­тельной среды, синтезированные метаболиты и клеточная масса продуцента. В наиболее простом случае всю культуральную жид­кость можно использовать как готовый продукт, например при получении бактериальных удобрений, если их применяют в жид­ком виде. В спиртовой промышленности амилолитические ферменты плесневых грибов иногда используют в жидком виде. При производстве витаминных и аминокислотных концентратов для нужд животноводства иногда используются все продукты фер­ментации. В таких случаях культуральную жидкость упаривают в вакуум-аппаратах и сушат в сушилках распылительного типа.

В производстве дрожжей, бактериальных удобрений и средств для защиты растений полезным продуктом является клеточная масса микроорганизмов.

Для выделения биомассы используют сепараторы, осадительные центрифуги, фнльтр-прессы, вакуум-фильтры или отстойни­ки. Иногда биомассу осаждают добавлением электролитов (FеС1₃), надосадочную жидкость декантируют. После центрифу­гирования биомассу получают в виде густой жидкости или пасты 75—90%-ной влажности. Клеточную массу промывают, фильтру­ют, сушат, гидролизуют, экстрагируют из нее нужный продукт и т. д. Если активное вещество находится в растворе, то биомассу используют после отделения как побочный продукт, а нужное ве­щество выделяют из раствора различными химическими или фи­зическими методами:

– отгонка спиртов и органических растворителей;

– осаждение кислот в виде солей;

– выделение аминокислот с помощью ионитов, с последую­щей элюцией, упариванием элюата и кристаллизацией;

– антибиотики выделяют, осаждая в виде малорастворимых солей из водного раствора, где они предварительно максимально концентрируются путем экстракции или ионообменным путем, а также высушивая водные растворы лиофилизацией или в сушил­ках распылительного типа.

Допустимо производство нескольких препаратов микробного происхождения на одном предприятии и даже в одном цехе толь­ко в том случае, если они не являются антагонистами. Надо из­бегать соседства с производством культур, образующих споры, если продуцент основного вещества является бесспоровым мик­роорганизмом. При организации производства надо изолировать отдел обработки сухой активной биомассы во избежание ее рас­пространения в виде пыли. На предприятиях микробиологическо­го синтеза можно обеспечить высокие экономические показатели и выпуск продукции высокого качества только прн наличии от­личных санитарных условий и высокой культуры производства. Регулярная чистка аппаратуры и коммуникаций, стерилизация, светлые тона окраски стен и аппаратуры, гладкие поверхности, кондиционированный воздух, безукоризненно чистая спецодежда рабочих — таким должно быть современное предприятие микро­биологического синтеза.

 

 

Контрольные задания для СРС  

1. Виды биореакторов.

2. Периодическое и непрерывное культивирование (хемостат, турбидостат, оксистат).

---

Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 419; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!