Тема: ШВИДКІСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНИХ РЕАКЦІЙ. одиниці активності ферментів.
Актуальність теми: Знання кінетики ферментативних процесів має важливе значення для розуміння принципів застосування ензимів у клінічній практиці.
Навчальні цілі:
Знати:залежність швидкості ферментативних процесів від температури, рН середовища, концентрації ферменту і субстрату.
Вміти: провести дослідження активності аспартатамінотрансферази і трактувати одержані дані.
Самостійна позааудиторна робота
В зошитах для протоколів:
1. намалюйте графіки залежності швидкості ферментативної реакції від концентрації ферменту і субстрату.
2. підготуйте вихідні дані для оформлення протоколу лабораторної роботи „Визначення активності аспартатамінотрансферази”.
Контрольні питання
- Кінетика ферментативних реакцій.
- Оптимальні умови для визначення активності ферментів.
- Методи визначення та вираження активності ферментів.
Самостійна аудиторна робота
Дайте відповідь на поставлені запитання
1 Як залежність швидкість ферментативних реакцій від:
а) концентрації ферменту,
б) концентрації субстрату,
в) температури,
г) рН середовища.
2.Виконати лабораторну роботу „Визначення активності аспартатамінотрансферази” і захистити протокол.
Принцип методу. В результаті переамінування під дією аспартатамінотрансферази (АсАТ) аспарагінова кислота перетворюється в щавелевооцтову (ЩОК). ЩОК здатна в процесі ферментативної реакції перетворюватися в піровиноградну кислоту (ПВК). При додаванні кислого 2,4-динітрофенілгідразину (2,4-ДФГ) ферментативний процес зупиняється і утворюється динітрофенілгідразин піровиноградної кислоти, який в лужному середовищі дає коричнево-червоне забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості утвореної ПВК. Таким чином, по кількості утвореної ПВК можна судити про активність ферменту. Активність амінотрансфераз виражають в мікромолях ПВК, утвореної 1 мл сироватки крові за 1 годину інкубації при температурі 37оС. В нормі активність АсАТ сироватки крові становить 0,1-0,45 мкмоль/год х мл.
|
|
Хід роботи.
В дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 0,5 мл субстратної суміші для визначення АсАТ і ставлять в термостат при 37оС на 5 хвилин. Потім в дослідну пробірку додають 0,1 мл сироватки крові, а в контрольну - 0,1 мл води і 0,5 мл р-ну 2,4-ДФГ. Ставлять обидві пробірки в термостат на 60 хвилин при температурі 37оС. Виймають пробірки, додають в дослідну пробу 0,5 мл розчину 2,4-ДФГ і залишають при кімнатній температурі на 20 хвилин. Далі додають по 5 мл 0,4 н розчину NаОН в кожну пробірку, ретельно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хв для розвитку забарвлення. Оптичну густину вимірюють на ФЕКу в кюветі на 10 мм при зеленому світлофільтрі (500-560 нм) проти контролю.
|
|
Розрахунок активності ферменту виконують по приготовленому заздалегідь калібрувальному графіку (за допомогою стандартного розчину ПВК). Активність виражають в умовних одиницях з розрахунку на 1 мл сироватки. 1 одиниця АсАТ відповідає такій активності ферменту, яка здатна за даних умов утворювати 1 мкг ПВК. При обчисленні ферменту необхідно врахувати і розведення сироватки:
Х = А х 10, де
Х – одиниця активності ферменту;
10 - перерахунок на 1 мл;
А - кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг.
У сироватці крові здорових людей активність АсАТ, визначена при допомозі даного методу, коливається від 8 до 40 од. Перерахунок активності ферменту в мікромолі ПВК, що утворилася при інкубації 1 мл сироватки протягом 1 години при 37оС, проводять за формулою:
А х 10
АсАТ = --------- , де
88
А – кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг;
88 - маса 1 мкмоль ПВК, мкг;
10 - коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки.
Література
1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – 736с.
|
|
2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744с.
Обговорено і затверджено на засіданні кафедри, протокол №1 від 28.08.2008р.
Зав. кафедрою проф. Ерстенюк А.М.
Заняття №6
Тема: активатори та інгібітори ферментів.
Актуальність теми: Знання впливу модуляторів на активність ферментів необхідні для розуміння регуляції метаболічних процесів в організмі людини.
Навчальні цілі:
Знати:механізми дії активаторів та інгібіторів.
Вміти:визначати вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини і трактувати одержані дані.
Дата добавления: 2018-05-12; просмотров: 206; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!