Основные методы иммуноферментного анализа.
- конкурентные на твердой фазе, суть которых заключается в том, чтозаданное количество антител конкурентно взаимодействует сосмесью неизвестного количества измеряемого вещества ипостоянного количества этого же вещества, связанного с какой-либометкой. После завершения иммунохимической реакции измеряютколичество метки, связанной с антителами, используякалибровочные графики.
- иммунометрические по принципу «сэндвич»-анализ, когда натвердой фазе иммобилизуют избыток антител, с которыми проводят инкубацию антигена. После удаления несвязавшихся компонентов (антигена) в систему добавляют избыток меченых антител, которыевзаимодействуют с антигеном. Чувствительность и точность этогометода выше, чем конкурентных методом. Для сокращения временианализа и повышения избирательности детекции антигенаиспользуют моноклональные антитела, так как они весьмаспецифичны.
- кинетические, принципы те же, но делают измерения вкинетическомрежиме для ускорения анализа с использованием программногоуправления. Это позволяет повысить чувствительность и точностьанализа.
Применение ИФА.
1. В диагностике микробных и вирусных возбудителей.
2. В диагностике неинфекционных болезней (диабет, рак, сердечно-сосудистые заболевания.
3. Для контроля (мониторинга) лекарственной терапии (различныхпсихотропных лекарственных препаратов, препаратов, влияющих насердечно-сосудистую систему и других)
|
|
|
4. Для выявления отравления наркотиками, для выявления допинговыхпрепаратов в организме человека
5. В контроле технологических процессов, в определении качествабиотехнологической продукции в микробиологических производствах:
5.1.Для быстрого выявления высокоэффективных микроорганизмов –продуцентов ферментов, антибиотиков и других веществ
5.2.Для контроля наличия посторонних микроорганизмов ибактериофагов в ферментерах
5.3.Для определения степени загрязненности воздуха
5.4.Для обнаружения в донорской крови вируса гепатита В
5.5.Для определения белковых примесей в препарате инсулина.
Помимо медицинской практики методы иммуноферментного анализаприменяются в ветеринарии и сельском хозяйстве, особенно врастениеводстве.
Иммунобиотехнологические препараты
Вакцины вводятся в организм для профилактики. При такой прививкеактивизируется иммунная система, вырабатываются антитела лимфоцитнымиклетками, которые сохраняют в памяти эту способность и при повторномпопадании этого же антигена образуют комплекс антиген-антитело, который всвою очередь узнается организмом и утилизируется.Вакцина для профилактики полиомиелита представляет поливалентныйпрепарат из трех ослабленных штаммов вируса полиомиелита.В тоже время половина из всех применяемых в настоящее время вакцинотносится к живым вакцинам разного происхождения.Это живые вакцины бактерийного происхождения, применяемые дляпрофилактики сибирской язвы, чумы, туберкулеза и др.Это живые вакцины вирусного происхождения, применяемые для профилактикиоспы, кори, гриппа, краснухи, полиомиелита и др.
|
|
|
Неживые вакцины используются для профилактики
а. бактерийных инфекций, таких как:коклюш, дизентерия, холера, брюшной тиф, сыпной тиф.
б. вирусных инфекций:герпес.
Примеры анатоксинов:дифтерийный, столбнячный, газовой гангрены, бутулимический.
Классификация вакцин может быть представлена и по виду лекарственнойформы:
- иньекционные (жидкие)
-пероральные (таблетки, капсулы, драже)
- ингаляционные (аэрозоли).
Вакцины
Классификация вакцин в соответствии с природой специфического антигена:
• живые
• неживые
• комбинированные.
Рассмотрим более подробно каждую из них.
3.1.Живые вакцины получают:
а) из естественных штаммов микроорганизмов с ослабленнойвирулентностью для человека, но содержащий полный набор антигенов(в качестве примера можно привести вирус оспы).
|
|
|
б) из искусственных ослабленных штаммов.
в) часть вакцин получают генноинженерным способом. Для получениятаких вакцин используют штамм, несущий ген чужеродного антигена,например, вирус оспы со встроенным антигеном гепатита В.
3.2.Неживые вакцины– это:
а) молекулярные и химические вакцины. При этом молекулярные вакциныконструируют на основе специфического антигена, который находится вмолекулярном виде. Эти вакцины могут быть получены и путем химическогосинтеза или биосинтеза. Примерами молекулярных вакцин являютсяанатоксины. Анатоксины – это бактериальный экзотоксин, потерявшийтоксичность в результате длительного воздействия формалина, но сохранившийантигенные свойства. Это дифтерийный токсин, столбнячный токсин,бутулинический токсин.
б) корпускулярные вакцины, которые получают из целой микробнойклетки, которая инактивизирована температурой, ультрафиолетовым облучениемили химическими методами, например, спиртом.
3.3.Комбинированные вакцины.Они комбинируются из отдельных вакцин,превращаясь при этом в поливакцины, которые способны иммунизироватьсразу от нескольких инфекций. В качестве примера можно назвать поливакцинуАКДС, содержащую дифтерийный и столбнячный анатоксины и коклюшныекорпускулярные антигены. Эта вакцина, как известно, широко применяется вдетской практике.
|
|
|
3.4.Рассмотрим подробнее токсины с точки зрения их, как продуктовжизнедеятельности микроорганизмов.
1 группа токсинов – это экзотоксины:экзотоксины – это белковые вещества, выделяемые клетками бактерий вовнешнюю среду. Они в значительной степени определяют болезнетворностьмикроорганизмов. Экзотоксины в своем строении имеют два центра. Один изних фиксирует молекулу токсина на соответствующем клеточном рецепторе,второй – токсический фрагмент – проникает внутрь клетки, где блокируетжизненно важные метаболические реакции. Экзотоксины могут бытьтермолабильны или термостабильны. Известно, что под действием формалинаони теряют токсичность, но сохраняют при этом иммуногенные свойства –такие токсины называются анатоксинами.
2 группа токсинов – это эндотоксины. Эндотоксины являются структурнымикомпонентами бактерий, представляя липополисахариды клеточной стенкграмотрицательных бактерий. Эндотоксины менее токсичны, разрушаются принагревании до 60-800 С в течении 20 минут. Эндотоксины выходят из клеткибактерий при ее разложении. При введении в организм эндотоксины вызываютиммунный ответ. Получают сыворотку путем иммунизации животных чистымэндотоксином. Однако эндотоксины относительно слабый иммуноген исыворотка не может обладать высокой антитоксической активностью.
Получение вакцин
1. вакцины живые
1.1.живые бактерийные вакцины. Этот тип вакцин получается наиболеепросто. В ферментере выращиваются чистые ослабленные культуры.Существует 4 основных стадии получения живых бактерийных вакцин:
- выращивание
- стабилизация
- стандартизация
- лиофильное высушивание.
В этих случаях штаммы продуцентов выращиваются на жидкойпитательной среде в ферментере вместимостью до 1-2 м3.
1.2. живые вирусные вакцины. В этом случае вакцины получают путемкультивирования штамма в курином эмбрионе или в культурах животныхклеток.
2. молекулярные вакцины. Чтобы иметь представление об этом типевакцин, надо знать, что в этом случае из микробной массы выделяютспецифический антиген или экзотоксины. Их очищают, концентрируют.Затем токсины обезвреживают и получают анатоксины. Очень важно, чтоспецифический антиген может быть также получен путем химического илибиохимического синтеза.
3. корпускулярные вакцины. Их можно получить из микробных клеток,которые предварительно культивируют в ферментере. Затем микробныеклетки инактивируют температурой, или ультрафиолетовым облучением(УФ), или химическими веществами (фенолами или спиртом).
Сыворотки
Применение сывороток
1. Сыворотки широко используются в случаях профилактики и лечения
инфекционных заболеваний.
2. Сыворотки также используются при отравлении ядами микробов илиживотных – при столбняке, ботулизме дифтерии (для инактивацииэкзотоксинов), применяются сыворотки и от яда кобры, гадюки и др.
3. Сыворотки могут быть использованы и для диагностических целей, длясоздания различных диагностических наборов (например в тестах наопределение беременности). В этом случае антитела используются вреакциях образования комплексов с антигенами (антиген (АГ) – антитело(АТ), когда происходит подтверждение наличия соответствующихантигенов, что может быть использовано в различных реакциях.
Профилактическое или лечебное действие сывороток основано насодержащихся в сыворотке антителах (АТ).
Для массового получения сыворотки вакцинируют ослов, лошадей. Введениетакой сыворотки дает образование пассивного иммунитета, то есть организмполучает готовые антитела. Сыворотки, которые получают путем иммунизацииживотных должны быть на контроле по такому показателю, как титр антител уживотных, чтобы брать у них кровь в период максимального содержанияантител. Из крови животных выделяют плазму крови, затем из плазмы удаляютфибрин и получают сыворотку. Это один способ получения сыворотки.
Другой способ получения сыворотки – это из культивируемых животныхклеток. Однако главной проблемой в этом случае является обеспечениестабильного роста животных клеток. Дело в том, что клетки животных,изолированные из среды организма, часто не делятся in vitro. Для полученияположительного результата в этом случае при переносе клеток из организманадо иметь в виду следующие условия этого переноса и его последствия:
1. Нужные нам клетки должны:
• преобладать в культуре,
• быстро адаптироваться к новым условиям,
• быстро расти.
Кроме того:
• должна быть полная стерильность при культивировании,
• питательные среды должны быть стерильными и при ихизготовлении должна быть использована только стерильная вода
2. При росте клеток in vitro, с ними происходят перемены, то есть они:
• теряют способность к дифференциации,
• дегенерируют (перерождаются)
• трансформируются
Все эти перемены происходят с клетками животных вследствие их старения,старения самой архитектуры клеток. Если клеточная популяция сможетподдерживаться в гистологической дифференцированной форме, то онисохраняют свою специализацию.
Нормальные живые клетки растут только на поверхности – это так называемыесубстрат зависимые клетки, монослойная культура. Клетки могут расти толькодо полного закрытия поверхности и если поверхности нет, то клетки не растут.
В этом случае появляется проблема создания достаточной поверхности для ростаклеток. Клетки могут выдерживать не более 50 удвоений, затем они умирают отстарости.
Задача роста клеток – этот процесс еще называют пролиферацией – связан сувеличением биомассы за счет того, что число клеток умножается на среднююмассу клеток.
Рост клеток может быть достигнут двумя путями:
• за счет увеличения средней массы – это называется гипертрофия
• за счет увеличения числа клеток – это называется гиперплазия.
Клетки животных обычно в своей массе не увеличиваются, так как их массаудерживается в определенных пределах за счет регуляторных процессов,поэтому, когда говорят о росте животных клеток, то при этом подразумеваюттолько увеличение их числа.
В организме взрослого человека имеется 1014 клеток и в организме человекаежесекундно происходит 20 делений клеток.
В организме человека имеется система регуляции деления клеток,представляющая собой комбинированный импульс, поступающий, как сигнал, отгормонов желез внутренней секреции и продуктов метаболизма. Если этасистема контроля над ростом клеток будет нарушена, то развивается опухоль.
Одной из особенностью многоклеточных животных является степеньспециализации функций различных клеток тканей и органов, что определяетсяпонятием дифференциации. Таким образом, клетки животных по мере ростазародыша становятся все более специализированными. Это ведет к образованиюиндивидуальных тканей с вполне конкретными функциями.
Существуют три проблемы роста животных клеток:
1. генетическая нестабильность
2. непостоянство генетических экспрессий
3. старение.
При выращивании животных клеток приходится постоянно отбирать клеткидля консервирования.
В процессе развития клеток можно проводить трансформацию – этоизменение ростовых свойств культивируемых клеток, что являетсяпроцессом необратимым и включает генетические изменения этих клеток.
Изменение ростовых свойств клеток является одним из адаптационныхпроцессов, который позволяет размножаться им в неблагоприятных условиях.Благодаря трансформации клетки получают возможность расти in vitro в видесуспензии до высокой плотности популяции этих клеток, что связано спонижением потребности в факторах роста. Трансформация позволяет растиклеткам в условиях, где отношение площади и объема менее благоприятно, чему нормальных клеток, потому что у трансформированных клеток уже нетсубстратной зависимости и геометрический фактор роста не имеет значения.
Что касается старения клетки, то этот показатель является ограничениемпотенциала деления (всего 50 делений). Если добиться повышеннойспособности к росту клетки, то это значит, что трансформация преобладает надстарением.
Причины старения сводятся к двум моментам:
1. постепенное накопление трансформационных ошибок в следствии вредныхвлияний мутаций, когда происходит старение и гибель клетки,
2. генетическая запрограммированность смерти.
В самом процессе биотехнологического культивирования используют,получая после неоднократных пересевов, клеточную линию диплоидныхклеток, соблюдая определенную плотность популяции ( часть клетокконсервируют).
В качестве материала для культивирования можно использовать почкиобезьян, почки собак, почки кроликов, куриный эмбрион (возраст -14 дней),клетки легких эмбриона человека (возраст -16 недель). Понятно, что чеммоложе материал, тем дольше культивируется клетка.
Весьма важным является и процесс консервирования, как средствосохранения нужного генома и посевного материала клеток с определеннымвременем роста (сохраняют молодые клетки, являющиеся резервным фондомпопуляции).
Особенностью животных клеток является то, что они не способнывыдерживать лиофилизации и их консервируют только в жидком азоте притемпературе минус 1960 С. При такой температуре клетки полностьюстабильны. Для замораживания используют стеклянные ампулы определенныхразмеров, например, на1 миллилитр (мл).
Однако в процессе замораживания могут происходить вредные процессы. Это:
1. образование кристаллического льда в клетке
2. обезвоживание
3. повышение концентрации растворенных веществ.
Возникновение этих вредных процессов во многом зависит от скоростизамораживания. Существуют определенные правила замораживания,которые сводятся к следующему:
- нужно использовать ампулы только небольших размеров (на 1 мл),
- необходимо внесение криопротекторов (такие, как полиэтиленгликоль (ПЭГ),поливинилпропил (ПВП), диметилсульфацил).
- скорость замораживания должна быть одинаковой внутри ампулы и около еестенки, например,лейкоциты охлаждают со скоростью 0,5 -20 в минуту,фибробласты – 1 -30 в минуту,клетки эпителия – 2 -100 в минуту.
Восстановление жизненных функций также проводится с определеннойскоростью.
Очень важным является и представление о составе питательной среды длякультивирования животных клеток. Прежде всего, это 13 незаменимыхL- аминокислот с определенной концентрацией их содержания в среде,например, аргинин 0,6 ммоль/л,цистеин 0,1 ммоль/л,изолейцин 0,4 ммоль/л,глутамин 2,0 ммоль/л и так далее.
Затем обязательным является и присутствиебелков,липидов (из сыворотки),углеводов,витаминов (всего 8),источников углерода (глюкоза 5,5 ммоль/л),сыворотки крови – 5-10% по объему,незаменимых жирных кислоты (линолевая, арахидоновая, линоленовая),предшественников простагландинов,неорганических ионов (натрия хлорид (NaCl), калия хлорид (KCI), кальцияхлорид (CaCI2) и т. д.,микроэлементов (железо, медь, кобальт, цинк, селен и т д. (всего 15).
И, наконец, проблемы стерилизации.
• стерилизация среды осуществляется мембранным фильтрованием, средуготовят на дистиллированной, стерилизованной воде,
• стерилизация оборудования происходит острым паром или химическимспособом (если это пластмассовые детали).
Режим культивирования осуществляется при определенной температуре, обычнопри 370С.
Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 516; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!