Разработка технологии культивирования штамма-продуцента инсулина.

ПРИЛОЖЕНИЕ (Российский инсулин)

В 2003 году в мире было продано препаратов инсулина человека на сумму 5340 миллионов долларов. В Российской Федерации объем рынка препаратов инсулина оценивается в 150-200 миллионов $ и до недавнего времени практически весь он был занят фармацевтическими фирмами Запада. Такая ситуация является угрозой национальной безопасности России, поскольку ставит ее в полную зависимость от иностранных государств и транснациональных компаний.

Поэтому актуальной задачей является разработка технологии промышленного производства в Российской Федерации отечественного инсулина и лекарственных форм на ее основе. В связи с этим, 15 мая 2000 г. было подписано Соглашение между Правительством Москвы, Российской академией наук и ИБХ РАН о сотрудничестве в области создания производства генно-инженерного инсулина человека. В ходе реализации этого соглашения на базе Опытного биотехнологического производства (ОБП) ИБХ РАН было создано пилотное производство полного цикла лекарственных препаратов генно-инженерного инсулина человека (ГИЧ). С 2003 г. осуществляется выпуск субстанции и готовых форм ГИЧ ИНСУРАН^® 40 МЕ/мл, а с 2005 г. – ИНСУРАН^® 100 МЕ/мл в количестве, составляющем 14% рынка инсулиновых препаратов в г. Москве.

Создание технологии получения субстанции инсулина человека.

Основные этапы исследований, положенных в основу технологии производства инсулина, включали: 1) создание штамма-продуцента инсулина; 2) создание технологии получения субстанции ГИЧ; 3) масштабирование процесса и создание опытно-промышленного производства активной фармацевтической субстанции (АФС) инсулина; 4) разработка методов контроля качества и создание стандарта качества (фармакопейной статьи предприятия).

Технологический процесс производства субстанции ГИЧ в ИБХ РАН основан на следующей схеме:

1. Получение посевного материала штамма-продуцента(оживление консервированной культуры; выращивание маточной культуры; выращивание инокулята).

2. Биосинтез рекомбинантного белка (РБ)(выращивание продуцента в ферментере (ферментация); получение биомассы (сепарирование); дезинтеграция клеточной суспензии; выделение и отмывка телец включения (центрифугирование)).

3. Выделение и очистка РБ(солюбилизация телец включения и восстановление РБ белка; ренатурация и последующая хроматографическая очистка РБ).

Ферментативное расщепление РБ.

Хроматографическая очистка инсулина.

Получение кристаллов ГИЧ.

Создание штамма-продуцента инсулина человека.

Перед началом исследований по разработке технологии получения инсулина в распоряжении исследователей был созданный в ИБХ РАН штамм-продуцент E.coli JM109pPINS07, для создания которого была использована рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07 с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), кодирующая рекомбинантный белок (РБ), в котором последовательность иммуноглобулин-G-связывающего домена В белка А St. aureus соединена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека.

Штамм JM109pPINS07 исходно использовался при разработке процесса получения инсулина. Созданная на его основе технология позволяла получить ГИЧ фармакопейного качества с приемлемым выходом, но продуктивность штамма и эффективность очистки все еще оставалась недостаточно высокой. В ходе многочисленных экспериментов исследователями был создан новый штамм E. coli BL07 – продуцент гибридного полипептида с последовательностью проинсулина человека путем трансформации клеток E. coli BL21 плазмидой pPINS07 с помощью электропорации.

Полученный штамм E. coli BL21/pLP-3-1, названный E.coli BL07 обладал значительными преимуществами перед штаммами-продуцентами использованными ранее. Это, в частности, возрастание внутриклеточного содержания рекомбинантного препроинсулина человека как следствие инактивации в плазмиде некоторых генов, кодирующих бактериальные белки. Кроме того, в клетках нового штамма отсутствовали продукты деградации предшественника инсулина, затрудняющие его очистку.

Разработка технологии культивирования штамма-продуцента инсулина.

Изучение процесса культивирования продуцента позволило разработать технологию, состоящую из ниже описанных стадий.

1.2.1. Приготовление посевного материала.

Эталонную (музейную) культуру штамма-продуцента дважды последовательно высевали на агаризованной питательной среде. Отобранные клоны проверяли на продуктивность РБ методом электрофореза на полиакриламидном геле. Уровень накопления гибридного белка должен быть не менее 30% от суммы всех белков клетки. Далее для выращивания маточной культуры в колбу с жидкой питательной средой вносили несколько типичных колоний рабочей культуры и выдерживали при +37^оС. Готовая маточная культура имела оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 7,5 оптическим единицам (ОЕ); рН 5,1 и типичную морфологию клеток при отсутствии посторонней микрофлоры. Инокулят, получаемый из маточной культуры, имел оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 4,3 ОЕ; рН 6,1 и был использован на стадии биосинтеза.

1.2.2. Биосинтез РБ.

Выращивание штамма-продуцента проводили в биореакторе (ферментере) объемом 200 л, содержащем питательную стерильную среду. В ферментер засевали инокулят и проводили биосинтез при температуре +37^оС, рН 7,0, рО₂ - 55% от насыщения и давлении в аппарате 0,25 атм. Температуру, рН, давление в аппарате поддерживали автоматически. При достижении необходимой оптической плотности культуральной жидкости культуру непрерывно подпитывали раствором глюкозы. В ходе культивирования в ферментер вносили раствор ампициллина и проводили индукцию синтеза рекомбинантного белка изопропил-β-D-тиогалактозидом (ИПТГ). Через 4-5 ч. После добавления индуктора процесс останавливали. Общее время культивирования составляло 12-13 ч.

Съем сырой биомассы с 1 л культуральной жидкости – 55 г, содержание влаги – около 70%, содержание рекомбинантного белка в клетках биомассы – 25-30 %[*].

1.2.3. Получение биомассы.

Культуральную жидкость центрифугировали с помощью проточной центрифуги. Средний съем сырой биомассы – 11 кг, влажность - 72%, содержание РБ в биомассе – 27-30%.

1.2.4. Разрушение клеток и выделение телец включения.

Подготовленную суспензию клеточной биомассы разрушали на проточном дезинтеграторе при повышенном давлении в 600 атм. за 3-4 цикла дезинтеграции. Разрушение клеток контролировали по накоплению растворимого белка, степень разрушения клеток оценивали визуально с помощью микроскопа. Степень разрушения клеток составляла 90-95%. Дезинтегрированную суспензию клеток далее подавали на вращающийся ротор проточной центрифуги. Скорость подачи не более 1 л/мин. Вес влажного осадка телец включения (ТВ), содержащих рекомбинантный белок, составлял около 3 кг (15 г/л КЖ), содержание влаги около 80%, содержание РБ около 50%.

Дата добавления: 2018-04-15; просмотров: 1317; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

12 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!