Ферменты, используемые как лекарственные средства. Протеолитические ферменты. Амилолитические, липолитические ферменты. Проблемы стандартизации целевых продуктов
Nbsp; 1.Стерилизация ферментационного оборудования. "Слабые точки" внутри стерилизуемых емкостей. Очистка и стерилизация технологического воздуха. Схема подготовки потока воздуха, подаваемого в ферментатор. Предварительная очистка. Стерилизующая фильтрация. Коэффициент проскока. Значение асептики в биотехнологических процессах Асептика (от греч. А - не, нет, sepsis - гниение) - это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду (объект) посторонних микроорганизмов, включая болезнетворные. Следовательно, асептика в биологической технологии и, например, в хирургии - это не одно и то же понятие. В первом случае предполагают использование какого-либо биообъекта (в том числе - микроба) и полное исключение попадания других микроорганизмов, являющихся загрязнителями. Во втором случае стремятся исключить любую возможность попадания патогенных микробов на операционное поле или в рану. Каждый из материальных потоков в биотехнологических процессах - потенциальный источник микробов - контаминантов. Асептика может включать влажную уборку помещений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного воздуха в боксированных помещениях, поступление в ферметатор стерильного воздуха через барботер - от франц. Bаrbotage - перемешивание) и пр. Следовательно, комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов, включает механическую, физическую, химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости - и конечный продукт. К механической защите относятся удаление механических примесей, например, из воздуха, культиваторов, герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений. К физической защите относятся обработка воздуха и поверхностей приборов и аппаратов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком. К химической защите относится обработка поверхностей химическими антисептиками. В производственных условиях источниками микробов-контаминантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из почвы в сферу биотехнологических процессов попадают спорообразующие палочки-бациллы, конидии грибов, актиномицеты. Эти же микроорганизмы с пылью могут попасть в воздух, через посредство которого они способны проникнуть в среду выращивания биообъекта или в конечный продукт производства. Качественный состав и размеры частиц в воздушной пыли колеблются в широких пределах. В производственных помещениях это зависит от конструкционных особенностей здания, розы ветров, географической зоны расположения города и предприятия, наличия или отсутствия потоков автомобильного и другого транспорта, количества непосредственно занятых в технологическом процессе людей, характера и локализации складских помещений и т.д. Образующиеся пыль и капельки влаги в воздухе, как правило, содержат на своей поверхности слой адсорбированного воздуха и большее или меньшее количество микроорганизмов. Газовая оболочка предохраняет частицы от смачивания. Такие частицы представляют собой дисперсную фазу аэрозоля, устойчивость которой зависит от размеров (величины) частиц, их электрического заряда и поверхностей энергии. Необходимо помнить, что в случае нахождения на частицах аэрозоля микробных клеток, то их отрицательный электрический заряд будет приносить свою долю в общий заряд частицы. Опираясь лишь на величину аэрозоля, содержащего микроорганизмы, можно выделить три фазы его: крупноядерную (диаметр частиц более 100 мкм), мелкоядерную (диаметр частиц менее 100 мкм) и фазу бактериальной пыли (диаметр частиц от 1 мкм до 100 мкм). Частицы крупноядерноя фазы в течение нескольких секунд оседают из воздуха, тогда как частицы двух других фаз могут длительно находиться в воздухе, образуя устойчивую коллоидную систему. Бактериальная пыль может формироваться из первых двух фаз после их высыхания и повторного попадания в воздух. В разряд частиц с диаметром от 0,001 мкм до 1 мкм подпадают вирусы и некоторые бактерии. Аэрозоли могут быть вредными и для человека не только из-за микробов, находящихся на частицах пыли или капельках жидкости, но и сами по себе вследствие проникновения в альвеолы дыхательной системы с последующим расстройством ее функций. В таком понимании вредными являются аэрозольные частицы асбеста, алебастра, абразивного порошка, графита, гипса, диоксида титана, дорожной пыли, извести, каолина, корунда, карбида кремния, мрамора, оксида олова, стекловолокна и др. В альвеолы проникают частицы размером менее 3 мкм при скорости потока вдыхаемого воздуха уже около 1 см/с. По степени загрязненности воздуха микробами и механическими частицами в расчете на 1м3 производственные помещения, в которых асептически изготавливают лекарственные средства, классифицируют по классности следующим образом: 1-й класс чистоты с ламинарным потоком стерильного воздуха - для изготовления стерильных лекарств - не должно быть микробов, а механических частиц размером до 0,5 мкм - не более 3500; 2-й класс чистоты - до 50 микробных клеток, до 2500 частиц размером 5 мкм и до 350000 частиц размером 0.5 мкм; 3-й класс чистоты - до 100 микробных клеток (ЗА класс - до 200 и З Б класс - до 500 клеток), до 25000 частиц размером 5 мкм и до 3500000 частиц размером 0,5 мкм; 4-й класс чистоты ~ по ГОСТу 12.1.005 - 86. Для помещений 2-го и 3-го классов чистоты, в которых изготавливают нестерильные лекарственные средства, нормирование воздуха по содержанию механических частиц не предусматривается. Лекарственные средства по «микробной чистоте» разделяют на 4 категории: 1) Стерильные препараты для инъекций, приготовленные на апирогенной воде. 2) Глазные лекарства, препараты для введения в закрытые полости тела, средства для лечения обширных ожогов и открытых ран не должны содержать живых микроорганизмов - они также относятся к разряду стерильных. 3) Лекарственные средства для наружного применения и для введения в открытые полости не должны содержать более 100 живых микробных клеток в 1г (мл) препарата и при безусловном отсутствии в них бактерий, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, а также Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. 4) Все прочие лекарственные средства должны содержать в 1г (1мл) не более 1000 жизнеспособных бактериальных клеток сапрофитов и не более 100 клеток непатогенных грибов при отсутствии болезнетворных и условно патогенных микроорганизмов, включая энтеробактерии, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, аспорогенные дрожжи рода Candida. Работающие в помещениях различной степени чистоты должны одевать рекомендуемую и пригодную для таких целей технологическую одежду (согласно требованиям системы GMP). Так, в помещениях первого класса, где кратность обмена воздуха в час 600-200, надевают стерильный костюм. Головной убор должен полностью закрывать волосы, включая бороду, и заворачиваться под ворот костюма, на лицо одевается маска во избежание попадания частиц и капель в окружающую среду; на руки одевают стерилизованные без сыпучих материалов перчатки из каучука или пластичных материалов, на ступни - стерилизованную или продезинфицированную, включая бахилы. Низ брюк подворачивают в обувь (как и рукава костюма - в перчатки). От защитной одежды не должны попадать в воздух частицы и волокна, а сама она должна задерживать частицы, исходящие с тела оператора. Указанная одежда должна быть разового использования или использоваться в течение одного дня, если результаты проверки подтверждают такую возможность. Перчатки рекомендуется постоянно дезинфицировать во время операций, маски и перчатки необходимо менять перед каждой рабочей процедурой. Стерильную зону желательно проектировать таким образом, чтобы вес операции можно было наблюдать извне. В рабочих зонах таких помещений все открытые поверхности должны быть гладкими, непроницаемыми, неразбитыми, удобными для очистки и дезинфекции, где и когда это необходимо, без труднодоступных выступов и углублений, полок, шкафов, излишнего оборудования. Раздвижные двери здесь нежелательны, из-за возможности скопления пыли в пазах, сточные и канализационные трубы не должны проходить в стерильных зонах. Комнаты для смены одежды необходимо проектировать и строить с воздушными шлюзами, снабжающимися стерильным воздухом. Двери с воздушными шлюзами не должны открываться одновременно. Между шлюзами должна быть система для визуального или аудиоконтроля (от лат. Visus - зрение, auditus - слух, слышание). Мытье рук и средства для этого должны быть только в комнате для смены одежды. В рабочие помещения должен подаваться стерильный воздух под положительным давлением. В помещениях второго класса чистоты с кратностью обмена воздуха 20-60 следует одевать гладкий (без складок), не отделяющий ворса, комбинезон, стянутый на поясе, с манжетами, плотно облегающими щиколотки ног. На голову необходимо одевать шлем-капюшон, полностью закрывающий волосы, нос и подбородок. На лицо - маску, не отделяющую ворса, на руки - резиновые (или из эластичных полимеров) перчатки, на ноги - стерильную или продезинфицированную обувь, поверх которой рекомендуется одевать бахилы, полностью закрывающие ступню. Нижняя часть брюк должна заправляться в бахилы, а рукава комбинезона - в перчатки. Ни одна часть тела или разрешенного для использования нижнего белья не должна быть открыта. В помещениях третьего класса чистоты с кратностью обмена воздуха 1-15 рекомендуется одевать не отделяющий ворса комбинезон или куртку с собранными рукавами на запястьях и воротником-стойкой, шапочку или косынку, брюки, бахилы и маску. В помещениях; четвертого класса чистоты рекомендуется надевать комбинезон, или куртку и брюки, или халат, шапочку или косынку из хлопчатобумажных или льняных тканей. Вот почему важно глубоко продумывать размещение помещений в производственных зданиях (особенно - для стерильных лекарств). С водой в сферу технологического процесса могут попасть грамотрицательные бактерии из групп энтеробактерий, псевдомонасов и некоторых других. В природных открытых водоемах обнаруживаются целлюлозоразрушающие, нитрифицирующие и денитрифицирующие бактерии, цианобактерии, аммонификаторы, железобактерии и многие другие. Лишь вода артезианских колодцев, глубоких скважин и родников отличается высокой чистотой. Следует помнить, что чем больше вода загрязнена органическими веществами, тем больше в ней содержится микробов. По степени загрязненности открытых водоемов различают 3 зоны сапробности (от лат. Saprotes - гниль, гниение): полисапробная - сильно загрязненная, содержащая в 1 мл несколько миллионов микробных клеток, включая гнилостные и кишечные бактерии; мезосапробная - умеренно загрязненная, содержащая в 1 мл до 100000 микробных клеток с преобладанием аэробных видов; олигосапробная - зона чистой воды, содержащей в 1 мл не более 1000 микробных клеток из представителей железо-, серобактерий и некоторых других видов. Полисапробные зоны характерны для рек, протекающих по населенным пунктам или вблизи них, и где в воду попадают жидкие отходы из крупных свиноводческих ферм, канализационные стоки и стоки промышленных предприятий. В такой воде могут быть санитарно-показательные (Е. Coli, Streptococcus faecalis), условно патогенные псевдомонасы, протей и другие виды, а также болезнетворные микроорганизмы из группы энтеробактерий.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ферменты, используемые как лекарственные средства. Протеолитические ферменты. Амилолитические, липолитические ферменты. Проблемы стандартизации целевых продуктов.
Номенклатура ферментов
Ферментология очень долго не располагала строго научной номенклатурой ферментов. Наименования ферментам давали по случайным признакам (тривиальная номенклатура), по названию субстрата (рациональная), по химическому составу фермента, наконец, по типу катализируемой реакции и характеру субстрата.
Примерами тривиальной номенклатуры могут служить названия таких ферментов, как пепсин (от греч.пепсис - пищеварение), трипсин (от греч. трипсис - разжижаю) и папаин (от названия дынного дерева Carica papaja, из сока которого он выделен). По действию все эти ферменты являются протеолитическими, т. е. ускоряют гидролиз протеинов (белков). Характерное название была дано группе окрашенных внутриклеточных ферментов, ускоряющих окислительно-восстановительные реакции в клетке, - цитохромы (от лат. citos - клетка и chroma - цвет).
Наибольшее распространение получила рациональная номенклатура, согласно которой название фермента составляется из названия субстрата характерного окончания -аза. Она была предложена более столетия тому назад, в 1883 г. Э. Дюкло - учеником Л. Пастера. Так, фермент, ускоряющий реакцию гидролиза крахмала, получил название амилаза (от греч.амилон - крахмал), гидролиза жиров - липаза (от греч. липос - жир), белков (протеинов) - протеаза, мочевины - уреаза (от греч. уреа - мочевина) и т. п.
Когда методами аналитической химии были достигнуты известные успехи в расшифровке химической природы простетических групп, возникла новая номенклатура ферментов. Их стали именовать по названию простетической группы, например, геминфермент (простетическая группа - гем), пиридоксаль-фермент (простетическая группа - пиридоксаль) и т.п.
Затем в названии фермента стали указывать как на характер субстрата, так и на тип катализируемой реакции. К примеру, фермент, отнимающий водород от молекулы янтарной кислоты, называют сукцинатдегидрогеназой, подчеркивая этим одновременно и химическую природу субстрата, и отнятие атомов водорода в процессе ферментативного действия:
- 2Н
НООС СH2 СН2 CООН НООС СН = СН СООН
Янтарная кислота Дегидрирование
В 1961 г. Международная комиссия по номенклатуре ферментов представила V Международному биологическому конгрессу проект номенклатуры, построенный на строго научных принципах. Проект был утвержден конгрессом, и новая номенклатура прочно вошла в ферментологию. Согласно этой (Московской) номенклатуре название ферментов составляют из химического названия субстрата и названия той реакции, которая осуществляется ферментом.
Если химическая реакция, ускоряемая ферментом, сопровождается переносом группировки атомов от субстрата к акцептору, название фермента включает также химическое наименование акцептора.
Например, пиридоксальфермент, катализируюший реакцию переаминирования между L-аланином и -кетоглутаровой кислотой, называется L-аланин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза. В этом названии отмечены сразу три особенности: 1) субстратом является L-аланин; 2) акцептором служит 2-окcоглутаровая кислота; З) от субстрата к акцептору передается аминогруппа.
Названия ферментов по научной номенклатуре неизмеримо выигрывают в точности, но становятся в ряде случаев гораздо сложнее старых, тривиальных. Так, уреаза (тривиальное название), ускоряющая реакцию гидролиза - мочевины на оксид углерода (IV) и аммиак, по научной номенклатуре именуется карбамид - амидогидролазой:
Н2N СО NН2 + Н2О 2NН3 + СО2
В этом названии дано точное химическое наименование субстрата и указано, что фермент катализирует реакцию гидролиза амидогруппы. Трегалаза, ускоряющая реакцию гидролиза трегалозы, называется трегалоза-1-глюко-гидролазой.
В связи со значительным усложнением научных названий в новой номенклатуре допускается сохранение наряду с новыми старых тривиальных, рабочих названий ферментов. Международной комиссией был составлен детальный список всех известных в то время ферментов, существенно дополненный в 1972 г. при пересмотре как классификации, так и номенклатуры некоторых ферментов, где рядом с новым научным названием каждого фермента приведено старое, а также указан химизм катализируемой ферментом реакции и в некоторых случаях природа фермента. Таким образом, исключается возможность путаницы в наименовании ферментов. В 1964 г. список включал 874 фермента; в последующее время он был существенно дополнен и возрос до 1770 ферментов в 1972 г. и до 2003 ферментов в 1979 г.
Каждому ферменту в указанном списке присвоен индивидуальный номер (шифр). Например, шифр уреазы выражается цифрами 3.5.1.5. Это означает, что уреаза относится к 3-му классу (первая цифра) ферментов, все представители которого катализируют реакции гидролиза. Вторая цифра (5) говорит о том, что уреаза принадлежит к 5-му подклассу этого класса, куда зачислены все ферменты, ускоряющие гидролиз С - N-связей, не являющихся пептидными. Третья цифра шифра (1) указывает на принадлежность уреазы к подподклассу 5-го подкласса, члены которого ускоряют гидролиз линейных амидов, а последняя цифра (5) - порядковый номер уреазы в этом подподклассе.
Упоминавшаяся ранее лактатдегидрогенеза имеет шифр 1.1.1.27, т. е. относится к 1-му классу ферментов (оксидоредуктазы), к 1-му подклассу (оксидоредуктазы, действующие на СН - ОН-группировки в качестве доноров атомов водорода), к 1-му подподклассу (акцептором атомов водорода служит никотинамидадениндинуклеотид) и занимает 27-е место в перечне ферментов упомянутого подподкласса. Таким образом, шифр абсолютно точно указывает место фермента в общем списке. В настоящее время принято в научных публикациях при первом упоминании фермента указывать в скобках его шифр.
Классификация ферментов и характеристика некоторых групп
По первой в истории изучения ферментов классификации их делили на две группы: гидролазы, ускоряющие гидролитические реакции, и десмолазы, ускоряющие реакции негидролитического распада. Затем была сделана попытка разбить ферменты на классы по числу субстратов, участвующих в реакции. В соответствии с этим ферменты классифицировали на три группы.
1. Катализирующие превращения двух субстратов одновременно в обоих направлениях: А+В)С+D.
2. Ускоряющие превращения двух субстратов в прямой реакции и одного в обратной: А+В)С.
3. Обеспечивающие каталитическое видоизменение одного субстрата как в прямой, так и в обратной реакции: А)В.
Одновременно развивалось направление, где в основу классификации ферментов был положен тип реакции, подвергающейся каталитическому воздействию. Наряду с ферментами, ускоряющими реакции гидролиза (гидролазы), были изучены ферменты, участвующие в реакциях переноса атомов и атомных групп (феразы), в изомеризации (изомеразы), расщеплении (лиазы), различных синтезах (синтетазы) и т. д. Это направление в классификации ферментов оказалось наиболее плодотворным, так как объединяло ферменты в группы не по надуманным, формальным признакам, а по типу важнейших биохимических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности любого организма.
По этому принципу все ферменты делят на 6 классов.
1.Оксидоредуктазы - ускоряют реакции окисления - восстановления.
2.Трансферазы - ускоряют реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков.
3. Гидролазы - ускоряют реакции гидролитического распада.
4.Лиазы - ускоряют негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи (или присоединяют группы атомов по двойной связи).
5. Изомеразы - ускоряют пространственные или структурные перестройки в пределах одной молекулы.
6. Лигазы - ускоряют реакции синтеза, сопряженные с распадом богатых энергией связей. Эти классы и положены в основу новой научной классификации ферментов.
К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие реакции окисления - восстановления. Окисление протекает как процесс отнятия атомов Н (электронов) от субстрата, а восстановление - как присоединение атомов Н (электронов) к акцептору.
В класс трансфераз входят ферменты, ускоряющие реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков от одного соединения к другому. Это один из наиболее обширных классов: он насчитывает около 500 индивидуальных ферментов. В зависимости от характера переносимых группировок различают фосфотрансферазы, аминотрансферазы, гликозилтрансферазы, ацилтрансферазы, трансферазы, переносящие одноуглеродные остатки (метилтрансферазы, формилтрансферазы), и др. Например, амидазы ускоряют гидролиз амидов кислот. Из них важную роль в биохимических процессах в организме играют уреаза, аспарагиназа и глутаминаза.
Уреаза была одним из первых белков-ферментов, полученным в кристаллическом состоянии. Это однокомпонентный фермент (М=480000), молекула его глобулярна и состоит из 8 равных субъединиц. Уреаза ускоряет гидролиз мочевины до NН3 и СО2.
Характерные черты действия ферментов класса лигаз (синтетаз) выявлены совсем недавно в связи со значительными успехами в изучении механизма синтеза жиров, белков и углеводов: Оказалось, что старые представления об образовании этих соединений, согласно которым они возникают при обращении реакций гидролиза, не соответствуют действительности. Пути их синтеза принципиально иные.
Главная их особенность - сопряженность синтеза с распадом веществ, способных поставлять энергию для осуществления биосинтетического процесса. Одним из таких природных соединений является АТФ. При отрыве от ее молекулы в присутствии лигаз одного или двух концевых остатков фосфорной кислоты выделяется большое количество энергии, используемой для активирования реагирующих веществ. Лигазы же каталитически ускоряют синтез органических соединений из активированных за счет распада АТФ исходных продуктов. Таким образом, к лигазам относятся ферменты, катализирующие соединение друг с другом двух молекул, сопряженное с гидролизом пирофосфатной связи в молекуле АТФ или иного нуклеозидтрифосфата.
Механизм действия лигаз изучен еще недостаточно, но, несомненно, он весьма сложен. В ряде случаев доказано, что одно из участвующих в основной реакции веществ сначала дает промежуточное соединение с фрагментом распадающейся молекулы АТФ, а вслед за этим указанный промежуточный продукт взаимодействует со вторым партнером основной химической реакции с образованием конечного продукта.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 772; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!