Современные представления о генетическом коде.
Практическое задание №3
ДНК как основа генетической информации.
Дезоксирибонуклеи́новая кислота (ДНК) — макромолекула (одна из трёх основных, две другие — РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков.
В клетках эукариот (животных, растений и грибов) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах). В клетках прокариотических организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула ДНК, так называемый нуклеоид, прикреплена изнутри к клеточной мембране. У них и у низших эукариот (например, дрожжей) встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами.
С химической точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы (С) и фосфатной (Ф) группы (фосфодиэфирные связи).
В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула закручена по винтовой линии.
|
|
|
В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином (А-Т), гуанин — только с цитозином (Г-Ц). Именно эти пары и составляют «перекладины» винтовой "лестницы" ДНК
Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важными из которых являются информационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счёт копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции.
Расположение базовых комбинаций химических соединений ДНК и количественные соотношения между этими комбинациями обеспечивают кодирование наследственной информации.
|
|
|
Образование новой ДНК (репликация)
1. Процесс репликации: раскручивание двойной спирали ДНК — синтез комплементарных цепей ДНК-полимеразой — образование двух молекул ДНК из одной.
2. Двойная спираль «расстегивается» на две ветви, когда ферменты разрушают связь между базовыми парами химических соединений.
3. Каждая ветвь является элементом новой ДНК. Новые базовые пары соединяются в той же последовательности, что и в родительской ветви.
По завершении дупликации образуются две самостоятельные спирали, созданные из химических соединений родительской ДНК и имеющие с ней одинаковый генетический код. Таким путем ДНК способна перерывать информацию от клетки к клетке.
Экспериментальные доказательства генетической функции ДНК.
Опыт Гриффитса.
Работал с двумя штаммами пневмококка, которые отличались по внешнему виду и болезнетворным свойствам. Штамм S – от него мыши сразу погибали. Штамм R – при введении гибели мышей не наступало. Он заметил, что при смеси убитых вирулетных и невирулетных мышы погибали. Это доказало процесс транформации.
Трансформация – включение чужеродной ДНК в бактериальную клетку. Это перенос наследственной информации от одной клетки прокариотов к другой посредством ДНК бактерии – донора или клетки – донора. (Гриффитс, 1928).
|
|
|
Опыт Херши и Чейза.
Они выяснили, что не все вирусы убивают бактериальную клетку. Существуют умеренные фаги. Они могут быть и вирулентными и объединятся с геномом бактериальной клетки. При этом попадая в другие бактерии вирусы привносят чужие генетические данные. Так доказан процесс трансдукции.
Трансдукция заключается в том, что вирусы, покидая бактериальные клетки, в которых они паразитировали, могут захватывать с собой часть их ДНК и, перемещаясь в новые клетки, передавать новым хозяевам свойства прежних.
Доказательства генетической роли ДНК были получены в ряде опытов по заражению бактериальных клеток вирусами. Бактериофаг состоит из белковой капсулы правильной геометрической формы и молекулы нуклеиновой кислоты , свернутой в виде спирали. Фаг прикрепляется своими отростками к клеточной оболочке, с помощью ферментов разрушает участок клеточной мембраны и чрез образовавшееся отверстие вводит свою ДНК в клетку и т.д.
Когда белок фага был помечен радиоактивной серой 35S, а ДНК – радиоактивным фосфором 32Р оказалось, что вновь образованные фаги содержали только радиоактивный фосфор, которым была помечена ДНК. Эти опыты наглядно показали, что генетическая информация от внедрившегося фага его потомкам передается только проникающей в клетку нуклеиновой кислотой, а не белком, содержащимся в капсуле вируса.
|
|
|
Опыт Френкель-Конрата.
Им удалось доказать, что чистая НК вируса табачной мозаики может заражать растения. И удалось создать гибрид из вирусов, в котором белковый футляр принадлежал одному, а НК другому вирусу. В таких случаях генетическая информация гибридов в точности повторяла генетическую информацию вируса, чья НК находилась в гибриде.
Современные представления о генетическом коде.
Опыт Ниринберга. Синтез специфических белков. Репликация, транскрипция, трансляция. Транскрипция 4х-значного кода первичной генетической информации в 20-значный аминокислотный код белков. Виды и структура т-РНК, р-РНК, и-РНК. Мультимерная организация белков (гемоглобин человека:HbA, HbA2, HbS, HbF).
Полуконсервативная репликация.
Две цепи исходной молекулы ДНК расходятся вследствие разрыва слабых водородных связей между азотистыми основаниями. Каждая из них служит матрицей для образования новой цепи, а возникающие между азотистыми основаниями водородные связи соединяют старую и новую цепи, восстанавливая целостность молекулы. В результате каждая новая клетка получает гибридную молекулу ДНК, состоящую из одной старой и одной новой цепи.
ДНК-полимеразы эукариот. В клетках эукариот имеются по меньшей мере шесть различных ДНК-зависимых ДНК-полимераз: α, β, δ,ε,γ,ζ. Четыре из них — α, β, δ,ε — непосредственно участвуют в репликации хромосомной ДНК (табл. 18).
ДНК-полимераза α —первая ДНК-полимераза, обнаруженная в клетках эукариот. Она представлена в клетке в виде прочного комплекса с ДНК-праймазой — ферментом, осуществляющим синтез РНК-затравок. Комплекс ДНК-полимераза α-праймаза является единственным у эукариот ферментативным ансамблем, способным инициировать синтез ДНК de novo. В ходе репликации в клеточных ядрах ДНК полимераза α-праймаза синтезирует затравку лидирующей нити в участке ori и затравки фрагментов Оказаки запаздывающей нити. Как правило, ДНК-полимераза не обладает корректорской 3'→5'-экзонуклеазной активностью. По-видимому, в ходе эволюции экзонуклеазный центр в данном ферменте редуцировался.
ДНК-полимераза β является наименьшей по размеру и самой простой по строению ДНК-полимеразой в клетках эукариот. Основная функция ДНК-пол.β в клетке связана с эксцизионной репарацией ядерной ДНК (заполнение пробелов при репарации).
ДНК-полимераза δ —гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы (125—130 кДа) и субъединицы 48 — 55 кДа, необходимой для преодоления ферментом структурных барьеров в природных однонитевых матрицах и для связи с фактором процессивности PCNA (от англ. Proliferating Cell Nuclear Antigen –ядерный антиген пролиферирующих клеток). Три молекулы PCNA образуют кольцевой тример с отверстием для двунитевой ДНК в центральной части, который представляет собой перемещающуюся по ДНК подвижную платформу или «скользящую скрепку» в форме тора (бублика), удерживающую ДНК-полимеразу δ в ходе полимеризации на матрице и обеспечивающую высокопроцессивный синтез ДНК. Хотя PCNA и прокариотический фактор процессивности субъединица β ДНК-полимеразы III Е. coli имеют низкую гомологию на уровне первичной структуры, оба белка формируют близкие по пространственной геометрии структуры «скользящей скрепки».
ДНК-полимераза ε,выделена из клеток HeLa, содержит два полипептида — каталитический 261 кДа и полипептид 55 кДа. Каталитический полипептид обладает ДНК-полимеразной и 3'→5‘-экзонуклеазной активностями. Особенностью холофермента ДНК-полимеразы ε по сравнению с ДНК-полимеразой δ является его меньшая зависимость от вспомогательных факторов (PCNA, RFС - репликативный фактор С и RPA – репликативный ядерный белок А), а также низкая (почти на порядок) скорость синтеза ДНК. Это различие, возможно, связано с разной функцией ДНК-полимераз в репликативной вилке. Один холофермент, ДНК-полимераза δ осуществляет быстрый и процессивный синтез лидирующей нити, используя для элонгации единственную затравку, синтезируемую ДНК-полимеразой α-праймазой в районе ori, и диссоциирует только по достижении конца репликона, тогда как несколько холоферментов ДНК-полимеразы ε могут одновременно синтезировать фрагмены Оказаки в «зоне Оказаки», удлиняя затравки, синтезируемые ДНК-полимеразой α-праймазой в начале каждого фрагмента.
ДНК-полимераза γ локализована в митохондриях, ее функция связана с репликацией и репарацией митохондриальной ДНК, она кодируется ядерным геномом. ДНК-полимераза γ способна направлять высокопроцессивную полимеризацию на однонитевых ДНК-матрицах в отсутствие вспомогательных факторов.
Репликативная вилка
В точке репликации двойная спираль ДНК расплетается и образует петлю, к которой прикрепляются различные белки. Репликативная вилка Это расплетенная часть молекулы ДНК, где под действием специальных ферментов, происходит само удвоение цепей. Водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями в параллельных цепях разрезаются с помощью фермента геликазы (от англ. Helix – спираль). На разрыв водородной связи расходуется энергия около двух молекул АТФ. Для того чтобы полинуклеотидные цепи не соединились вновь, к ним присоединяются специальные ДНК-связывающие белки. Распускание двойной спирали происходит очень быстро. Для того чтобы репликативная вилка могла двигаться со скоростью 500 нуклеотидов в секунду, материнская спираль должна крутиться со скоростью 50 оборотов в секунду. Так вращается вал двигателя автомобиля, который едет со скоростью 100 км/ч. Понятно, что это создает крутящий момент, который механически мешает расплетанию спирали. Многие сталкивались с таким явлением, пытаясь разделить скрученные нити. Специальный фермент гираза (от англ. Gyration – кручение), который находится перед вилкой, предотвращает запутывание расплетенных цепей. Синтез новой цепи происходит с помощью ферментного комплекса ДНК-полимеразы. Он синтезирует новую полинуклеотидную цепь, комплементарную материнской. Для понимания механизма репликации важно вспомнить о разнонаправленности и антипараллельности полинуклеотидных цепей.
Репликация у бактерий
Бактериальный геном представляет собой кольцо, размером примерно 5 млн. пар нуклеотидов. В этом кольце есть конкретное место, с которого начинается удвоение. Репликация происходит по следующему принципу. С точки начала репликации в две стороны начинают двигаться два комплекса ферментов. Каждый комплекс ферментов способен удваивать сразу обе цепочки ДНК. Область, в которой он находится, называется вилкой репликации. Два комплекса пройдут по кольцу по часовой и против часовой стрелки. Когда они встретятся, репликация будет завершена.
Ключевым ферментом, осуществляющим репликацию, является ДНК-полимераза. Она удваивает ДНК. Как правило, в каждой клетке существует несколько разных ДНК полимераз, для разных целей. В частности, геном бактерий реплицирует ДНК-полимераза III. ДНК-полимераза I и II — это вспомогательные ферменты, участвующие в процессах исправления ошибок в ДНК (репарации). ДНК-полимераз в репликативной вилке должно быть две, поскольку цепочек ДНК тоже две.
Необходимо помнить, что полимераза может синтезировать ДНК только в одном направлении от 5’- к 3’- концу. Эти штрихи берутся от нумерации атомов в сахаре. Дезоксирибоза — пятиатомный сахар. Она является необходимым звеном, образующим сахарофосфатный остов. В образовании этого остова играют роль 3 и 5 атомы углерода. Соответственно, у сахара, у сахарофосфатного остова, у ДНК и РНК есть 3’-конец и 5’- конец. Синтезироваться молекула ДНК может только путем присоединения новых нуклеотидов к растущему 3’-концу. Энергия для синтеза ДНК берется от нуклеотид-3-фосфатов, которые одновременно являются и структурными элементами ДНК. При присоединении нуклеотида отщепляется пирофосфат, который тут же разрушается специальным ферментом (пирофосфатазой) еще на две отдельных молекулы ортофосфорной кислоты, тем самым, делая эту реакцию необратимой.
Почему ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к 3’-концу молекулы? Может быть, это связано с тем, что при таком синтезе ДНК-полимераза может репарировать собственные ошибки. Если фермент присоединил неправильный нуклеотид, а потом «осознал», что ошибся, то он может просто сделать шаг назад, удалить нуклеотид и сделать все, как было. Если бы синтез шел наоборот, так нельзя было бы сделать. На самом деле это точно не известно и причины могут быть другими.
Поскольку нить ДНК растет в одном направлении, и ферментный комплекс движется в одном направлении, как осуществляется синтез комплементарной цепи?
Дело в том, что вторая цепь ДНК образует петлю и разворачивается так, чтобы обе ДНК-полимеразы в составе ферментного комплекса могли двигаться вместе (рис. 3). В результате, на второй цепи ДНК синтез идет кусочками, с перерывами. Эта цепь называется отстающей, другая — лидирующей. Время от времени фермент перескакивает на какое-то расстояние по цепи ДНК дальше и синтезирует дочернюю цепь до следующего перескакивания. Синтез с отстающей цепи происходит фрагментами. Эти фрагменты названы в честь японского ученого, который их описал, — фрагментами Оказаки. Фрагменты Оказаки сшиваются лигазой.
Дата добавления: 2022-12-03; просмотров: 125; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!