Трансмиссионная (просвечивающая) и растровая (сканирующая) электронная микроскопия.
Лекция 2.
Подготовка материала для светооптического исследования
В световом микроскопе можно исследовать самые разнообразные образцы. Очень важно выбрать метод исследования, адекватный поставленной задаче. Нужно различать задачи: «увидеть что-то» и «изучить строение чего-то». В первом случае стоит использовать наиболее простые и доступные методы. Во втором – методы, обеспечивающие наиболее полную информацию об объекте.
Использование фиксированных объектов дает широкие возможности для разработки огромного числа методов окрашивания клеток и тканей, выявляющих различные компоненты клеток. Следует внимательно подходить к выбору фиксатора, и делать этот выбор с учетом последующих исследований материала, поскольку некоторые методы окраски разработаны для определенного вида фиксации. Фиксатор должен быстро проникать в ткани, опережая процесс аутолиза. Скорость проникновения (фиксации) зависит от многих параметров, для формалина она составляет около 1 см в сутки. Более плотные ткани фиксируются дольше. Очевидно, что чем меньше кусочек, тем лучше сохранность структур.
Процедура фиксации направлена на предотвращение распада тканей и клеток, на сохранение их прижизненной структуры. В процессе фиксации происходит инактивация клеточных ферментов, предупреждается диффузия растворимых белков, сохраняется структура ткани. Фиксация предотвращает рост бактерий и грибов в ткани. Существует множество разных фиксаторов, многие из которых направлены на фиксацию отдельных компонентов клеток и тканей, иногда – в ущерб остальным структурам.
|
|
|
Фиксаторы-смеси на основе уксусной кислоты. Существует много вариантов фиксаторов, включающих уксусную кислоту. Наиболее простые –
5% р-р уксусной к-ты в абсолютном спирте (фиксация по Уолмену и Бехару).
Фиксатор Карнуа – 10 мл абс.спирта + 3 мл хлороформа + 1 мл уксусной к-ты.
Более сложные фиксаторы могут включать в себя сулему, бихромат калия, метиловый спирт, пикриновую кислоту и ряд других добавок.
Сложный состав фиксирующих растворов отражает историю поиска оптимального фиксатора. Существует большое количество фиксирующих растворов, но общим для всех является механизм сшивки молекул образца непредельными связями молекул фиксатора. Практика показала, что наиболее адекватной, т.е. сохраняющей структуру, является фиксация альдегидными фиксаторами. В ее основе лежит сшивка биологических молекул альдегидными группами фиксатора, когда двойные связи стабилизируют химическую структуру клеток, соединяясь с их компонентами.
Наибольшее распространение получили альдегидные фиксаторы на основе формальдегида (формалина) и глутарового альдегида, причем первый используется несравнимо шире, поскольку его растворы более стабильны, а сам он существенно дешевле и доступнее.
|
|
|
Формалиновая фиксация.
Формалин взаимодействует главным образом с основными (щелочными) аминокислотами, образуя метиленовые мостики, сшивающие молекулы. Важное значение для адекватной фиксации имеют два параметра: величина рН и осмолярность раствора. На практике соблюдение этих параметров зависит от задач и методов исследования.
Самый простой вариант фиксатора – 10% раствор промышленного формалина на водопроводной воде. Промышленный формалин представляет собой 40% насыщенный раствор формальдегида, именно в такой форме он получается в результате промышленного производства. Такой раствор для удобства считают 100%-ым. Т.е., рабочий фиксирующий раствор соответствует 4% раствору формальдегида. Величина рН такого фиксатора около 8 единиц, а осмолярность очень низка. Очевидно, что такая фиксация не обеспечивает адекватной сохранности цитологических структур. Однако, она широко используется, в первую очередь – для патоморфологических исследований в медицине. Таким же раствором заливается анатомический материал. Преимущество такой фиксации – быстрота и простота приготовления фиксатора, его дешевизна.
|
|
|
Параформальдегид (параформ) - удобный источник для получения формальдегида. Представляет собой смесь продуктов полимеризации формальдегида (полиоксиметиленов) общей формулы [—CH2O—] n (n = 8—100); кристаллическое вещество белого цвета. Фиксатор из параформа готовят, нагревая его взвесь в соответствующем растворителе (буферном растворе).
Нейтральный формалин готовят следующим образом:
К 1 л имеющегося в продаже 40%-ного раствора формалина добавляют 100 г молотого мела или углекислой магнезии. Полученный раствор несколько раз в течение дня перемешивают, а затем отстаивают, после чего с помощью 0,1 Н HCl или 0,1 Н NaOH доводят значение pH раствора формалина до 7,0.
Степень усложнения формалинового фиксатора начинается с доведения рН водного раствора до физиологических значений 7,2-7,4. Затем следует большое число вариантов фиксатора, когда используют буферные растворы и соблюдают осмолярность.
В нашей практике мы используем универсальный фиксатор, который готовится из параформальдегида на солевых растворах, используемых при культивировании клеток. Очевидно, что эти растворы по своему составу наиболее адекватны внутренней среде живых клеток. Для работы готовится 4% раствор параформальдегида. Величину рН нужно контролировать, поскольку разные партии параформа могут ее изменять.
|
|
|
Условия фиксации должны обеспечить наименьшую скорость разложения ткани в глубине образца, поэтому фиксацию образцов рекомендуется проводить при +4С. Величина кусочков зависит от задач исследования, для электронной микроскопии берут небольшие образцы.
Глутаровый альдегид
Глутаровый альдегид – диальдегид, реагирует с аминогруппами, сульфгидрильными группами и, возможно, с ароматическими циклическими структурами. «Сшивает» молекулы сильнее, чем формальдегид, поэтому менее предпочтителен для иммуногистохимии. Фиксаторы на основе ГА медленнее проникают в ткани, чем формалин, поэтому могут возникнуть артефакты на основе диффузии растворимых белков и нарушения структуры.
В современных микроскопических исследованиях используют разнообразные фиксаторы, в зависимости от задач исследования.
«Проводка» образцов для микроскопического исследования
Процесс подготовки материала для микроскопического исследования, помимо фиксации, обычно включает в себя обезвоживание материала, пропитку его заливочной средой и заливку. Задача – сделать материал пригодным для изготовления достаточно тонких срезов для окрашивания и просмотра в микроскопе. В качестве заливочной среды для световой микроскопии преимущественно используется парафин, иногда – целлоидин и желатин. В последнее время появились синтетические заливочные среды, успешно заменяющие парафин, часто изготовленные на его основе. Абсолютное большинство методов специфического окрашивания разработано для парафиновых срезов.
Итак, после фиксации мы имеем образец, пропитанный водным раствором фиксатора. Для заливки в парафин, который не смешивается с водой, нужно избавиться от воды и пропитать образец парафином. Для этого проводят обезвоживание образца в растворах этилового спирта возрастающей концентрации (от 30% до абсолютного), затем выдерживают в смеси абсолютного спирта с ксилолом или в изопропиловом (бутиловом) спирте, затем –в ксилоле, смеси ксилола с парафином и, наконец, в парафине. Пропитка парафином проводится при температуре 56С. Разогретый образец помещают в формочку и заливают разогретым парафином. После затвердевания образец монтируют на подставку и блок готов для резки. Нужно иметь в виду, что для гистологических целей подходит не каждый парафин, существуют свои особенности его подготовки. От качества парафина во многом зависит качество срезов.
Для проводки материала используют плотно закрывающуюся посуду, чтобы не было испарения растворов. При ручной проводке образцы перекладывают из раствора в раствор, и проводка занимает, в зависимости от величины образцов, от суток до недели. В лабораториях обычно используют автоматы разной модификации, в которых происходит вращение сосудов, которое обеспечивает перемешивание жидкости. Время проводки сокращается до суток. Существуют ускоренные схемы проводки.
Готовые парафиновые блоки могут храниться неограниченное время. Парафиновые срезы готовят на микротомах с помощью стального или (реже) стеклянного ножа Толщина срезов зависит от свойств самого парафинового блока, ткани и от модели микротома и квалификации работника. Последняя имеет достаточно большое значение. В самом лучшем случае толщина парафинового среза составляет около 3 мкм, что позволяет видеть один слой клеток в срезе. На практике обычно готовят срезы толщиной 5-8 мкм. Срезы помещают на предметное стекло, которое может быть покрыто адгезивом, обычно – яичным белком. Это нужно, что бы срезы не отваливались при окраске.
Парафиновые срезы на стекле могут храниться годами, но обычно их окрашивают через день-два после изготовления. Перед окраской проводится обратная проводке процедура – депарафинирование. Это нужно для того, чтобы клетки снова оказались водопроницаемыми, а их структуры стали доступными для красителей. Депарафинирование проводят в обратном порядке: сначала растворяют парафин в ксилоле, затем срезы помещают последовательно в растворы этилового спирта понижающейся концентрации до 30%, затем – в дистиллированную воду. Срезы готовы к окрашиванию.
Окрашивание производят вручную, помещая стекло в растворы разных химикатов, или нанося красящие растворы на стекло пипеткой. Существуют автоматы для окрашивания срезов, но их эксплуатация может быть очень дорогой, поскольку нужно заливать большие объемы красителей, которые обычно дороги. Окрашивание парафиновых срезов позволяет выявить самые разнообразные компоненты и структуры клетки. Существует множество разнообразных красителей, обладающих способностью окрашивать клеточные и тканевые структуры. Значительный прорыв в окрашивании гистологических срезов был сделан при внедрении в практику анилиновых красителей.
Наиболее распространенным методом обзорного окрашивания гистологических препаратов, когда видны все типы клеток, является окрашивание гематоксилином и эозином.
Помимо парафиновой заливки, используют заливку в целлоидин и полиэтиленгликоль, при этом применяется другая схема проводки. В желатин заливают кусочки без обезвоживания, сразу после фиксации.
Гистохимия.
Методы гистохимии направлены на выявление тех или иных молекул в клетках и тканях, что позволяет изучать специализированные типы клеток, их изменения в норме и патологии. Существует множество гистохимических методов, многие – очень сложные, многоступенчатые и трудоемкие.
Пример:
Выявление ДНК по Фельгену
Реактивы:
1. Метиловый спирт.
2. 3N раствор HCl.
3. Реактив Шиффа.
4. 1N HCI.
Приготовление реактивов
1. 3N раствор HCl: 266,4 мл концентрированной HCl, до 1 литра — дистиллированная вода. Готовить в мерной колбе, хранить в холодильнике.
2. Реактив Шиффа.
3. Сернистая вода: 1,5 г —Na2S2O5, 15 мл — 1N HCl, 300 мл — дистиллированной воды.
Ход реакции
1. Препарат фиксируют в метаноле 15 мин.
2. Опускают в подогретый до 37 °С раствор 3N раствор соляной кислоты и помещают в термостат при 37 °С на 20 — 25 мин.
3. Промывают в отработанном реактиве Шиффа из холодильника.
4. Помещают в чистый реактив Шиффа при 37 °С на 45 — 60 мин.
5. Промывают в сернистой воде 3 раза по 3 мин.
6. Промывают в дистиллированной воде.
7. Высушивают на воздухе и заключают под покровное стекло в заливочную среду.
Этот метод используют для окраски ядер клеток и метафазных хромосом.
Для каждой ткани существуют свои особенности фиксации, проводки, заливки и окраски. Очевидно, что изготовление срезов костной ткани и нервной различается. В качестве красителей используются самые разнообразные вещества, наиболее распространены анилиновые красители. Своеобразным вариантом красителя являются соли серебра, которые восстанавливаются в ходе окрашивания до металлического серебра, придающего окраску структурам.
Электронная микроскопия.
Электронный микроскоп был изобретен в 1933 году и является сложным прибором, в котором сочетаются достижения вакуумной техники и электроники. В электронном микроскопе вместо света используется поток электронов, а стеклянные линзы заменены электромагнитными полями. Источником электронов, т. е. катодом, служит вольфрамовая нить, испускающая электроны при нагревании. В центре анода имеется небольшое отверстие. Сквозь него проходят электроны, и пучок их фокусируется магнитной катушкой, играющей роль линзы, которая направляет его на объект. Когда пучок электронов уже прошел через объект, изображение его увеличивается с помощью второй магнитной катушки, которая действует как линза объектива; затем пучок электронов проходит через третью магнитную катушку, действующую в качестве окуляра или проекционной линзы и увеличивающую уже полученное изображение объекта.
Стабильность напряжения. Ускоряющее напряжение. Виброустойчивость электронного микроскопа. Тепловая стабильность. Система охлаждения. Вакуум в колонне микроскопа (около 10-5 Па) обеспечивает прохождение электронного пучка и чистоту исследуемого образца. Гониометр.
Диапазон увеличений (от 800-1000 до 850 000 раз). Калибровка.
Трансмиссионная (просвечивающая) и растровая (сканирующая) электронная микроскопия.
Формирование изображения на экране электронного микроскопа происходит за счет чередования активированных и неактивированных молекул флуорохрома, покрывающего экран, на который падает электронный пучок. На флуоресцирующем экране рассматривают изображение, проводят его фокусировку. Фотосъемка раньше проводилась на фотопленку или стеклянные фотопластинки, в современных микроскопах используют цифровые фотокамеры.
Требования к образцам для электронной микроскопии:
- оптимальная толщина
- неоднородность химического состава и присутствие атомов тяжелых элементов
- устойчивость к воздействию вакуума, температуры и электронного луча
Электронный микроскоп сразу нашел применение в физике, геологии, материаловедении, химии и других отраслях науки, изучающих неживые объекты.
Изучение кристаллов, пленок. Изучение полупроводников. Материаловедение. Изучение «старения» материалов, изменений структуры при различных воздействиях. Изучение магнитных лент (распределение ферромагнетиков на поверхности, их ориентация и т.п.).
Изучение роста кристаллов. Контроль процесса образования кристаллов. Применение микродифракции в электронном микроскопе для анализа нарушений кристаллической структуры различных соединений, для изучения структуры пленок, образующихся в разных условиях (вакуум, возгонка и пр.). Изучение сплавов. Изучение биметаллов (структура раздела).
Анализ химического состава материалов: (1) рентгеновская спектрометрия (дисперсионный спектрометр анализирует генерируемое электронами излучение и определяет элементный состав образца); (2) анализатор энергии (измеряет потерю энергии электронов, пролетающих через образец и т.о. определяет элементный состав. Очень малая площадь образца). Компьютерная обработка.
Четырёхмерная электронная микроскопия (4 D electron microscopy ) - новая разновидность электронного микроскопа способна генерировать видео на атомном уровне, показывающее тончайшие изменения, происходящие в материалах при внешнем воздействии или в ходе химических реакций. Новая установка способна раскладывать на множество кадров события, длящиеся триллионные доли секунды. Оригинальная техника съёмки, названная четырёхмерной электронной микроскопией (4D electron microscopy), разработана в физико-биологическом центре науки и технологии ультрабыстрых процессов (Physical Biology Center for Ultrafast Science and Technology — UST) Калифорнийского технологического института. В основе устройства — система, которая позволяет контролировать с высокой точностью траекторию каждого отдельного электрона, направляемого на образец. Причём изображение снимается (фиксируется отражённый сигнал) также по отдельности для каждого электрона (а они идут с точно отмерянными интервалами в фемтосекунду (10−15 с), а не для их "обобщённого" потока, как в установках прежних поколений. Миллионы таких кадров, проигрываемых с нужной скоростью, формируют фильм, демонстрирующий ранее неуловимые изменения в образцах. Главный автор этого проекта Ахмед Зивейл (Ahmed Zewail) в 1999-м получил Нобелевскую премию по химии за разработку метода ультрабыстрой съёмки молекул, освещаемых сверхкороткими лазерными импульсами. Этот способ придал съёмке атомарного масштаба новое измерение — время, но не давал того высокого пространственного разрешения, которое присуще электронным микроскопам. В новом устройстве учёные сумели "соединить" оба принципа, впервые получив подвижную картинку в малом масштабе как во времени, так и в пространстве.
Для проверки аппарата они пронаблюдали за тонкими (порядка нанометра) листами золота и графита. Удалось визуализировать небольшие и очень быстротечные (с частотой порядка мегагерца) механические колебания таких структур (в частности, возникающие при быстром нагреве образца), которые можно было зафиксировать во всех деталях, только преодолев по шкале времени пикосекундный масштаб и пойдя дальше, практически к фемтосекундам.
Удивительный аппарат Titan, созданный в рамках американско-европейского проекта TEAM, получил свои первые изображения с рекордным разрешением 0,05 нанометра. Это равно четверти поперечника атома углерода. Чтобы понять, какие новый инструмент открывает возможности по изучению материалов или биологических молекул, нужно добавить, что диаметр спирали ДНК составляет целых 2 нанометра.
TEAM означает Transmission Electron Aberration-corrected Microscope, то есть трансмиссионный электронный микроскоп с коррекцией аберрации. Он появился в результате смешения двух технологий: электронного микроскопа сканирующего и трансмиссионного типов (так называемая технология S/TEM). Для повышения разрешения здесь был применён ряд новаций, в частности, сразу две оригинальные системы коррекции сферической аберрации.
Titan разработан в американском национальном центре электронной микроскопии при лаборатории Беркли (National Center for Electron Microscopy — NCEM), с самым непосредственным участием специалистов из американской национальной лаборатории в Окридже (Oak Ridge National Laboratory), ряда других организаций, а также из компаний FEI и CEOS. Эти две фирмы, кстати, не только спроектировали часть важных систем уникального инструмента, но собственно и построили микроскоп. В 2008 году этот микроскоп перевезут на место его постоянной работы – в NCEM, а в 2009-м он должен быть полностью отлажен, испытан и приступить к работе.
Дата добавления: 2022-01-22; просмотров: 100; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!