Настройка освещения и фокусировка микроскопа
Лекция 1.
Световая микроскопия
Орган зрения остается самой совершенной системой обработки изображений, несмотря на все достижения научно-технического прогресса. Однако людям все время хочется увидеть то, что не видно невооруженным глазом.
Микроскоп. Изобретение этого важного для всей биологии прибора было обусловлено, прежде всего, развитием оптики. Некоторые оптические свойства изогнутых поверхностей были известны еще Евклиду (300 лет до н.э.) и Птолемею (127-151 гг.), однако их увеличительная способность не нашла практического применения.
Первые очки были изобретены Сальвинио дели Арлеати в Италии в 1285 г. В XVI веке Леонардо да Винчи и Мауролико показали, что малые объекты лучше изучать с помощью лупы. Лупа – самое простое средство для рассматривания мелких объектов. В то же время в Нидерландах потомственные оптики Захарий и Ханс Янсены в 1590 г. смонтировали две выпуклые линзы внутри одной трубки, т. е. фактически создали первый микроскоп и таким образом заложили основы для создания сложных микроскопов.
Оптика развивалась, и в 1674 г. Антони ван Левенгук изготовил линзы с увеличением, достаточным для проведения простых научных наблюдений. Стоит отметить, что в XVII в. наряду с Левенгуком сразу несколько ученых занимались микроскопией. Так, Галилей (1610г.) сконструировал микроскоп путем сочетания линз в свинцовой трубке. Декарт в своей книге "Диоптрика" (1637 г.) описал сложный микроскоп, составленный из двух линз, - плоско-вогнутой (окуляр) и двояковыпуклой (объектив). Однако именно Левенгук создал самые совершенные микроскопы того времени, позволяющие рассматривать мелкие объекты.
|
|
|
На слайде представлен микроскоп Левенгука, изготовленный в конце 1690-х годов. Размеры его приборов были относительно постоянны и были около 2 дюймов в длину (1 дюйм = 2,52 см) и 1 дюйм в ширину. Основное тело микроскопов состояло из 2 склепанных вместе плоских и тонких металлических (обычно латунь) пластин, между которыми были помещены небольшие двояковыпуклые линзы с возможным увеличением от 70 до 250 раз, в зависимости от их качества. Стоит отметить, что именно микроскопы Левенгука являются первыми, которые были завезены в Россию по указанию Петра I.
Левенгуку было интересно разглядывать с помощью линз все, что его окружало - кожу, мясо, жало пчелы. Но «История» начинается с того момента, когда он решил рассмотреть каплю воды. ЧТО он мог там увидеть, кроме воды? Только воду. Как бы не так! Там "были своего рода звери, в продолжение многих веков терзавшие и истреблявшие целые поколения людей, которые в десять миллионов раз крупнее их самих. Это были существа более ужасные, чем огнедышащие драконы и чудовищные многоголовые гидры, о которых повествовалось в сказках и легендах. Это были тайные убийцы, губившие детей в их теплых люльках и королей в их защищенных дворцах». Это был невидимый, скрытый мир, в который Левенгук заглянул первым из всех людей всего мира! На слайде приведены снимки микроорганизмов, аналогичные тем картинам, которые увидел Левенгук, но сделанные в наши дни с помощью однолинзового простейшего микроскопа.
|
|
|
Да, это был важный день для Левенгука. Но, может быть, это была случайность или соринка в глазу? Вот в этом сомнении, в стремлении доказать что-то прежде всего самому себе, и проявляется настоящий ученый. Мало видеть, надо увидеть. И убедить всех, что душой твоей не овладели дьяволы. Левенгук смотрел на "животных" снова и снова. Он писал: "Они останавливаются, остаются на момент неподвижными, потом начинают быстро вращаться наподобие волчка, и их окружность не больше окружности мельчайшей песчинки". Но откуда взялись эти создания в дождевой воде? И он вымыл блюдо, старательно его вымыл и поставил под дождь. И там не было маленьких созданий - значит, они не падали с неба! Рассматривал ли Левенгук различную воду, разводил ли существ в воде с помощью перца, уничтожал ли их с помощью кипятка, исследовал ли налет с зубов или принимал в гостях английскую королеву и Петра Первого, - он уже изменил мир.
Отныне в нем существовали "ничтожные зверюшки", которых мы сейчас можем увидеть вплоть до мельчайших подробностей в разнообразные микроскопы. Так кратно ли увеличение мощностей микроскопов нашему знанию о микромире? Скорее всего, да. Однако забавно представить себе ситуацию, когда современные биологи смогут изучать свой предмет только с помощью микроскопа Левенгука. Много ли научных открытий они смогут сделать, насколько остроумный эксперимент может помочь им? Фактически Левенгук стал основоположником микробиологии, открыв микроорганизмы в 1680г.
|
|
|
Но открытие КЛЕТКИ, как элементарной единицы живого принадлежит Роберту Гуку. В 1665г он открыл клетки, наблюдая срез пробкового дерева в микроскоп, и ввел понятие "клетка". Роберт Гук использовал более сложный микроскоп, принципиальная схема которого «работает» и по сей день.
Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы.
Пояснения к слайду:
1. Источник света;
2. Коллектор;
3. Ирисовая полевая диафрагма;
4. Зеркало;
5. Ирисовая аппертурная диафрагма;
6. Конденсор;
7. Препарат;
7'. Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое
|
|
|
объективом;
7''. Увеличенное мнимое окончательное, изображение препарата, наблюдаемое в окуляре;
8. Объектив;
9. Выходной значок объектива;
10. Полевая диафрагма окуляра;
11. Окуляр;
12. Глаз.
Классический микроскоп
Увеличение объекта происходит двумя шагами:
- Объектив формирует увеличенное изображение объекта в т.н. промежуточной плоскости (действительное промежуточное изображение).
2. Окуляр увеличивает промежуточное изображение, и глаз наблюдает увеличенное мнимое окончательное изображение препарата.
Общее увеличение:
Увеличение объектива х на увеличение окуляра
На слайдах показаны модели старинных и современных световых микроскопов.
В любом микроскопе различают механическую и оптическую части.
Механическая часть: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть: объективы, окуляры и осветительная система, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.
Основную роль в получении изображения играет объектив. Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.
Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа, т. е. возможностью различать две близко расположенные точки. Предел разрешения — минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,— зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива.
Числовая апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом. Угловая апертура—это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, по отношению к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет следующий вид:
где R - предел разрешения; 
- длина волны; NA - числовая апертура.
Или:
R = 0,61 ( λ / nsinα )
Где – λ –длина волны света
n - коэффициент преломления среды
a- угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив
Обычно используют видимый свет (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение не может быть выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм).
Для ультрафиолетового света – 130-140 нм
В современных микроскопах объектив проецирует изображение на «бесконечность». Тубусная линза формирует промежуточное изображение, лучи между объективом и тубусной линзой идут параллельно. Это позволяет получить больший угол зрения. «Бесконечная оптика» - оптика ISC (Infinity Color-corrected System).
Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм) минимальное разрешение составляет примерно 0,08 мм (а у многих людей — около 0,20 мм).
Т.о., невооруженный глаз различает 0,1 мм (100 мкм), и тогда световой микроскоп увеличивает разрешающую способность глаза в 1000 раз.
Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500—1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.
В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90—100 х). «Сухой» объектив - это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.
Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии — кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно, в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом.
Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками: сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО - апохромат и т. п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии - обозначение МИ и черное кольцо.
Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17 мм.
Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40 х). При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть повреждена фронтальная линза объектива.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
Конденсор (от латинского condense—сгущаю, уплотняю), - короткофокусная линза или система линз, используемая в оптическом приборе для освещения рассматриваемого или проецируемого предмета. Конденсор собирает и направляет на предмет лучи от источника света, в том числе и такие, которые в его отсутствие проходят мимо предмета; в результате такого «сгущения» светового потока резко возрастает освещённость предмета.
Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая важна для правильного освещения препарата.
Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора, коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия которой зависит диаметр освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.
Настройка освещения и фокусировка микроскопа
Качество изображения в значительной мере зависит также от правильного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата при микроскопии. Наиболее распространенным является способ установки света по Кёллеру:
1). устанавливают осветитель против зеркала микроскопа;
2). включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа;
3). помещают препарат на предметный столик микроскопа;
4). закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе;
5). убирают лист бумаги с зеркала;
6). закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа).
7). открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы осветителя и значительно уменьшают накал лампы;
8). при малом увеличении (10х), глядя в окуляр, получают резкое изображение препарата;
9). слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка);
10). раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора;
11). при смене объектива необходимо проверить настройку света.
После окончания настройки света по Кёллеру нельзя изменять положение конденсора, раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата. Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контраста изображения, а недостаточное - к значительному ухудшению качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть. Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.
Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение - с сильными сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.
Уход за микроскопом
При работе с микроскопом нельзя прилагать большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров. Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Обязательно нужно прочитать в инструкции о чистке линз конкретной модели микроскопа, современные модели иногда требуют особого ухода.
С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы — это приведет к их порче. По окончании работы на микроскопе необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.
Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 - 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.
Световая микроскопия.
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями (окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д.). Метод косого освещения является разновидностью предыдущего, отличаясь тем, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. В ряде случаев это позволяет выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.
Метод светлого поля в отражённом свете применяется для наблюдения непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата от осветителя и полупрозрачного зеркала производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.
Метод тёмного поля в проходящем свете применяется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, невидимых при освещении по методу светлого поля. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления.
Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе создаётся лишь небольшой частью лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. При этом методе по виду изображения нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.
Фазово-контрастная и интерференционная микроскопия
Фазово-контрастная и интерференционная микроскопия основаны на явлениях преломления и дифракции видимого света. Основным достоинством этих способов микроскопирования является возможность наблюдать живые клетки и их движение.
Метод фазового контраста служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани и клетки. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Другими словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Такое изображение называется фазово-контрастным. Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля.
Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных клеток и микроорганизмов резко увеличивается, и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).
За изобретение фазово-контрастной микроскопии его автор голландский физик Цернике был удостоен Нобелевской премии.
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:
1). набора объективов со специальными фазовым пластинками;
2). конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;
3). вспомогательного микроскопа.
Инвертированные микроскопы
Специализированные микроскопы, предназначенные для работы в режиме фазового контраста, их используют главным образом для наблюдения культур клеток, и они позволяют видеть изменения клеток в процессе культивирования. Эти модели микроскопов адаптированы для наблюдения клеток в чашках Петри, в сосудах Карреля и других культуральных сосудах. Инвертированные микроскопы имеют обратное расположение оптики - объективы находятся снизу, а конденсор – сверху.
Направление хода лучей, прошедших сверху вниз через объектив, изменяется системой зеркал, и в глаз наблюдателя они попадают, как обычно, снизу вверх. Микроскопы этого типа предназначены так же для исследования громоздких объектов, которые трудно или невозможно расположить на предметных столиках обычных микроскопов.
Дата добавления: 2022-01-22; просмотров: 31; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!