Полуиндуцибельные защитные соединения растений. Система конститутивных и полуиндуцибельных защитных соединений
Достаточно часто вторичные метаболиты выступают в роли полуиндуцибельных соединений. В этой системе часто используются характерные модификации молекул вторичных метаболитов, связанные с изменением их биологической активности. Обычно неактивными предшественниками являются гликозилированные формы соединений. К полуиндуцибельным защитным веществам относятся, например, цианогенные гликозиды, глюкозинолаты, гликозиды о-коричных кислот. Для них характерно присутствие гликозида в вакуоле, а гидролизующего фермента — в цитоплазме или клеточной стенке. После нарушения целостности тонопласта происходит гидролиз и быстро образуется токсичное или активное соединение — синильная кислота, нитрил или кумарин. полуиндуцибельные соединения находятся в тканях в виде неактивного предшественника и после соответствующего сигнала или воздействия быстро превращаются в активные вещества. Эти соединения часто работают на «втором круге» обороны, образующиеся соединения, как правило, более токсичны, чем конститутивные. Поскольку предшественник нетоксичен, его концентрация в тканях может быть достаточно высокой. Система получения активного соединения, как правило, основана на компартментации процесса. Неактивный предшественник обычно располагается в вакуоле клетки или периплазматическом пространстве, тогда как фермент, осуществляющий его перевод в активную форму, — в цитозоле. Возможна компартментация на уровне ткани. В этом случае предшественник может находиться в идиобластах, а ферменты его активации — в соседних клетках. При нарушении целостности клетки или ткани (за счет прямого повреждения «агрессором» либо в процессе патогенеза) субстрат становится доступным для фермента и быстро образуется токсичное соединение.
|
|
|
39. Индуцибельные защитные соединения растений. Фитоалексины.
Индуцибельные соединения обычно участвуют в работе «третьего круга» обороны. Они характеризуются очень высокой токсичностью и формируются de novo в результате разворачивания процесса патогенеза. Их образование обычно запускается в результате работы сигнальных систем клетки, которые включают гены ферментов их синтеза. Многие вторичные метаболиты являются важнейшими участниками каждого из «кругов обороны» растения.
Вторичные метаболиты, участвующие в работе третьего «круга обороны», где происходит индукция синтеза мощных защитных веществ, носят название фитоалексинов. Их образование — важнейшая стадия реакции сверхчувствительности. Фитоалексины никогда не присутствуют в здоровом растении, и их синтез начинается только в ответ на инфекцию. Тот или иной фитоалексин может защищать растение от самых разных паразитов, и если его концентрация высока, он губит всех «непрошенных гостей».
|
|
|
Фитоалексины образуются в тех клетках, в которые проникли паразиты. Эти клетки гибнут, а само растение остается в живых. Фитоалексины действуют не в одиночку, их образование сопровождается изменением всего обмена веществ в растительной клетке.
Однако несмотря на такую защиту, растения все же болеют. Объясняется это тем, что не всякий микроорганизм, пробравшийся в растительные клетки, образует нужные раздражители.
| 40 Культура растительных клеток как источник получения вторичных метаболитов. Растения являются незаменимым источником получения очень многих практически важных веществ. Вторичный метаболизм культивируемых клеток привлекает всё больше внимания исследователей, это обусловлено, прежде всего перспективностью промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений специализированного обмена растений. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с возрастающей остротой экологических проблем. В медицине 25% всех применяемых лекарств содержат соединения растительного происхождения. Если приплюсовать к этому потребности пищевой промышленности, парфюмерии, сельского хозяйства, то становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения в достаточном количестве. Наиболее серьёзной из них является разработка стратегии контроля синтеза вторичных соединений в культивируемых клетках растений. Культуры растительных клеток могут синтезировать самые разнообразные по химической природе вещества. Среди них эфирные масла, фенольные соединения, алкалоиды, стероиды, терпеноиды и др. Но несмотря на то, что биомасса культивируемых клеток с начала 80-х годов используется в качестве источника экономически важных продуктов, ряд трудностей и нерешенных вопросов сдерживает широкомасштабное применение культивируемых клеток, обусловливает нерентабельность биотехнологических производств многих ценных видов растений. Содержание практически важных вторичных метаболитов в высших растениях определяется активностью их синтеза, эффективностью транспорта и депонирования в органах запаса растения. Все эти признаки определяются генетически, находятся под контролем развития организма и максимально реализуются в оптимальных внешних условиях. В самом общем смысле культура клеток и тканей – это искусственное in vitro индуцирование делений клеток или выращивание в пересадочной культуре тканей, возникших путём пролиферации клеток изолированных сегментов разных частей растения. В культуре тканей лекарственных растений можно выделить три главных направления: получение недифференцированной каллусной массы, создание источников генетического разнообразия форм растений, а так же клеточную селекцию и клональное микроразмножение растений. В природе каллусообразование – естественная реакция на повреждение растений. В культуре изолированных тканей при помещении экспланта (т. е. фрагмента ткани или органа) на питательную среду его клетки дедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную массу – каллус. Культуру каллусной ткани можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя её на трансплантаты и пересаживая её на свежую среду. Каллусные клетки в культуре in vitro подвержены значительной генетической изменчивости. Изменчивость геномов может приводить к генетическим изменениям у растений-регенерантов, полученных из культуры каллусных клеток, клеточных суспензий или изолированных протопластов. Такие растения получили названия сомаклональных вариантов. Сомаклональные варианты, сохраняя основные свойства прототипа, часто выгодно отличаются от него устойчивостью к болезням, экологическим стрессам, а иногда несколько изменённой биосинтетической способностью и более высокой продуктивностью. Неотселектированные недифференцированные клетки накапливают, как правило, незначительное, по сравнению с интактным растением, количество веществ специализированного обмена. Чаще всего в клеточных культурах при длительном культивировании снижается или совсем теряется способность клеток накапливать соединения вторичного метаболизма из-за возникновения малоактивных, но более жизнеспособных вариантов. Снижение биосинтетического потенциала в культуре in vitro происходит из-за подавления дифференциации клеток и их специализации, т.е. в результате потери способности к реализации генетической информации, относящейся ко вторичному обмену | ||||
| . |
|
|
|
|
|
|
41 Регуляция синтеза вторичных метаблитов к культуре клеток.
В организме растения синтез метаболитов, их транспорт и отложение в запас находятся под строгим контролем развития. Часто эти события не только разведены во времени, но и происходят в разных органах растения. Клетка вне организма обычно не транспортирует метаболиты в соседние клетки или в питательную среду, хотя в ряде случаев это явление наблюдается (биосинтез алкалоидов в клеточных культурах мака). На выход вторичных продуктов в культурах растительных клеток влияют многие факторы, однако все способы регуляции вторичного метаболизма в культуре in vitro можно разделить на две группы: физиологическая и генетическая регуляции синтеза вторичных метаболитов. Подбор физических и химических условий культивирования является наиболее простым и часто применяемым подходом для повышения продуктивности. В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния факторов культивирования на рост и метаболизм клеток. Большое внимание уделяется таким факторам культивирования, как регуляторы роста, минеральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура, а также иммобилизация клеток и обработка элиситорами. Во многих случаях эти работы привели к успеху, однако они выполняются эмпирически и поэтому длительны и трудоемки. К тому же следует оговориться, что несмотря на эффективность повышения уровня биосинтеза физиологическими методами, добиться количественно значимых изменений в дедифференцированных клеточных культурах, сопоставимых с уровнем в интактном растении, лишь за некоторым исключением, не удается. Вещества, которые побуждают защитные ответы у растений, называются элиситорами. Растению как бы делают прививку против болезней, в результате повышается его устойчивость.) Более эффективной в этом плане является генетическая регуляция синтеза вторичного метаболизма в системе in vitro. С использованием экспериментального мутагенеза стало возможным получение довольно продуктивных штаммов. Ряд перспективных культур был получен в результате генетической трансформации и других генно-инженерных манипуляций. Особенно следует отметить трансформанты, полученные с помощью плазмид агробактерий продуктивность которых оказалась достаточно высокой. Поскольку одной из основных причин снижения уровня биосинтеза в культурах in vitro является дедифференциация ткани, то один из путей повышения синтеза вторичных соединений в клеточных культурах связан с дифференцировкой ткани и органогенезом. Известно, что физиологическое действие условий in vitro приводит к генетической гетерогенности системы. Речь идет о так называемой сомаклональной изменчивости, которая возникает при длительном культивировании. На генетической изменчивости клеток в культуре in vitro основана селекция штаммов, обеспечивающая большой выход ценных продуктов вторичного метаболизма растительных клеток. При клонировании суспензионной культуры клеток паслена были выделены линии, накапливающие больше 3 % соланидина, получен штамм клеток руты душистой, содержащей в 20 раз больше алкалоида рутакридона по сравнению с растением.
42.Влияние генетических, физических и химических факторов на рост и развитие культуры клеток и тканей, на синтез вторичных метаболитов.
На культивирование клеток оказывают влияние многие факторы, такие как:
1.генетика экспланта (выбор вида растения, выбор конкретного растения донора)
2.эпигенетика экспланта (выбор органа растения)
3.генетика популяции клеток (культивирование (селекция) культуры, получение мутантов)
4.физиология популяции клеток (оптимизация условий (химических и физических факторов) роста и синтеза вторичных соединений)
А) Химические факторы.
Углеводное питание. Как показано в многочисленных работах, культуры могут расти на различных углеводах (испытано более 30 различных соединений). Как правило, лучший рост отмечается на двух сахарах – глюкозе или сахарозе. В то же время высокий уровень синтеза свойственен культурам на сахарозе. На средах с глюкозой синтез часто сильно ослаблен. Причины этого явления не ясны.
Минеральное питание. Минеральный состав сред оказывает большое влияние на синтез вторичных соединений, при этом наиболее важно содержание фосфора, калия и различных форм азота. Высокие концентрации фосфора в большинстве случаев приводят к улучшению роста культуры и ухудшению синтеза вторичных метаболитов. Их синтез начинается обычно после исчерпания фосфора из среды. Высокие концентрации фосфора в среде снижают синтез никотина в культуре клеток табака, антоцианов в культивируемых клетках моркови, фенолов в клетках чая. В то же время имеются сообщения о повышении содержания вторичных соединений при повышенных концентрациях фосфора – алкалоидов в клетках барвинка розового, антрахинонов в культуре клеток Galium.
Показано, что как для роста, так и для синтеза вторичных соединений необходимы минеральные формы азота. Органические формы – пептон, дрожжевой экстракт и другие – тормозят и рост, и синтез. Очень важно соотношение аммонийного и нитратного азота. Можно проследить определенную тенденцию – повышение доли нитратного азота способствует увеличению синтеза вторичных веществ, в частности, диосгенина в культуре клеток диоскореи.
Фитогормоны. Эти компоненты среды привлекают наибольшее внимание исследователей. Однако влияние гормонов на синтез вторичных соединений в культуре клеток неоднозначно и может изменяться в зависимости от класса вторичных соединений, физиологического состояния культуры, условий культивирования и др. Наиболее интенсивно изучались ауксины и цитокинины, так как они, как правило, являются необходимыми компонентами сред. Имеется большое число примеров, когда ауксины стимулировали синтез вторичных соединений, и примерно столько же, когда подавляли. Ауксины стимулировали синтез антоцианов в культурах моркови и тополя, антрахинонов в Cassia fistula, Cassia torra, сапогенинов в тригонелле; уменьшали и исключали синтез антрахинонов и шиконина в воробейнике, скополамина - в белене, хлорогеновой кислоты – в табаке.
Результатов по влиянию цитокининов на синтез вторичных соединений существенно меньше, что не позволяет уловить какие-либо закономерности. Результаты по другим классам других фитогормонов весьма фрагментарны и противоречивы.
РН среды. По влиянию рН среды на синтез вторичных соединений данных очень немного. Однако, по имеющимся сведениям, рН среды существенно влияет на этот процесс. Например, при изучении синтеза индола в культуре клеток ипомеи в условиях рН-стата оказалось, что при рН 6,3 синтез индола максимален и в два раза превышает уровень синтеза без рН-статирования. В рН-стате при уровне рН 4,8 синтез полностью прекращается.
Б) Физические факторы.
Аэрация. Очень важный фактор, но практических данных немного. Важно как значение расхода кислорода, так и соотношение СО2/О2. Высокое отношение О2/СО2 может ингибировать и рост и синтез вторичных продуктов.
Температура. Влияние температуры на синтез вторичных метаболитов изучалось лишь в нескольких работах. Показано, например, что оптимум синтеза никотина в клетках табака находится при 270, уклонение на 50 в любую сторону приводит к снижению синтеза более чем в 3 раза.
Свет. Этому фактору посвящено наибольшее число работ. При этом разбирается как полная индукция синтезов, так и влияние на количество соединений света разной интенсивности и качества.
Свет увеличивает содержание эпикатехинов и протоантоцианидов в культуре клеток чая, серпентина в барвинке, витамина В6 и суммы алкалоидов в дурмане и руте. Красный цвет увеличивает синтез подофиллотоксина в культивируемых клетках подофилла.
Достаточно часто освещение изменяет соотношение разных классов вторичных соединений. Например, в культуре клеток Tabernaemontana divaricata под действием света существенно изменялись соотношения аспидосперматановых, коринантиновых, плюмерановых и ибогановых алкалоидов.
В то же время часто свет выключает или снижает синтез вторичных соединений. Синтез гиосциамина и скополамина в культуре клеток дурмана происходит только в темноте, освещение снижает содержание алкалоидов в клетках культуры хинного дерева, шиконина – в культуре клеток воробейника. В последнем случае показано, что свет разрушает ФМН, необходимый для синтеза шиконина.
В) Генетические факторы.
Культуры клеток растений характеризуются большой степенью генетической гетерогенности клеток в популяции. При этом гетерогенность наблюдается на разных уровнях организации генома – на уровне точковых мутаций, хромосомных перестроек, наборов хромосом и, наконец, цитоплазматических генов. В качестве основных причин гетерогенности выдвигаются:
А) гетерогенность исходных эксплантов
Б) мутационный эффект компонентов среды культивирования
В) эффект отсутствия организменного контроля («сита мейоза» и др.)
Эта гетерогенность клеточной популяции позволяет с помощью клонирования отбирать линии клеток с сильно изменёнными свойствами, в частности с повышенным синтезом вторичных метаболитов. Таким образом были отобраны штаммы – продуценты шиконина, аймалицина, серпентина, берберина. Однако судьба отобранных клонов при длительном культивировании различна: в одних случаях синтез вторичных метаболитов в клонах нестабилен и возвращается на уровень исходной культуры, в других случаях клон достаточно стабилен. Причины такого различия в поведении не ясны. Наконец, максимальные изменения генома культивируемых клеток могут быть получены в результате индуцированного мутагенеза. В полученных мутантных штаммах возможны резкие качественные и количественные изменения синтезов вторичных соединений.
Дата добавления: 2018-02-15; просмотров: 595; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!